Введение

В стоматологии и челюстно-лицевой хирургии отмечается рост числа пациентов с обширными костными дефектами, возникшими в результате травм, огнестрельных ранений и резекций опухолей. Травмы головы составляют 23% от общего числа травм, а опухоли челюстно-лицевой области — до 15% всех стоматологических заболеваний [1, 2]. Для замещения протяженных дефектов широко используют реконструктивные имплантаты из искусственных материалов (титан, сталь, полимеры). Однако они имеют недостатки, главными из которых являются отсутствие остеоиндуктивных свойств и невозможность замещения их собственной костной тканью [3]. В связи с этим актуальна разработка новых персонализированных конструкций, способных своевременно замещаться костной тканью и выступать в качестве носителя для биоактивных веществ.

Перспективной основой для таких конструкций служат синтетические биорезорбируемые полимеры. Полилактогликолид (ПЛГ) — один из наиболее широко распространенных и исследованных сополимеров молочной кислоты. Изменения объемной структуры, вида изомера и длины полимерной цепи позволяют варьировать механические свойства и скорость биодеградации полимера [4]. ПЛГ одобрен для медицинского применения и используется для изготовления шовного материала, винтов и пластин; кроме того, существуют скаффолды на его основе для тканеинженерных конструкций и доставки биологически активных молекул [5].

Для создания персонализированных трехмерных матриксов ранее нами был отработан метод антисольвентной 3D-печати из раствора алифатических сополиэфиров ПЛГ в нетоксичном растворителе тетрагликоле [6]. Он позволяет создавать скаффолды с радиально ориентированной микроструктурой взаимопроникающих пор и высокой пористостью. В стоматологии и челюстно-лицевой хирургии такие матриксы могут иметь преимущества по сравнению с традиционными костно-замещающими материалами, которые за счет низкой пористости имеют длительные сроки биодеградации и препятствуют замещению их новообразованной костной тканью

Цель исследования — изучение физико-механических и биосовместимых свойств матриксов, полученных из растворов ПЛГ в тетрагликоле с помощью антисольвентной 3D-печати.

Материал и методы

В качестве основы для биорезорбируемых матриксов использовали ПЛГ марки Purasorb PDLG 7507 (Corbion Purac, Нидерланды). Для получения 10 масс.% раствора 1,0 г ПЛГ с помощью магнитной мешалки (FlatSpin, Китай) смешивали с 9,0 г тетрагликоля (ТГ, Sigma-Aldrich, США) в течение 2 дней при комнатной температуре.

3D-печать. Для формирования трехмерных матриксов использовали 3D-принтер, разработанный и изготовленный во ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН. Он состоит из дозатора, системы перемещения, корпуса, столика и индикаторов температуры.

Печать выполняли по координатам, заданным в трехмерной цифровой модели. В управляющей программе (RepetierHost v.2.2.4, Германия) устанавливали температурный режим печати 25°C, поддерживаемый за счет встроенных термоэлектрических преобразователей. Для получения экспериментальных образцов полимерных волокон раствор ПЛГ в ТГ выбранной концентрации и температуры инжектировался дозатором принтера с диаметром сопла 160 мкм в чашку Петри с дистиллированной водой. Для завершения процесса отверждения образцы погружали в емкости с дистиллированной водой, которые затем помещали в термостат при температуре 37°C на 24 ч. В дальнейшем волокна промывали 95% этиловым спиртом и высушивали при комнатной температуре на воздухе в течение 24 ч.

Исследование физико-механических свойств полиэфирных матриксов проводили с использованием пленок ПЛГ, моделирующих микроструктуру полилактогликолидных волокон, образующихся в процессе антисольвентной 3D-печати. Образцы имели прямоугольную форму и размер 20×5×0,2 мм.

Механические испытания. Анализ физико-механических свойств исследуемых образцов проводили на испытательной машине EZ-Test EZ-SX (Shimadzu, Япония). Управление, а также подбор и установку параметров проведения на ней тестов на растяжение (скорость 1 мм/мин) и определения значений модуля Юнга осуществляли с помощью программного обеспечения TRAPEZIUM X. Значения модуля Юнга образцов рассчитывали по линейным участкам полученных кривых «напряжение — деформация».

Микроскопия. Особенности макроструктуры и микроструктуры трехмерных матриксов, а также морфологию их поверхности исследовали с помощью оптической (микроскоп Bresser, США) и сканирующей электронной микроскопии (микроскоп Phenom ProX, Нидерланды). Ускоряющее напряжение, используемое для получения изображений сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), составляло 15 кВ.

Исследования in vitro. Для оценки биологических свойств матриксов использовали охарактеризованные культуры мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани крыс (ММСК ЖТ). Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 1200 об/мин и температуре 15°C и высевали в чашки Петри в ростовой среде ДМЕМ/F12 («Панэко», Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; PAA Laboratories, США), 0,584 мг/мл L-глутамина («Панэко», Россия), 5000 ед/мл пенициллина («Панэко», Россия) и 5000 мкг/мл стрептомицина («Панэко», Россия), которые помещали в термостат при температуре 37°C и выдерживали в течение суток в атмосфере 5% СО₂.

