Анализ комбинаций генотипов в полиморфных точках промоторных участков генов трех матричных металлопротеиназ (ММР) и гена фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) у пациентов, перенесших острый инфаркт миокарда

Разрыв атеросклеротических бляшек (АСБ) - наиболее частая причина острого инфаркта миокарда (ОИМ) у мужчин трудоспособного возраста. У больных с острым коронарным синдромом (ОКС) показано наличие в АСБ участков, богатых макрофагами, способными разрушать межклеточное вещество (МКВ) за счет фагоцитоза и секреции протеолитических ферментов, таких как металлопротеиназы - ММР (коллагеназы, желатиназы, стромелизины), действие которых ослабляет фиброзную покрышку бляшки и способствует ее разрыву [1]. Одни из основных ММР, выявляемых в стенках сосудов, - желатиназы (MMP-2 и ММР-9), которые, облегчая проникновение через эндотелий и накопление моноцитов, способствуют активации тромбоцитов и каскаду коагуляции [2]. Показано повышение концентрации этих ММР в сыворотке у пациентов с ОКС и ишемией мозга [3]. ММР-3 (стромелизин) - еще одна ММР, уровень экспрессии которой в АСБ существен. ММР-3 обладает широкой субстратной специфичностью и может активизировать другие ферменты этого семейства [4].

В ряде работ описана ангиогенная функция ММР. Ангиогенез, ключевым фактором которого является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), - формирование новых кровеносных сосудов на основе существующей кровеносной сети - многоступенчатый процесс, играющий центральную роль как в эмбриогенезе, так и при различных патологических состояниях. При этом VEGF не только ангиогенный фактор, но и важный фактор деградации МКВ и последующей пролиферации, миграции и выживания эндотелиальных клеток. Механизм регуляции ангиогенеза, опосредованный VEGF, подробно описан во многих публикациях [5, 6]. Однако лишь в отдельных работах упоминается возможность индуцированной VEGF активации ММР. Компоненты МКВ, включая фибрин, коллаген и ламинин, формируют тонкий слой вокруг существующий сосудистой сети, который необходимо деградировать при формировании нового сосуда. VEGF посредством рецептора VEGFR-2 стимулирует экспрессию в эндотелиальных клетках ММР, включая MMP-2, MMP-9, и MT1-MMP [7, 8]. Активация ММР, индуцированная VEGF, происходит и при дефектном ангиогенезе [9-11]. Показано, что не только VEGF может стимулировать экспрессию ММР, но и индукция ММР регулирует уровень экспрессии VEGF [12].

Помимо опосредованного VEGF и MMP взаимного влияния на продукцию изначально экспрессия этих белков регулируется на транскрипционном уровне, в промоторных регионах генов. Выявлены следующие полиморфизмы: MMP2 –1306 С⇒Т, причем аллельный вариант *C ассоциирован с высокой промоторной активностью; ММР9 –1562 С⇒Т, где наличие минорного аллеля *Т в генотипе обеспечивает высокую транскрипционную активность гена; ММР3 –1171 обладает высокой транскрипционной активностью при носительстве генотипа 5А5А [13, 14]. По данным ряда исследований, полиморфизм промоторного региона гена VEGF в позиции –2578 A⇒C ассоциирован с уровнем экспрессии VEGF и со степенью коронарного атеросклероза, оцененным при ангиографии у пациентов без ОИМ в анамнезе. Аллель C связывают с высоким уровнем экспрессии VEGF, а генотип CC - с более умеренной степенью коронарного атеросклероза [15, 16]. Аллель T в позиции +936C⇒T нетранслируемого региона гена связывают с низким уровнем продукта [17].

Исходя из этого, мы проанализировали влияние комплексного полиморфизма регуляторных регионов генов VEGF в позициях –2578 и +963, промоторных регионов генов ММР2 (–1306), ММР9 (–1562), а также промоторный полиморфизм гена ММР3 (–1171) у пациентов с ОИМ в анамнезе и в группе здоровых мужчин аналогичного возраста и социально-профессионального статуса.

