Введение

Формирование требуемых формы и структуры изделия — одна из ключевых задач при разработке имплантируемых изделий, предназначенных для постепенного замещения живой тканью [1]. Одним из подходов, позволяющим одновременно создавать форму и микроструктуру биосовместимого и биодеградируемого искусственного матрикса, является антисольвентная трехмерная печать полилактогликолидов. При этом форма искусственного матрикса определяется в основном цифровой моделью, тогда как формирование микроструктуры — скоростями процесса массообмена между раствором полимера и осадителя и перехода системы из жидкого в твердое состояние.

Существенное преимущество антисольвентного метода создания полилактогликолидного матрикса состоит в формировании развитой внутренней структуры непосредственно в процессе отверждения. При быстром, в течение нескольких секунд, разделении полимерного раствора на фазы при экстракции осадителя возникает система взаимосвязанных пор от субмикронного размера до десятков и сотен микрометров в поперечнике. В то же время высокая скорость перехода между вязко-текучим и стеклообразным состоянием при водном антисольвентном осаждении растворов полилактогликолида приводит к формированию дефектной полимерной структуры, что существенно снижает ее механические характеристики. Это ограничивает область применения матриксов, полученных методом антисольвентного осаждения, восстановлением областей ткани с отсутствующей или невысокой нагрузкой [2].

Традиционным подходом к улучшению качества дефектной полимерной структуры остается терморелаксация — процесс нагрева выше температуры стеклования для восстановления равновесной структуры. В случае, если повышение температуры нежелательно, как, например, для полимерных материалов, содержащих термолабильные добавки, зачастую ограничивающие диапазон температур физиологическими значениями, аналогичный эффект может быть достигнут введением в структуру полимера пластифицирующих добавок. Это позволяет повысить температуры стеклования двухкомпонентной системы полимер—пластификатор, увеличению подвижности макромолекул за счет ослабления межмолекулярных связей полимер-полимер и, как следствие, делает возможным релаксацию и упрочнение структуры [3, 4]. Вместе с тем перераспределение напряжений свободного объема может приводить к нарушению геометрии и структуры получаемого изделия.

Цель исследования: изучение возможности улучшения физико-механических свойств полилактогликолидных матриксов путем введения легкоудаляемого пластификатора — этанола — и проведение оценки влияния пластификации на микроструктуру поверхности матриксов и их биосовместимость in vitro.

Материал и методы

Сополимер молочной и гликолевой кислот — поли(лактид-со-гликолид) — ПЛГ («Purasorb PDLG7507 Corbion PURAC Biochem», Нидерланды) с соотношением лактид/гликолид 75/25 и характеристической вязкостью 0,7 дл/г использовали для получения 10% раствора. Для этого 1 г ПЛГ смешивали с 9 г нетоксичного растворителя — тетрагликоля — ТГ («Sigma-Aldrich», США) с помощью магнитной мешалки («DLab FlatSpin», Китай) в течение 2 дней при комнатной температуре, затем хранили в плотно закрытой упаковке при температуре 7 °C.

Подготовка образцов. Образцы в виде пористого полимерного волокна получали экструзией 10% раствора ПЛГ/ТГ из автоматического шприца сквозь стальную тупоконечную иглу диаметром 270 мкм в осадительную емкость с дистиллированной водой. Скорость потока составляла 15 мкл/с, температура осадителя и раствора полимера 25 °C. Полученное волокно обрабатывали в воде и этаноле в последовательности, указанной в табл. 1.

Таблица 1. Последовательность и длительность этапов подготовки образцов поли(лактид-со-гликолида)

Образцы волокон ПЛГ были изготовлены с использованием автоматической системы дозирования на специально разработанном 3D-принтере [2]. Раствор ПЛГ/ТГ вводили в чашки Петри, наполненные дистиллированной водой, через иглу из нержавеющей стали диаметром 270 мкм при скорости потока 15 мкл/с и температуре 25 °C. Образцы фиксировали в дистиллированной воде, затем обрабатывали этанолом и промывали в дистиллированной воде (см. табл. 1). После обработки образцы высушивали в чашках Петри при комнатной температуре в течение 24 ч, а затем хранили при температуре 7 °C.

Для микромеханического анализа и оценки шероховатости поверхности образцы волокон разрезали на сегменты толщиной 5—8 мм с помощью одноразового скальпеля (№24, «Apexmed», Россия). После этого каждый сегмент был тщательно закреплен на стеклянной основе размером 10×10 мм с помощью цианоакрилатного клея, чтобы предотвратить любое нежелательное перемещение во время исследования.