Оценку цитосовместимости проводили с помощью MTT-теста и флуоресцентной микроскопии на 1-е и 14-е сутки. Клетки окрашивали витальным красителем РКН-26 (red fluorescent cell linker kit, Sigma, США). Для выявления живых клеток использовали краситель кальцеин-AM (Biotium, США), для определения апоптотических клеток — краситель DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole, Biotium, США). Флуоресцентную микроскопию выполняли с помощью автоматизированного микроскопа Lionheart FX (Agilent BioTek, США).

Построение графиков и статистическую обработку полученных данных выполняли в программе SigmaPlot 12.0 (США). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (mean ± SD). В зависимости от распределения Гаусса межгрупповое сравнение проводили с использованием критерия t Стьюдента или критерия U Манна—Уитни. Статистически значимыми считали различия при вероятности ошибки отклонения от нулевой гипотезы или уровне статистической значимости ниже 5% (p<0,05). При построении столбчатых диаграмм значения, отличавшиеся от контрольных, помечали знаком «*» в соответствии с рекомендациями Американской ассоциации физиологов (APA).

Результаты и обсуждение

Исследование механических свойств.Исследование физико-механических свойств показало, что пленки из ПЛГ, изготовленные путем антисольвентного осаждения при температуре 25°C и диаметре сопла 160 мкм, обладают достаточной прочностью. Значение модуля Юнга составило 18±2 МПа, прочность на разрыв 0,43±0,05 МПа, относительное удлинение 8±2%.

Структура пор образца была относительно равномерной. Внешняя поверхность представляла собой гладкий слой с толщиной, не превышающей 1 мкм. Внутренняя часть представлена пористой структурой с выраженной радиальной направленностью. В волокнах наблюдалось анизотропное распределение плотности с тенденцией к формированию полого канала в центре. Преимущественно поры имели пальцеобразную форму, длина составляла почти 30 мкм (рис. 1).

Рис. 1. Внешний вид (а) сформированного методом антисольвентной 3D-печати скаффолда и оптическая микрофотография поверхности (б) и внутренней структуры (в).

Исследование биосовместимости. 3D-скаффолд из ПЛГ не оказывал цитотоксического воздействия и обладал высокой биосовместимостью с ММСК ЖТ крыс. Относительная выживаемость клеток после 1-х суток составила 99,58±2,28%, на 14-е сутки — 98,14±2,22%. В 1-е и на 14-е сутки не выявлено статистически значимых различий по относительной жизнеспособности клеток в сравнении с контролем (рис. 2).

Рис. 2. Оценка цитосовместимости 3D-скаффолда на мультипотентных мезенхимных стромальных клетках жировой ткани крыс, МТТ-тест.

Методом флуоресцентной микроскопии показано, что скаффолд обладал высокой цитосовместимостью. Через 1 сут не наблюдалось мертвых клеток, окрашенных DAPI. Через 14 сут отмечали существенное увеличение плотности клеток, большая часть которых была окрашена кальцеином-АМ. Число клеток, окрашенных DAPI, соответствовало числу мертвых клеток в контрольных культурах (рис. 3). Структура скаффолда способствовала адгезии и распластыванию клеток на его поверхности.

Рис. 3. Оценка цитосовместимости 3D-матриксов на основе полилактогликолида на мультипотентных мезенхимных стромальных клетках жировой ткани крыс.

Клетки, окрашенные PKH-26 (красный), живые клетки, окрашенные кальцеином-AM (зеленый), и мертвые клетки, окрашенные DAPI (синий).

Флуоресцентная микроскопия. ×10.

Использование 3D-печати позволяет получать полилактогликолидные скаффолды сложной структуры. При этом их прочностные свойства, в том числе модуль упругости, могут соответствовать трабекулярной кости нижней челюсти (модуль упругости от 6,9 до 199,5 МПа) и превышать значения для хрящевой ткани (модуль упругости от 0,3 до 20 МПа) [7, 8]. Это позволяет предположить, что полученные нами с помощью 3D-печати каркасы будут обладать механическими свойствами, оптимальными для восстановления протяженных дефектов челюстных костей.

Биосовместимость и прочностные свойства полилактогликолидных матриц оказались сравнимыми с ранее получеными и исследоваными нами матрицами из растворов полилактидов: их модуль упругости в зависимости от пористости (от 92% до 96%) и молекулярной массы варьировался от 1 до 23 МПа. Цитосовместимость и адгезия клеток к поверхности были высокими для матриц из L-изомеров лактида [9]. Использованный в исследовании метод антисольвентной 3D-печати, по нашему мнению, способен сохранять большее количество факторов роста при их включении в образец за счет отсутствия избыточного нагревания на краях материала [10].

По сравнению с традиционно используемым для изготовления эндопротезов титаном и его сплавами ПЛГ обладает значительно более низким модулем упругости [11]. Однако это позволит избежать осложнений, с которыми сталкиваются пациенты с титановыми замещающими конструкциями, таких как прорезывание элементов через кожу или слизистую оболочку рта, деформация протеза, а также резорбция собственной костной ткани в области фиксирующих винтов, связанная с наличием разницы в прочностных свойствах между титиановыми конструкциями и окружающими тканями [12].

Заключение

Метод антисольвентной 3D-печати из раствора алифатических сополиэфиров полилактогликолида в нетоксичном растворителе тетрагликоле позволяет изготавливать биосовместимые трехмерные матрицы, обладающие высокой пористостью и сложной структурой. Предложенный метод может быть использован для получения персонализированных конструкций, замещающих протяженные костные дефекты, с широкой перспективой применения в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №22-15-00425).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.