С учетом сложившихся геополитических рисков и новых вызовов на первый план выходит вопрос отечественных решений и разработок в критически важных разделах судебной медицины. Военные конфликты и сопровождающие их многочисленные жертвы актуализируют потребность в судебно-медицинской экспертизе неопознанных трупов. Данная экспертная процедура является сложной, включает в себя последовательное определение ряда медико-биологических признаков (раса, пол, возраст и др.) [1].

Основные методы установления возраста преимущественно базируются на оценке дегенеративных изменений костно-хрящевого скелета посредством рентгенологических и гистоморфометрических исследований [2—4]. В настоящее время вопросы возрастной трансформации микроструктуры костной ткани хорошо изучены и используются в экспертной работе [1, 5, 6]. Однако, по мнению исследователей, при применении этих методов зачастую приходится сталкиваться с такими проблемами, как предвзятость, субъективность и низкая воспроизводимость [7].

В процессе старения минеральная плотность костной ткани меняется, вследствие чего широкое распространение получили методики установления возраста с помощью денситометрии [8—10]. Как известно, кость представляет собой гетерогенный материал, из общей массы которого приблизительно 60% приходится на неорганические вещества (до 70% в сухой кости), 25% — на органические компоненты, около 10% занимает вода [6]. Неорганическая часть костной ткани представлена «биологическим апатитом», минеральной фазой, которая близка к гидроксилапатиту [7]. Ряд научных работ посвящен непосредственному использованию минерализации костной ткани для оценки динамики возрастных изменений [11, 12]. Однако оценка возрастной динамики минерального состава костной ткани до сих пор не нашла практической реализации при производстве судебно-медицинских экспертиз неопознанных трупов. Возможно, это связано со сложностью и трудоемкостью пробоподготовки, отсутствием экономически доступного оборудования, сложностью интерпретации полученных результатов. В то же время исследователи отмечают, что минеральный состав зависит не только от возраста, но и от целого ряда факторов, таких как пол, нагрузки, патологические изменения, генетические особенности [9, 13]. Отмечены колебания минерального состава и в зависимости от топографии зоны исследования. Было установлено, что некоторые из перечисленных «мешающих» факторов в меньшей степени влияют на химический состав самого костного минерала, чем на общий состав костного вещества [14]. Это позволяет предположить, что на основе детальной оценки химического состава костного апатита можно построить модель возрастной изменчивости для решения обратной научно-практической задачи — определения возраста на момент смерти.

Объективная количественная оценка химического состава минеральной фазы кости может быть дана посредством неразрушающей методики — энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (ЭДС) на базе сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). Это один из самых распространенных методов химического элементного анализа, имеющийся в арсенале всех крупных медицинских центров, в том числе в России. Он широко используется в разнообразных технических и медико-биологических областях благодаря доступности, невысокой стоимости, низким требованиям к пробоподготовке. Однако для тонкой оценки химического состава апатита кости данные ЭДС не могут быть использованы напрямую. Это связано с отсутствием эталонов и высокой гетерогенностью костного вещества. В таких условиях, согласно метрологической классификации, возможное качество анализа находится между «качественным» и «полуколичественным» классами. Существенное уточнение данных ЭДС-анализа может быть достигнуто при использовании системы пересчета: с валового содержания химического элемента на катионное содержание в нормативном минерале.

Цель исследования — оценить возможность использования химического анализа минерального вещества костной ткани с помощью ЭДС для установления возраста при судебно-медицинской идентификации личности неопознанных трупов.

Материал и методы

Материалом для исследования служили фрагменты костной ткани (размер 1,5×1,5×0,1 см) от 85 трупов лиц мужского и женского полов в возрасте от 21 до 91 года, медиана возраста 56 [39; 74] лет. Забор производили в передней черепной ямке (спинка турецкого седла). Выбор участка исследования был обусловлен доступностью, структурной однородностью костной ткани, минимальным влиянием факторов внешней среды. Пробоподготовка включала в себя промывку образцов костной ткани в дистиллированной воде, механическую обработку корундовым абразивом с формированием шлифа размером 0,5×1,0 см, повторную промывку и высушивание.