Исследование физико-механических свойств. Физико-механические свойства материала исследовали с помощью теста на растяжение. В качестве образцов использовали решетчатую пленку толщиной 200 мкм, шириной 10 мм и длиной 20 мм с центральной деформируемой зоной шириной 6 мм и длиной 6 мм, полученную методом антисольвентного осаждения в условиях, аналогичных получению волокон. Исследование проводили с помощью стенда механических испытаний EZ-Test EZ-SX («Shimadzu», Япония), в режиме растяжения, скорость растяжения составляла 1 мм/мин, предел измерения 100% деформация или нагрузка 500 Н.

Сбор и обработку данных проводили с помощью специализированного программного обеспечения TRAPEZIUM X («Shimadzu», Япония). Модуль Юнга рассчитывали по начальному линейному участку кривой деформация/нагрузка.

Исследование структуры образцов. Особенности макро- и микроструктуры образцов были исследованы с помощью стереоскопического оптического микроскопа Bresser Advance («Bresser», Германия) с цифровой камерой. Образцы фиксировали на матовой черной полипропиленовой подложке с помощью акрилового полимерного адгезива. Исследование образцов проводили в отраженном свете.

Микроструктуру образцов, а также морфологию их поверхности исследовали методом сканирующей электронной микроскопии (SEM) на микроскопе Phenom ProX («Phenom», Нидерланды). Исследуемые образцы без напыления устанавливали на столик микроскопа с помощью проводящей углеродной ленты. В качестве держателя столиков использовали держатель для непроводящих образцов. При съемке использовали следующие параметры: 15 кВ, детектор обратно рассеянных электронов, режимы «Image» и «Point».

Исследование шероховатости. Шероховатость образцов измеряли на оптическом профилометре S Neox («Sensofar», Испания). Режим измерения рельефа поверхности — оптическая конфокальная микроскопия. Источник монохромного излучения — зеленый светодиод. Поле сканирования 113×94 мкм.

Для микромеханического анализа и оценки шероховатости поверхности образцы волокон разрезали на сегменты толщиной 5—8 мм с помощью одноразового скальпеля (№24, «Apexmed», Россия). Затем каждый сегмент был тщательно закреплен на стеклянной основе размером 10×10 мм с помощью цианоакрилатного клея, чтобы предотвратить любое нежелательное перемещение во время тестирования.

Измерения твердости образцов. Измерения твердости образцов проведено на нанотвердомере НаноСкан-4D («ТИСНУМ», Россия). На образцах проведены испытания методом инструментального индентирования в соответствии с рекомендациями стандарта ГОСТ Р 8.748-2011. Индентор — пирамидальный трехгранный алмазный наконечник типа Берковича. Максимальная сила нагружения — 1 мН. Время нагружения — 10 с, время выдержки — 2 с. Калибровку формы наконечника и жесткости прибора проводили на плавленом кварце. Были проведены испытания вдоль образцов, средняя арифметическая шероховатость которых приведена в табл. 2. На каждом образце сделано не менее 15 измерений. Серия индентов проводилась вдоль прямой с учетом ее наклона.

Таблица 2. Физико-механические свойства поли(лактид-со-гликолида) после антисольвентного осаждения

Примечание. E — модуль упругости; σ_max — предел прочности; Δ — максимальное удлинение; H — твердость; E* — приведенный модуль упругости, E^*=E/(1—ν²); ν — коэффициент Пуассона (принятый в данном случае за 0, так как исследовали высокопористые материалы, для которых коэффициент может быть отрицательным).

Культивирование ММСК ЖТ крыс. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, полученные из жировой ткани крыс (ММСК ЖТ), культивировали в ростовой среде DMEM/F12 («ПанЭко», Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 5000 ед/мл пенициллина («ПанЭко», Россия), 5000 мг/мл стрептомицина («ПанЭко», Россия) и 0,584 мг/мл L-глутамина («ПанЭко», Россия) при стандартных условиях: температура 37 °C, влажная атмосфера, содержащая 5% СО₂.

Исследование адгезии ММСК ЖТ на поверхности матриксов. Для изучения адгезии клеток на поверхности матриксов исследуемые образцы помещали на дно лунок 24-луночных планшетов («SPL Life Sciences», Южная Корея), сверху наносили суспензию ММСК ЖТ, предварительно окрашенных флуоресцентным красителем PKH26 («Sigma-Aldrich», США) в соответствии с протоколом производителя в количестве 1×10⁵ клеток/матрикс. Клетки культивировали на поверхности матриксов в ростовой среде и через 1, 3 и 7 сут оценивали адгезию с помощью флуоресцентного микроскопа Agilent BioTek Lionheart FX (США). Количественный анализ адгезии клеток проводили путем обсчета не менее 15 полей зрения в программе ImageJ («NIH», США). Данные представлены в виде относительного количества клеток в поле зрения.

