Полиморфизм генов дисфункции эндотелия и скорость прогрессирования фиброза печени при хроническом гепатите С

Естественное течение хронического гепатита С (ХГС) - скорость прогрессирования фиброза печени (ФП), развитие осложнений и системных проявлений - индивидуально и варьирует в широких пределах. Такие факторы организма-хозяина, как употребление алкоголя, ожирение, нарушение обмена железа, метаболический синдром, мужской пол, раса (не европейская), возраст старше 40 лет к моменту инфицирования, иммуносупрессия, а также сочетанная инфекция, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) или вирусом гепатита В (HBV), определяют более агрессивное течение заболевания [1-7]. Однако до сих пор нет однозначных клинических маркеров или тестов, обладающих высокой прогностической ценностью для конкретного больного [5]. В настоящее время внимание исследователей в большей степени привлечено к факторам риска развития фиброза при ХГС, чем к фенотипам болезни (клинической характеристике, лабораторным показателям, особенностям течения, прогнозу). Особый интерес представляет поиск генетических факторов прогноза быстрого прогрессирования ФП при ХГС, включая точечные мутации полиморфных генов-кандидатов, при наличии которых прежде всего необходимо своевременное активное и упорное лечение. Достигнуты успехи при изучении генетических факторов прогноза ответа на лечение. Так, показано, что анализ полиморфизма генов интерлейкина-28В и белка IR10 позволяет прогнозировать, какой группе больных ХГС показана стандартная терапия с высокой степенью эффективности, а какие больные являются кандидатами на терапию с включением препаратов прямого противовирусного действия, позволяющих повысить вероятность успеха лечения до 60-80% при 1-м генотипе вируса гепатита С (HCV) [8-15]. В случае многофакторного заболевания, которым является ХГС, прогностическая ценность выявления отдельного полиморфного локуса относительна, поэтому требуется комплексный анализ комбинированного воздействия генетических факторов на течение заболевания [16]. До настоящего времени таких работ опубликовано крайне мало, результаты их нередко противоречивы.

Проведенные в последние годы исследования показали, что ФП индуцируется некрозом и апоптозом гепатоцитов, персистирующим воспалением, окислительным стрессом в ткани печени, а также «общими» механизмами фиброгенеза и ремоделирования ткани - дисфункцией эндотелия (ДЭ) и активацией тканевой ренин-ангиотензиновой системы [17-27].

Показано, что при циррозе печени (ЦП) у экспериментальных животных возникает ДЭ внутрипеченочного микроциркуляторного русла, включая снижение продукции и биодоступности оксида азота NO, а также увеличение окислительного стресса в печени [28, 29]. Отмечено, что в цирротической печени активность эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) снижена, при этом уменьшается содержание функционально активной (фосфорилированной) формы фермента [28, 30, 31]. Снижение уровня NO и повышение содержания вазоконстрикторов, а также увеличение продукции реактивных форм кислорода (РФК) показано и у больных ХГС [32-34].

Одним из потенциальных источников окислительного стресса в поврежденной печени являются NADPH-оксидазы - клеточные мембранно-связанные мультимолекулярные ферментные комплексы, локализующиеся на плазматической мембране и в некоторых органеллах и состоящие из нескольких мембранно-связанных и цитозольных ферментов [22]. С уменьшением активности NADPH-оксидаз снижается уровень генерации РФК [35] и возрастает устойчивость к развитию ФП [21]. Практически все NADPH-оксидазы содержат субъединицу p22-phox, которую кодирует ген CYBA, состоящий из 7-kb геномного сегмента длинного плеча хромосомы 16q24. Полиморфизм C242T гена CYBA, локализованный в 4-м экзоне, ведет к замене гистидина тирозином в позиции 72 белкового продукта - потенциальном гемсвязывающем центре, изменению оксидазной активности NADH-оксидазы и продукции РФК [36].

