При производстве судебно-медицинской экспертизы важным и наиболее частым вопросом правоохранительных органов является вопрос об определении временного интервала, в котором было нанесено то или иное повреждение. Судебно-медицинский эксперт должен отличать посмертные повреждения от предсмертных, а также постараться определить время жизнеспособности потерпевшего после получения травмы. Стандартное гистологическое исследование сегодня не является самым надежным методом для получения полного ответа на этот вопрос, так как в первые минуты или часы невозможно отличить прижизненные повреждений от посмертных [1]. Этот факт делает актуальным поиск новых методов как биофизических, так и направленных на обнаружение специфических маркеров воспаления и коагуляции: иммуногистохимических, молекулярно-биологических, ферментативных, которые могут позволить более точно определить прижизненность повреждения и его давность [2].
Физиология заживления раны
Перед тем как рассмотреть конкретные методы определения давности повреждений (ДП), необходимо понимать, как происходит заживление раны и какие маркеры играют важную роль в этом процессе.
Заживление раны кожного покрова и других тканей можно разделить на пять последовательных фаз [3]:
1) гемостаз с образованием фибринокруарного сгустка, запускающего процесс заживления, при котором происходит агрегация тромбоцитов (первичный гемостаз), затем коагуляция (вторичный гемостаз);
2) воспаление и некроз поврежденной ткани;
3) санация разрушенной ткани;
4) формирование грануляционной ткани;
5) восстановление дефекта эпителия и формирование шрама.
Эти фазы и время их появления зависят от множества факторов: места травмы, характера травмирующего агента, возраста, характера питания, температуры тела, наличия медикаментозного лечения, острого или хронического отравления алкоголем, употребления наркотиков, сопутствующих заболеваний, а также от характера и степени выраженности посмертных изменений [4].
T. Kondo [5] подробно описал маркеры, выделяемые при заживлении раны и указал время их выявления от момента повреждения (табл. 1, 2).
Таблица 1. Время выявления маркеров экстрацеллюлярного матрикса в зависимости от давности повреждения
| Маркер | Время выявления | ||
| раннее | типичное | позднее | |
| Фибронектин | 10—20 мин | 4 дня | Месяцы |
| Коллаген III типа | 2—3 дня | 6 дней | » |
| «V» | 3 дня | 6 » | » |
| «VI» | 3 » | 6 » | » |
| «I» | 5 дней | 6 » | » |
| Ламинин в миофибробластах | 1,5 дня | 6 » | » |
| Коллаген в миофибробластах | 4 дня | — | » |
| α-Актин в миофибробластах | 5 дней | — | » |
Таблица 2. Время выявления маркеров молекул адгезии в зависимости от давности повреждения
| Маркер | Время выявления | |
| раннее | позднее | |
| P-селектин | Несколько минут | 7 ч |
| E-селектин | 1 ч | 17 дней |
| Молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) | 1,5 ч | 3,5 дня |
| Молекула адгезии эндотелия сосудов-1 (VCAM-1) | 3 ч | 3,5 дня |
В процессе заживления раны высвобождается огромное количество веществ [6]. Для судебной медицины особенно важными являются маркеры, которые принимают участие в начальных этапах заживления раны (гемостаз, инициация воспаления), так как они позволяют судить о прижизненности повреждений.
Основное требование к маркерам — они должны отсутствовать в физиологических условиях, а в месте повреждения их количество значительно увеличивается.
Методы оценки давности повреждений
Для оценки ДП используют различные методы.
Морфологический анализ имеет длительную историю как наиболее часто применяемый из-за его интуитивной природы и объективности. Визуальную оценку кровоподтеков (изменение цвета) также долгое время использовали в качестве метода определения давности травмы [7]. Этим методом и сегодня пользуются судебно-медицинские эксперты. Нельзя полностью отрицать его значимость, однако он слишком субъективный: выводы зависят от глубины и расположения повреждения, цвета кожного покрова и многих других факторов [8].