Подготовленные образцы костной ткани, адгезированные на поверхности углеродной ленты, помещали в камеру СЭМ EVOLS 10 («Zeiss», Германия) с катодом LaB6. С помощью энергодисперсионного рентгеновского спектрометра Energy-dispersive X-ray spectrometer (EDS) Oxford X-Max 50 в режиме низкого вакуума (EP, 70 Pa) при ускоряющем напряжении 20 кВ и токе на образце 220 pA проводили полуколичественный химический микроанализ для оценки содержания химических элементов: C, N, O, Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca, Zn. Рабочая дистанция для измерений составляла 11,4 мм. Исследование осуществляли в режиме принудительного нормирования получаемых содержаний к 100%. Для трех участков поверхности шлифа (площадь 50×50 мкм) были получены данные о весовом содержании химических элементов, в том числе кальция, магния и натрия (C_Ca^вес, C_Mg^вес и C_Na^вес), используемые в дальнейших вычислениях.

После получения данных о весовом содержании кальция, магния и натрия была выполнена оценка статистического разброса каждого из исследуемых элементов (SD_Ca, SD_Mg и SD_Na). На следующем этапе произведен расчет нормативных содержаний катионов в апатите.

Расчеты проводили в формульных единицах (Ф.Е.) на нормативный гидроксил(хлор)апатит — доминирующую кристаллическую минеральную фазу костной ткани. Соотношение химических элементов в кристаллическом гидроксил(хлор)апатите соответствовало формуле:

Ca_10-a-bNa_aMg_b(PO₄)₆ (OH_1—c,Cl_c)_2,

где: a + b <10, c <1.

Сумма катионов составляла 10 Ф.Е. Исходя из этого, согласно стехиометрическому соотношению, было рассчитано долевое количество каждого катиона среди всех катионов гидроксил(хлор)апатита:

Ф.Е._Ca = C_Ca^вес/40/(C_Ca^вес/40 + C_Mg^вес/24,3 + C_Na^вес/23)∙10; (1)

Ф.Е._Mg = C_Mg^вес/24,3/(C_Ca^вес/40 + C_Mg^вес/24,3 + C_Na^вес/23)∙10; (2)

Ф.Е._Na = C_Na^вес/23/(C_Ca^вес/40 + C_Mg^вес/24,3 + C_Na^вес/23)∙10, (3)

где: C_Ca^вес — весовое содержание кальция по данным ЭДС с нормированием анализа к 100%; C_Mg^вес — весовое содержание магния по данным ЭДС с нормированием анализа к 100%; C_Na^вес — весовое содержание натрия по данным ЭДС с нормированием анализа к 100%.

Для статистических расчетов использовали программное обеспечение SOFA Statistics 1.5.4.

Результаты и обсуждение

В ходе проведенного полуколичественного химического микроанализа были сформированы базы данных числовых характеристик химического состава исследуемых образцов (см. рисунок).

Данные валового весового содержания кальция (а), магния (в) и натрия (д) в костном веществе по данным ЭДС-анализа, а также вычисленные катионные содержания кальция (б), магния (г) и натрия (е), выраженные в формульных единицах (Ф.Е.).

Можно отметить, что общее содержание всех трех элементов, связанных с минеральным наполнением кости, уменьшается с возрастом (см. рисунок, а, в, д). Это согласуется с известными данными о возрастной деминерализации костного вещества. Однако в самой минеральной фазе представленность этих элементов в качестве катионов изменяется с возрастом по другим законам.