Многие вазоактивные вещества, которые локально продуцируются в поврежденной печени, влияют на развитие в ней фиброза [18, 21, 25, 34]. При выраженном ФП влияние вазоконстрикторов преобладает по сравнению с вазодилататорами (развивается ДЭ), что способствует депонированию коллагена [37]. Оксид азота (наиболее значимый вазодилататор) продуцируется всеми непаренхиматозными клетками и ингибирует ФП in vitro и in vivo, обеспечивает защиту как от перекисного окисления липидов, так и накопления коллагена. Распространенный ФП ассоциируется с ДЭ и снижением продукции NO [26, 28, 34]. Ген эндотелиальной NO-синтазы (NOS3) локализован в хромосоме 7q35-36, и его полиморфизм G894T приводит к замене глутамата аспартатом в молекуле фермента (Glu298Asp) и, вероятно, конформационным изменениям в кодируемом белке. Показано снижение каталитической активности eNOS у носителей мутантной аллели Т (Asp298, генотипы ТТ и GT) и повышение у них по сравнению с гомозиготами по аллелю G прессорного ответа на введение фенилэпинефрина и низкими концентрациями в плазме NO, что может свидетельствовать о влиянии этого полиморфизма на развитие ДЭ [33, 38, 39].

Одним из факторов, способствующих развитию ДЭ, является гипергомоцистеинемия (ГГЦ) [16, 40]. Избыток гомоцистеина (ГЦ) приводит к повреждению эндотелия, инициирует перекисное окисление липидов, вследствие чего снижается экспрессия eNOS и синтез NO. Кроме того, ГГЦ нарушает внутриклеточный метаболизм липидов, что ведет к развитию стеатоза печени [41, 42]. Показана возможность возникновения ГГЦ и связанных с ней патологических состояний в результате нарушения функции ферментов, участвующих в фолатном обмене, в том числе ключевого фермента фолатного цикла 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR). Замена нуклеотида цитозина тимином в положении 677 гена MTHFR (полиморфизм С677Т) приводит к замене аминокислотного остатка аланина остатком валина в сайте связывания фермента с его кофактором, и диссоциация фермента с кофактором происходит слишком быстро для осуществления полноценной каталитической функции [43]. У лиц, гомозиготных по данной мутации (генотип 677ТТ), отмечаются термолабильность и снижение активности фермента примерно до 70% от среднего значения, у гетерозигот - до 35%. Наличие генотипа ТТ ведет к повышению уровня ГЦ примерно в 2 раза по сравнению с таковым у носителей генотипа CC [38, 44, 45].

Информативность исследований по изучению ассоциаций однонуклеотидных замен в полиморфных генах при многофакторных заболеваниях, которым является ХГС, повышается при проведении в многочисленных группах с изучением нескольких генов, ответственных за какое-либо одно важное звено патогенеза.

Цель настоящего исследования - оценить взаимосвязь полиморфизма генов CYBA, NOS3 и MTHFR и скорости прогрессирования фиброза при ХГС.

Работа основана на материалах комплексного клинико-лабораторного обследования 109 больных ХГС и ЦП в его исходе, наблюдавшихся в гепатологическом отделении Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им. Е.М. Тареева Первого МГМУ им. И.М. Сеченова в период с января 2002 по январь 2012 г., представителей европеоидной расы. Критериями включения были наличие маркеров HCV, подписанное информированное согласие на участие в исследовании, установленные стадия фиброза и длительность заболевания. Критерием исключения было наличие дополнительных факторов поражения печени (злоупотребление алкоголем, сочетанная инфекция, вызванная HBV, вирусом гепатита дельта и ВИЧ, болезнь Вильсона-Коновалова, аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, наследственный гемохроматоз). В качестве группы сравнения (для определения частоты полиморфизма изучаемых генов в популяции) в исследовании участвовали 299 здоровых доноров крови, мужчин и женщин европеоидной расы.