Обследовали 251 мужчину, перенесшего ОИМ в возрасте от 35 до 84 лет и находящегося на диспансерном учете в кардиологическом центре городской клинической больницы №9 Новокузнецка. Диагноз ОКС устанавливали по совокупности критериев, разработанных Европейским обществом кардиологов и Американской коллегией кардиологов (2000), включающих: а) типичный болевой приступ; б) изменения электрокардиограммы в 2 последовательных отведениях и более (высокоамплитудный зубец Т, отрицательный зубец Т, подъем сегмента ST, патологический зубец Q, депрессия сегмента ST, наличие зубца QR); в) динамические изменения уровня ферментов (креатинфосфокиназа, ее фракция МВ, тропонины Т и I). При дифференциальной диагностике между ИМ без подъема сегмента ST и нестабильной стенокардией ориентировались на уровень кардиоспецифических маркеров. В исследование включены все пациенты с подтвержденным диагнозом, подписавшие информированное согласие и указавшие в анкете национальность русский. Клиническое описание группы пациентов приведено в табл. 1.

Контрольную группу составили 95 практически здоровых лиц того же пола, этнически и географически соответствующих исследуемой группе пациентов. Кроме того, учитывая, что такие внешние факторы, как неблагоприятные условия труда, физическая нагрузка и вредные профессиональные факторы, представляют существенный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), контрольную группу набирали с учетом этих особенностей.

Генотипирование полиморфизмов С–2578A и C+936T VEGFA осуществляли методом рестриктазного анализа продуктов амплификации с использованием специфичных праймеров [18] и эндонуклеаз рестрикции Bgl II и Fae I («СибЭнзим», Новосибирск). Полиморфизм SNP промоторного региона гена ММР2 исследовался в позиции –1306 С⇒Т, гена ММР9 - в позиции –1562 С⇒Т. Участки промоторного региона генов амплифицировали с использованием пары специфичных праймеров [19], затем продукты амплификации подвергали гидролизу эндонуклеазой рестрикции BstXI для ММР-2 и SphI для ММР-9 («СибЭнзим», Новосибирск). Полиморфизм 5А6А гена ММР3 анализировали с использованием специфичных праймеров [20]. Электрофорез проводили в 2% агарозном геле.

При статистическом анализе полученных данных использовали распространенность генов, генотипов и их комбинаций, специфичность (Sp), отношение шансов (OШ) с расчетом 95% доверительного интервала (ДИ). OШ рассчитывали по методу Вульфа-Холдейна [21]. При OШ >1 специфичность рассчитывали как долю отрицательных результатов генетического теста в отсутствие заболевания, а при OШ <1 - как долю отрицательных результатов генетического теста при наличии заболевания [22, 23]. Распространенность отдельных генотипов и их комбинаций определяли как процентное отношение индивидов, несущих генотип (комбинацию генотипов), к общему числу обследованных в группе по формуле: f=n/N, где n - число повторов генотипа (комбинации), N - число обследованных. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга [24]. Достоверность различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по критерию &khgr;² с поправкой Йетса на непрерывность и двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц [25].

Исследовали полиморфизм 3 генов ММР: ММР2 (–1306), ММР3 (5A/6A), ММР9 (–1562) и полиморфизм гена VEGF в точках полиморфизма –2578 и +963 у пациентов с ИМ в анамнезе и в группе здоровых мужчин аналогичного возраста и социально-профессионального статуса. Частоты генотипов исследуемых генов в сопоставляемых группах находятся в равновесии Харди-Вайнберга. Показано, что аллельный вариант ММР3 5А и генотип ММР3 5А5А достоверно чаще встречается в группе пациентов, перенесших ИМ (95% ДИ 1,03<1,55<2,33; p=0,0414 и 1,23<2,76<6,21; p=0,0106 соответственно), тогда как частоты аллельных вариантов других анализируемых полиморфизмов между двумя группами не различаются (табл. 2).

В табл. 3 представлены отобранные из всего массива данных комбинированные генетические признаки, частота которых достоверно значимо различается между сравниваемыми группами и соответствует показателю ОШ в 95% ДИ.