На основе математического анализа полученных результатов была установлена вариабельность катионного соотношения костного апатита. Возрастная динамика по данным ЭДС характеризуется потерей Ca²⁺ и увеличением Mg²⁺ среди катионов костного минерала. Это подтверждает связь минерального состава апатита исследуемых образцов костной ткани с возрастом [12]. В ходе математического анализа расчетной доли катионов в нормативном гидроксилапатите установлено, что в костном минерале фиксируется статистически значимое снижение доли ионов Ca²⁺ (r= −0,33, p=0,008), выявляется статистически значимое увеличение ионов Mg²⁺ (r=0,43, p=0,0005) при неизменном содержании ионов Na⁺ (r=0,10, p=0,42) (см. рисунок, б, г, е). Следует отметить, что значимых различий в количестве катионов Mg²⁺ костной ткани между группами мужчин и женщин после достижения возраста гормональных изменений не выявлено. Этот важный в практическом отношении результат будет дополнительно изучен в ходе самостоятельного исследования на большей выборке.

Упрощенно можно принять то, что увеличение доли обогащенного магнием поверхностного слоя нанокристаллов апатита связано с размером кристаллов квадратичным законом. При этом сам объем кристаллов, являющихся вместилищем кальция, связан с размером кристаллов кубическим законом. Отсюда следует, что общее изменение содержания элементов не может быть описано линейной функцией. Наилучшим образом увеличение содержания магния и декальцинацию описывает функция, обратная квадратичной (см. рисунок, г, пунктирная кривая). Отметим, что в настоящем исследовании не была поставлена задача детально изучить математический закон, связывающий возраст и химический состав минерала. Наличие связи Ф.Е._Mg с возрастом не вызывает сомнений, однако параметры тренда могут быть существенно уточнены в дальнейшем, при наборе дополнительной информации за счет увеличения выборки. С учетом объема анализируемой выборки в данном предварительном исследовании была предложена приближенная формула, связывающая возраст и изменение химического состава:

(4)

где: fR — базовое отношение, связывающее возраст и изменение содержания кальция и магния; C_Ca — весовое содержание кальция по данным ЭДС с нормированием анализа к 100%; Ф.Е._Mg — формульное содержание магния; SD_Ca — среднеквадратичное отклонение оценки содержания кальция по данным анализа трех регионов кости.

В формуле среднеквадратичное отклонение содержания кальция использовали для компенсации «подлипания» магния к нулевым значениям при пониженном качестве анализа.

Исходя из базового отношения, биологический возраст может быть вычислен по следующей формуле:

возраст = 174 — 14·fR(5)

Средняя абсолютная ошибка вычисления возраста при использовании этой формулы в диапазоне реальных возрастов от 20 до 60 лет составила 12,3 года. При тестировании на независимой выборке вычисленный возраст указал на приемлемый возрастной диапазон в 24 из 30 случаев. Была выявлена высокая степень достоверности отнесения к группе «старше 60 лет» при использовании оценочного теста: если частное Ф.Е._Ca/Ф.Е._Mg <50, «донорский объект» старше 60 лет. По данным проведенного ROC-анализа (англ. receiver operating characteristic, рабочая характеристика приемника), чувствительность теста составила около 65%, а специфичность — 70%.

В судебной медицине имеется ряд публикаций, в которых для прогнозирования возраста на основании оценки уровня элементного состава костной ткани предлагают использовать метод безэталонной лазерной масс-спектрометрии с двойной фокусировкой излучения ЭМАЛ-2 [15, 16]. Однако широкого распространения он не получил по целому ряду причин. Это и технические трудности самой лабораторно-диагностической процедуры, и сложность предлагаемого расчета (дискриминантной функции) для определения возраста, и достаточно низкая точность конечного результата. В предлагаемом Т.Г. Крымовой [15] алгоритме определения возраста неопознанного трупа ответ возможен лишь на уровне определения одной из следующих возрастных групп: «старше 40 лет/моложе 40 лет или старше 57 лет/от 22 до 39 лет/от 39 до 57 лет». В работе В.В. Юрасова [16] предлагается определять принадлежность костной ткани мужчин к двум возрастным группам: младше/старше 50 лет с вероятностью 83%.