Диагноз основывался на данных вирусологического, клинико-лабораторного, инструментального (ультразвуковое исследование, рентгеновская компьютерная или магнитно-резонансная томография органов брюшной полости) и иммунологического исследований. Для определения стадии ФП выполняли гистологическое исследование препаратов ткани печени, полученных при чрескожной биопсии по методике Менгини (89 больных), при этом оценивали индекс гистологической активности по R. Knodell и соавт. [46] и стадию фиброза по шкале METAVIR; у 8 больных выполняли эластометрию печени с помощью аппарата Фиброскан («Echosens», Франция); в 2 случаях данные эластометрии были подтверждены результатами фиброактитеста («BioPredictive», Франция). Еще у 12 больных с клинико-лабораторными и инструментальными признаками ЦП (спленомегалия, волнистость контуров печени, расширение вен портальной системы) биопсию не проводили, стадия фиброза у них расценена как F4 (ЦП). Темп прогрессирования фиброза рассчитывали по формуле, предложенной Т. Poynard и соавт. [6], для оценки темпа прогрессирования фиброза по единственной биопсии печени:

Скорость прогрессирования фиброза [ед. фиброза/г]=F/T, где F - стадия ФП по шкале METAVIR (ед.фиброза); T - длительность заболевания (годы).

Длительность заболевания определяли как период от желтушной формы острого вирусного гепатита С или наиболее раннего из равнозначных факторов риска (первая внутривенная инъекция наркотика, первая трансфузия цельной крови или ее компонентов, полостная операция) до определения стадии ФП. При указании в анамнезе на наличие у больного нескольких факторов риска инфицирования отсчет вели от воздействия, которое предполагает максимальный объем инфицирующего материала.

Геномную ДНК выделяли из цельной венозной крови с помощью коммерческих наборов ДНК-сорб-Б производства ЦНИИЭ.

Полиморфизм генов MTHFR, CYBA и NOS3 определяли методом оценки длины рестриктных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции на термоциклере Master Cycler Gradient («Eppendorf», Германия) с помощью описанной в литературе структуры праймеров и соответствующих эндонуклеаз. Визуализацию результатов осуществляли путем электрофореза в 2% агарозном геле с бромистым этидием при 150 В и 290 мА. Размер фрагментов определяли с помощью стандарта размеров длин фрагментов ДНК фирмы «Life Technologies».

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов прикладных статистических программ Statistica 10.0 («StatSoft Inc.», США) и Microsoft Office Excel 2007. Количественные значения с нормальным распределением представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего (M±m), для их анализа использовали двухвыборочный t-критерий Стьюдента. Анализ качественных признаков проводили с помощью двустороннего точного критерия Фишера, в таблицах сопряженности 2×3 применяли критерий &khgr;² Пирсона. Кроме того, использовали отношение шансов (OШ) и их 95% доверительный интервал (ДИ) [47]. Достоверными считали различия при p<0,05; 0,05≤p≤0,10 рассматривали как тенденцию к различию.

Среди обследованных больных было 30 (27,5%) мужчин и 79 (72,5%) женщин в возрасте от 18 лет до 81 года (49,9±1,3 года), из которых у 59 (54,1%) диагностирован ХГС на различных стадиях фиброза: у 37 (33,9%) пациентов выявлена стадия фиброза F1 по METAVIR, у 15 (13,8%) - F2, у 7 (6,4%) - F3, еще у 50 (45,9%) - ЦП в его исходе (F4). Высокая доля пациентов с F3- и F4-стадиями фиброза, а также отсутствие больных со стадией фиброза F0 объясняются особенностями рассматриваемой выборки - пациенты с клинически выраженным течением заболевания, нуждавшиеся стационарном лечении в гепатологическом отделении, а также целенаправленным отбором больных с ЦП для получения сопоставимых по численности групп. Преобладание женщин обусловлено жесткими критериями исключения (мужчины чаще не включались в исследование из-за злоупотребления алкоголем или наличия сочетанной инфекции ВИЧ или HBV или вируса гепатита дельта). Инфицирование, как правило, происходило в молодом возрасте - от 1 года до 54 лет (в среднем 25,8±1,2 года), предполагаемая длительность заболевания составила в среднем 20,5±1,0 года. В 55 (50,5%) случаях расчетная скорость прогрессирования фиброза составила 0,130 ед. фиброза/год и выше (в среднем 0,284±0,039 ед. фиброза/год); эти больные составили группу с быстро прогрессирующим фиброзом. У 54 (49,5%) больных темп прогрессирования не достигал 0,130 ед. фиброза/год (в среднем 0,072±0,004 ед. фиброза/год); эти больные отнесены в группу с «медленным» фиброзом (см. таблицу).