Иммуногистохимический (ИГХ) метод и метод флуоресцирующих антител (МФА) позволяют определить ДП на ранних стадиях, так как способны локализовать тканевые факторы, указывающие на стадию тканевого ответа, и фазы активации отдельных клеток [9]. Метод ИГХ и МФА являются уникальными. С их помощью можно оценить связь морфологии с физиологией и с большей точностью судить о времени, прошедшем с момента получения травмы, путем анализа цитокинов, молекул адгезии и маркеров экстрацеллюлярного матрикса. Метод иммунофлуоресцентного множественного окрашивания позволяет одновременно обнаружить более трех маркеров и облегчает качественный и количественный анализ ткани. Процентное содержание полиморфно-ядерных нейтрофилов, мононуклеарных клеток и фибробластов в зоне повреждения меняется в зависимости от времени [10, 11], поэтому оно имеет значение в оценке ДП.
ИГХ и МФА не самые точные и стабильные методы. Их результаты зависят от навыка оператора, проводящего исследование [12]. Этот факт заставляет ученых искать более новые и совершенные методы исследования.
Биофизическая объективизация повреждений — метод, основанный на результатах инструментального измерения параметров, выражаемых численно при регистрации изменений биологических тканей, произошедших под влиянием факторов внешней среды [13]. Этот метод можно разделить на три категории в зависимости от анализируемого параметра: 1) теплофизический способ — изучение изменений теплопроводности тканей; 2) измерение импеданса тканей; 3) другие способы (оптическая плотность, температура повреждений).
А.А. Халиков [14] предложил методику оценки электрических характеристик (электроемкость, электросопротивление) с помощью инвазивного датчика погружного типа. Такая методика позволяет определить ДП как на ранних стадиях постмортального периода, так и на гнилостно измененных трупах [15]. Метод биофизической объективизации определенно требует дальнейшего изучения и развития.
Молекулярно-биологический анализ. После образования повреждения содержание мРНК, цитокинов и ферментов обычно изменяется раньше, чем количество белка и гистоморфологическая картина [16, 17]. Таким образом, методы, основанные на определении мРНК, идеально подходят для оценки ДП на ранних стадиях. Содержание мРНК, воспалительных цитокинов и маркеров заживления ран анализируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для определения ДП.
ПЦР в реальном времени — это высокочувствительный метод, при котором обнаруживаются даже незначительные изменения экспрессии генов [18, 19]. Нормализация данных с использованием эталонных генов является важной частью этого метода для обнаружения экспериментальных вариаций, особенно количественных различий экспрессируемых маркеров. Экспрессия генов «домашнего хозяйства» (набор активных генов, необходимых для функционирования всех клеток организма независимо от типа ткани) активируется сразу после образования повреждения [20, 21]. Для эффективной нормализации важно идентифицировать стабильно экспрессируемый ген «домашнего хозяйства» после травмы.
Сегодня такие высокопроизводительные методы, как анализ генных чипов, высокопроизводительное секвенирование, ПЦР в реальном времени, позволяют анализировать от десятков до сотен генов одновременно, что значительно снижает стоимость исследования и дает высокоточные и стабильные результаты при определении ДП.
Биомаркеры давности повреждения
Повреждение кожи и скелетных мышц. Заживление ран — сложный процесс, который происходит в ответ на повреждение тканей и состоит из нескольких фаз. Во время воспалительной фазы в месте повреждения начинают высвобождаться различные хемокины, что приводит к миграции в очаг воспалительных клеток — нейтрофилов и макрофагов. В фазе пролиферации грануляционная ткань начинает покрывать область поврежденной ткани, чтобы завершить ее восстановление. В скелетных мышцах сателлитные клетки пролиферируют и дифференцируются в миоциты, затем сливаются друг с другом либо с поврежденными миофибриллами для восстановления мышц [22—24].
Инфильтрация клетками воспаления служит показателем заживления ткани [25]. Судебно-медицинские эксперты в отличие от патологоанатомов склонны сосредотачиваться на хронологической последовательности появления и исчезновения воспалительных клеток и веществ, выделяющихся во время воспалительного процесса.