При исследовании ассоциированности промоторных полиморфизмов 3 генов матричных металлопротеиназ и 2 позиций регуляторного региона гена VEGF мы выявили, что у пациентов с генотипом 5А5А ММР3 риск развития ОИМ достоверно выше, чем у пациентов, в геноме которых этот генотип отсутствует. Первоначально такие данные получены при обследовании пациентов с ИМ относительно здоровых в Японской популяции [26]. S. Beyzade и соавт. [4] сделали попытку объяснить эти результаты. Авторы показали, что генотип 5А5А+5А6А чаще встречается у пациентов с ССЗ и ОИМ, а это могло бы указывать на влияние данного полиморфизма на стабильность АСБ. Кроме того, авторы показали, что индивиды с генотипом 6А6А имели более выраженный коронарный атеросклероз, чем индивиды с другим генотипом. Это, по мнению авторов, свидетельствует о том, что нестабильность АСБ увеличена у пациентов с высокоактивным генотипом 5А5А ММР3. В случае гетерозиготного генотипа аллельный вариант 5А является «лидирующим» и повышающим продукцию белка [4].

Проанализированный нами сложный генотип из 5 полиморфных позиций позволил выявить 4 комплексных генотипа, достоверно ассоциированных с риском развития ИМ. Обращает внимание, что все гомозиготные генотипы в составе этих 4 комплексных генотипов обладают высокой транскрипционной активностью. Двухлокусный комплексный генотип ММР2СС/ММР35А5А содержит в составе высокоактивный генотип 5А5А совместно с высокоэкспрессирующим вариантом ММР2 СС. При наличии двух высокоэкспрессирующих ММР этого генотипа ОШ развития патологии максимальны среди выявленных протективных генотипов. Это свидетельствует о том, что у данных пациентов имеется высокий базовый уровень продукции этих ферментов. Причем достоверность различий между сопоставимыми группами для данного маркера превышает 95%. Второй двухлокусный генотип VEGF2578СА/VEGF-936СС, как и трехлокусный генотип VEGF2578СА/VEGF-936СС/MMP2-1306ТС, ассоциированные с ОКС, имеют в составе VEGF-936СС-генотип, связанный с высоким уровнем продукции VEGF. Можно предположить, что высокий уровень VEGF в очаге воспаления обладает свойством высокой индукции продукции ММР. Последний трехлокусный генотип VEGF2578 СА/VEGF-936 СС/MMP3 5А6А несет как ассоциированный с ИМ гетерозиготный генотип 5А6А, так и высокопродуцирющий генотип VEGF+936 СС. Таким образом, для генотипа пациентов, перенесших ИМ, характерно наличие генетических признаков, ассоциированных с высокими уровнями продукции как ММР, так VEGF, обладающих способностью к взаимной индукции их синтеза. Наличие такого комплекса генетических факторов может способствовать образованию «порочного круга» в МКВ и погруженного в него сосудистого сплетения, что может быть одним из факторов дестабилизации АСБ.

Что касается генотипов, негативно ассоциированных с ОИМ, то все они объединены наличием в своем составе низкоэкспрессирующего генотипа ММР3 6А6А. Уровень специфичности представленных резистентных к заболеванию маркеров выше 95%, а в четырехлокусном генотипе, в состав которого, помимо генотипа 6А6А, входит генотип VEGF-2578AA, отвечающий за низкий уровень экспрессии VEGF, специфичность генотипа достигает 100%. Таким образом, в геноме таких пациентов выявляется комплекс генетических факторов, способствующих более выраженной стабилизации АСБ.

Представленные данные, по нашему мнению, убедительно свидетельствуют о том, что использование комплексных генетических факторов, продукты которых принимают участие в патологическом процессе, с одной стороны, и являются регуляторами продукции в отношении друг друга, с другой, имеет бо`льшую информативность при выявлении протективных и резистентных маркеров развития заболевания, чем одиночные генетические маркеры, и могут быть использованы при скрининговых исследованиях. Выявление у пациента таких генетических признаков, ассоциированных с высоким уровнем продукции регуляторных факторов, способствующих дестабилизации АСБ, может служить одним из персонализированных признаков высокого риска развития ИМ у пациента с атеросклеротическим поражением коронарных сосудов.