У больных ХГС с быстрым прогрессированием фиброза достоверно чаще встречался мутантный генотип ТТ гена CYBA (p=0,0256; см. рисунок) по сравнению с группой с медленно прогрессирующим фиброзом.

Распределение генотипов гена CYBA у больных с «медленным» фиброзом значимо (p=0,0332) отличалось и от группы сравнения: в группе с «медленным фиброзом» реже встречался генотип ТТ; статистическая значимость различий также повышалась при объединении носителей генотипов СС и СТ в одну подгруппу (р=0,0091). Мы не выявили статистически значимых различий в распределении аллелей и генотипов генов NOS3 и MTHFR между группами больных ХГС с медленно и быстро прогрессирующим фиброзом. Различия вариантных маркеров по локусам G894T NOS3 и C677T MTHFR между каждой из групп больных и группой сравнения также статистически не значимы.

Ключевую роль в развитии синусоидальной ДЭ отводят внутрипеченочному окислительному стрессу, при котором гиперпродукция РФК ассоциируется со снижением образования и биодоступности NO [30]. Эта связь реализована через фермент NADPH-оксидазу, состоящую из нескольких субъединиц. Субъединица p22-phox, кодируемая геном CYBA, необходима для ферментативной активности NADPH-оксидазы, а генетически обусловленное изменение активности или экспрессии этого белка может влиять на течение многих заболеваний, связанных с окислительным стрессом. В доступной нам литературе мы не встретили работ, посвященных роли полиморфизма C242T гена CYBA на течение и прогноз хронических заболеваний печени. Функциональное и клиническое значение полиморфизма C242T гена CYBA при различных заболеваниях противоречиво. В работе T. Guzik и соавт. [48] показано снижение базальной и стимулированной активности фермента у больных атеросклерозом с носительством аллеля 242T. С этими данными согласовывались исследования, показавшие протективную роль аллеля Т в отношении развития инфаркта миокарда и кардиоэмболического инсульта (независимо от других факторов риска развития атеросклероза) [49, 50]. Напротив, в крупном проспективном исследовании LCAS выявлена строгая ассоциация носительства аллеля Т с прогрессированием ишемической болезни сердца и сужением диаметра коронарных артерий [51]. M. Perianayagam и соавт. [52] обнаружили, что у носителей аллеля Т имелась выраженная тенденция к более длительной госпитализации, большей частоте диализа и внутрибольничной смерти по сравнению с носителями генотипа CC. A. Hodgkinson и соавт. [53] обнаружили неблагоприятное влияние носительства аллели 242T на развитие диабетической нефропатии у больных сахарным диабетом 1-го типа, в то время как S. Matsunaga-Irie и соавт. [54] показали, что у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа носительство аллеля 242Т снижало риск развития диабетической нефропатии. Метаанализ 6 работ, посвященных связи этого полиморфизма с развитием ишемических сосудисто-мозговых заболеваний, выявил повышение риска развития ишемического инсульта в бассейне крупных мозговых артерий у носителей генотипа 242TT [55]. Наконец, в работе M. Moreno и соавт. [56] у носителей аллеля Т и генотипа СС с нормальным артериальным давлением активность NADPH-оксидазы не различалась. В нашей работе распределение генотипа СС и аллеля Т среди больных с хронической HCV-инфекцией и в группе сравнения соответствуют данным, полученным для европейской популяции, а распределение генотипов согласуется с законом Харди-Вайнберга [48, 51].

Механизм, лежащий в основе выявленной ассоциации носительства генотипа ТТ с быстрым прогрессированием фиброза у больных ХГС, неясен и может объясняться влиянием на апоптоз или экспрессию генов под влиянием РФК либо сцеплением данного полиморфизма с еще не выявленным фактором. Однако маловероятно, что снижение ферментативной активности NADPH-оксидазы ускоряло развитие ФП. Как бы то ни было, генотип ТТ гена CYBA по локусу C242T можно считать маркером неблагоприятного течения ХГС.