Количественное содержание мРНК и белков, участвующих в восстановлении тканей (например, молекул адгезии, цитокинов, хемокинов, факторов роста), хорошо изучено. В судебно-медицинском контексте важным фактором является влияние гниения на изменение количества мРНК и белков. Исследования показали, что после смерти количество мРНК аргининсукцинатлиазы стабильно в течение 18 ч, мРНК, связанной с переносчиком нейтральных кислот (SNAT2), стабильно в течение 48 ч; а мРНК, ассоциированной с микротрубочками белка 1А/1B— lightchain 3 (LC3) и секвестосомы 1 (p62), стабильно в течение 4 дней [26—28]. Напротив, содержание мРНК каннабиноидного рецептора типа 2 значительно снижается уже через 3 ч после смерти, а матричной металлопротеиназы-2 и тканевых ингибиторов мРНК металлопротеиназы-2 снижается через 12 ч [29, 30]. Распад РНК и белков, вызванный посмертными изменениями, особенно гниением, разложением и высыханием, является неизбежным процессом. Следовательно, при выборе маркеров необходимо учитывать выраженность посмертных изменений, а также факторы окружающей среды, например, время года.
Повреждение головного мозга. Центральная нервная система (ЦНС) чрезвычайно чувствительна к деструктивным воздействиям механических, ишемических и токсических факторов. Поврежденная нервная ткань выделяет различные вещества, которые могут быть полезны для определения давности повреждающего воздействия [31].
В практике судебно-медицинского эксперта наиболее часто встречается повреждение ЦНС, связанное с черепно-мозговой травмой (ЧМТ). Диффузное аксональное повреждение (ДАП) — одно из самых тяжелых последствий ЧМТ. Патогенез ДАП до конца не изучен, поэтому ранняя посмертная диагностика такой патологии затруднена [32, 33]. Наиболее часто в месте повреждения аксонов обнаруживают β-амилоид, который перемещается из тела нейрональной клетки к периферии аксона посредством механизма быстрого транспорта. В некоторых исследованиях [34—36] сообщается, что предшественник β-амилоида является специфическим и высокочувствительным маркером повреждения аксонов. Так, Е.М. Колударова и соавт. [37] установили, что основной диагностически значимый морфологический признак ДАП с давностью травмы до 1 сут — кровоизлияния в мозолистое тело.
Ю.Е. Морозов и соавт. [38] изучали параметры NOR (количество ядрышек и площадь области нуклеол) в ядрах астроцитов перифокальной зоны внутримозговых кровоизлияний с учетом давности ЧМТ от 2 до 8 ч. Авторы установили, что реакция AgNOR является высокочувствительным индикатором белкового биосинтеза в астроцитах. Такой метод можно использовать для оценки выраженности пролиферативной реакции в перифокальной зоне очага повреждения головного мозга и, соответственно, для установления ДП.
Заключение
В последнее десятилетие в научной среде актуальна тема исследования ДП. Определение ДП во многом зависит от опыта судебно-медицинского эксперта: чем дольше человек занимается судебно-медицинской практикой, тем больше он знает о различных факторах, которые могут влиять на оценку повреждения (возраст, пол умершего, причина смерти, давность травмы и т.д.). Использование маркеров позволяет более точно и надежно определять ДП. Развитие методов, особенно высокопроизводительного анализа, позволило проводить одновременный анализ нескольких белков в одном образце. Уже изучено огромное количество маркеров заживления повреждений, но по-прежнему сохраняется необходимость в поиске новых, более совершенных маркеров. Для этого может потребоваться сочетание морфологических и молекулярных методов, включая геномику, протеомику и метаболомику.
Не менее актуальным является развитие биофизической методики объективизации повреждений. Такая методика широко применима в современной научной практике и позволяет получать объективные результаты, имеющие ценность как с экспертной позиции, так и с позиции сотрудников правоохранительных органов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.