Возможно, это связано с тем, что в предлагаемых методиках учет и оценка формирующихся трендов, например декальцинации, выполняется на организменном уровне. Подобный подход не позволяет исключить влияние ряда индивидуализирующих факторов, таких как наличие сопутствующих заболеваний, травм, особенности гормонального статуса и т.д.

В настоящее время сформирована научная база, доказывающая, что базовым минеральным компонентом костной ткани является не аморфный фосфат кальция, а кальций-дефицитный гидроксил(хлор)апатит [17]. Ранее была подробно обоснована и доказана целесообразность оценки возрастного тренда на основании учета содержания химических элементов в нормативном минерале, а не всей совокупности костной ткани [14]. Именно такой подход был использован при создании судебно-медицинской методики диагностики возраста по химическому составу костной ткани посредством разработки уравнения, описывающего связь возраста и изменения содержания кальция и магния. Основой для применения модели расчета усредненного катионного соотношения минерального вещества костной ткани послужило стехиометрическое соотношение катионов в кристаллическом гидроксил(хлор)апатите.

В настоящем исследовании было установлено, что процесс старения сопровождается не только снижением уровня общего кальция, что согласуется с существующими представлениями о динамике химических процессов в костном минерале, но и повышением относительного количества магния в костном гидроксилапатите.

При увеличении скорости резорбции костной ткани, которое происходит при ее «старении», единицы кристалла апатита уменьшаются в размере. Ионы Mg²⁺ в основном аккумулируются в гидратированном поверхностном слое костных кристаллов гидроксил(хлор)апатита, а ионы Ca²⁺ находятся в его ядре, поэтому при уменьшении размера единичного кристалла количество кальция падает пропорционально кубу его радиуса (объем), а количество Mg²⁺ — в меньшей степени, пропорционально квадрату радиуса (площадь поверхности). Таким образом, доля катионов Mg²⁺ по отношению к Ca²⁺ в объеме единичного кристалла растет. При этом весовая доля общего Mg костного вещества, особенно при условии измерения относительно большого региона, может оставаться неизменной. Увеличение количества Mg²⁺ среди катионов костного вещества в пересчете на нормативный апатит по мере его «старения» является более контрастным показателем, чем простая декальцинация.

Заключение

В настоящее время ни один из методов судебно-медицинской идентификации личности в отдельности не позволяет решить все вопросы, возникающие при экспертизе неопознанных лиц, особенно если речь идет о фрагментированных, поврежденных, скелетированных трупах. До сегодняшнего дня остаются актуальными проблемы судебно-медицинского установления возраста в рамках подобных экспертиз. Явления гетерохронии, гетеротопии, гетерокинетичности, гетерокатефтенности, сопровождающие старение организма в целом, обосновывают не только целесообразность, но и необходимость комплексного подхода при оценке биологического возраста [18]. Включение ЭДС в алгоритм судебно-медицинского установления возраста неопознанного трупа будет способствовать реализации данной концепции.

Проведенное исследование доказывает возможность применения количественной оценки содержания химических элементов в нормативном минерале для установления возраста неопознанного трупа в условиях стандартной лаборатории, оснащенной энергодисперсионным рентгеновским спектрометром. Предложенное расчетное уравнение демонстрирует хорошие результаты, учитывая, что для его создания использовались данные пилотного исследования. В дальнейшем за счет увеличения выборки оно может быть существенно уточнено.

Для обнаружения возрастной зависимости снижения Ca²⁺ и увеличения доли Mg²⁺ в составе апатита достаточно простого электронного микроскопа с EDS-детектором. Кроме того, этот показатель теоретически может характеризовать не столько общую плотность костной ткани, сколько скорость ее резорбции, а значит, применим для оценки патологического изменения ткани. Поэтому такой инструмент может быть полезным дополнением к используемым в судебной медицине трендам декальцинации и изменениям плотности минерального костного вещества.

Реализация предложенного инструмента для расчета биологического возраста повысит доказательную базу идентификационных исследований неопознанных трупов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.