Синусоидальная ДЭ характеризуется снижением биодоступности NO в паренхиме печени. На животных моделях при индуцированном ФП по сравнению с контрольной группой отмечали снижение активности eNOS и повышение связывания фермента с кавеолином [57]. Носительство аллеля 894Т гена NOS3 ассоциировано с нарушением работы фермента и, как следствие, со снижением концентрации NO в плазме, а также коррелирует с более частым развитием коронароспазма и инфаркта миокарда [58]. Отмечены значительные различия по частоте мутантного генотипа 894ТТ (298Asp/Asp) в различных этнических группах: для популяций Азии по сравнению с европейцами характерна более низкая частота гомозигот ТТ (0,48% против 10,73%) [59]. В исследовании Y. Cheng и соавт. [60] частота аллеля 894Т и генотипа GT была намного выше в группе больных ЦП с портальной гипертензией в исходе хронического гепатита В по сравнению с контрольной группой. Авторы сделали вывод о наличии связи полиморфизма G894T с развитием портальной гипертензии [60]. В недавно опубликованной работе чешских авторов распределение генотипов функционально значимых вариантов eNOS (E298D, 4a/b, T786C) у пациентов с ЦП не отличалось от таковых в контрольной группе [61]. Греческие исследователи обнаружили, что носительство аллеля Т полиморфизма G894T гена NOS3 значимо чаще встречалось в группе больных первичным билиарным циррозом, чем в контрольной группе здоровых доноров [62].

Мы не встретили в доступной нам литературе работ по исследованию ассоциаций данного полиморфизма с течением и прогнозом ХГС. По результатам нашего исследования, частота генотипа ТТ составила 7,3% в группе больных с «быстрым» фиброзом и 13% в группе с медленно прогрессирующим течением, в группе сравнения - 8,7%, что характерно для европейской популяции. Распределение аллелей и генотипов статистически значимо не различалось ни в группах больных ХГС с быстрым и медленным прогрессированием фиброза, ни по сравнению с группой здоровых доноров. Эти данные свидетельствуют об отсутствии прямой связи полиморфизма G894T гена NOS3 со скоростью развития фиброза у больных ХГС в российской популяции. Изменения же уровня NO в печени могут объясняться посттранскрипционными механизмами регуляции его синтеза.

Избыток ГЦ вызывает оксидативное повреждение эндотелия и способствует развитию ДЭ. Метилентетрагидрофолатредуктаза - один из ключевых ферментов метаболизма ГЦ. Полиморфизм С677Т гена MTHFR опосредует образование менее активного варианта фермента и недостаточной утилизации ГЦ из кровотока. В работе L. Adinolfi и соавт. [41] показано, что у больных ХГС уровень ГГЦ и полиморфизм C677T гена MTHFR ассоциируются с высокой частотой и выраженностью стеатоза и ФП (риск развития F3-F4 стадий фиброза был в 6 раз выше у носителей генотипа CT и в 20 раз выше у носителей генотипа TT). В более позднем исследовании итальянских авторов, проведенном в небольшой группе пациентов с рецидивом ХГС после перенесенной трансплантации печени, носительство генотипа ТТ гена MTHFR в сочетании с возрастом донора печеночного трансплантата старше 45 лет ассоциировалось с более высоким риском быстрого прогрессирования фиброза, но не с развитием стеатоза донорской печени [63]. В нашем исследовании распределение аллелей и генотипов полиморфизма C677T гена MTHFR в группах больных ХГС с быстрым и медленным прогрессированием ФП не различались ни между собой, ни с группой сравнения (частота аллеля 677Т составила 27,3, 25% и 27,5% соответственно). При этом распределение генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Эти данные расходятся с результатами исследований [41, 63], но согласуются с наблюдениями испанских авторов [64], по мнению которых, стеатоз печени, развившийся у большинства больных ХГС (и у 100% инфицированных HCV 3-го генотипа), ассоциировался с ГГЦ, но не с полиморфизмом C677T гена MTHFR, а распределение генотипов у больных ХГС по локусу C677T не отличалось от такового в контрольной группе.

Выполненные в последние 10 лет исследования показали, что в прогрессировании ХГС, помимо хронического воспаления, играют роль ДЭ и окислительный стресс. Полученные результаты позволяют рассматривать генотип ТТ гена CYBA по локусу C242T как профиброгенный и считать его одним из маркеров неблагоприятного течения ХГС.