Результаты и обсуждение

Исследование физико-механических свойств полилактогликолидных матриксов. Согласно данным литературы низкомолекулярные спирты служат плохими растворителями для полилактогликолидов, однако, как показано ранее, этиловый спирт является более мягким осадителем для антисольвентного процесса в системе ПЛГ/растворитель/антисольвент по сравнению с водой [5]. При стерилизации изделий из ПЛГ в водных растворах этанола обнаружено, что этанол понижает модуль упругости структуры, оказывая пластифицирующее действие на высокомолекулярный полилактогликолид.

С увеличением продолжительности обработки образцов ПЛГ спиртом наблюдали рост их прочности и относительного удлинения на разрыв, а также увеличение модуля упругости. Максимальные значения последних получены после 12-часовой обработки: модуль упругости, прочность и максимальное удлинение пленочных пористых образцов увеличились в 6, 14 и 3 раза соответственно по сравнению с образцами после антисольвентного осаждения. В первую очередь это связано с уменьшением числа дефектов структуры в пластифицированном состоянии, а также завершением релаксационных процессов на надмолекулярном уровне. Возрастание модуля Юнга вместе со временем обработки образцов позволяет сделать вывод об отсутствии в структуре ПЛГ остаточного пластификатора на момент проведения измерений, так как в противном случае увеличенная подвижность макромолекулярных цепей привела бы к характерному снижению упругости. Данные этих исследований макромеханических свойств пленок согласуются с результатами исследования микромеханических свойств поверхности образцов, сформированных аналогичным антисольвентным методом. Формы кривых нагружения поверхности для всех исследованных образцов типичны для пластичных материалов и указывают на малую величину упругого восстановления. Приведенные в табл. 3 значения отражают существенное изменение прочностных свойств модельных образцов ПЛГ при изменении длительности обработки этанолом. Твердость и модуль упругости поверхности увеличиваются вместе со временем обработки образца этанолом. В течение 12-часовой обработки поверхностный модуль упругости возрастает по сравнению с интактным образцом, не обработанным спиртом, образцом в 3 раза, а твердость — в 12 раз.

Таблица 3. Шероховатость поверхности исходных и упрочненных образцов поли(лактид-со-гликолида)

Значительное, превышающее 2 порядка, различие в модулях упругости, полученных при измерении макро- и микромеханических свойств, связанно со структурой образцов. Исследованный методом наноиндентирования на глубину 950—2500 нм приповерхностный слой имеет достаточно плотную малопористую структуру, тогда как средняя пористость пленок весьма велика и превышает 95% (рис. 1).

Рис. 1. Микроструктура полимерного волокна (а, б) и пленки (в), формирующаяся в процессе антисольвентного осаждения.

Характер поверхности образцов после спиртовой обработки значительно отличается от такового у необработанного образца. На поверхности исходного образца явно выражены складки глубиной до 3 мкм, направленные вдоль оси волокна (рис. 2). Характер самих образований позволяет предположить их связь с радиальным сжатием пластичного волокна. Образование такой поверхностной структуры следует отнести к периоду формирования и преимущественно радиальной контракции гель-волокна при экстракции ТГ из раствора ПЛГ при его антисольвентном осаждении. При этом анизотропное, «по окружности», сжатие гелевой оболочки вокруг отверждающейся струи приводит к формированию продольно-складчатой структуры. Ранее были рассмотрены эффекты сжатия и расширения струй растворов ПЛГ/ТГ при экстракции растворителя, однако влияние этих процессов на характер поверхности на субмикронном масштабе зафиксировано впервые [5].

Рис. 2. Эволюция профиля поверхности образцов поли(лактид-со-гликолида) в процессе обработки этанолом (а—г).

Образцы, подвергшиеся обработке этиловым спиртом, однородны и имеют более гладкую поверхность по сравнению с исходными. При этом уменьшение шероховатости не имеет прямой корреляции с временем обработки, напротив, наиболее гладкая поверхность формируется при наименьшем времени.

Отсутствие прямой монотонной зависимости шероховатости от времени пластификации указывает на то, что изменение качества поверхности не является следствием пластификации или травления поверхности волокна этанолом. Как показано в табл. 3, кратковременная обработка в этаноле приводит к улучшению качества поверхности с дальнейшим ее огрублением с увеличением длительности обработки. Так, через 1 ч обработки шероховатость образца достигает наименьшего значения в 200 нм, что в 5 раз меньше, чем у необработанного образца. При этом происходит насыщение пластификатором лишь приповерхностных слоев образца. С увеличением времени обработки этанолом и увеличением текучести центральных областей структуры существенный вклад в изменение шероховатости поверхности вносит упругая деформация всего объема пластифицированного образца в процессе сжатия. При этом шероховатость увеличилась до 50% от исходной и составила 550 нм.

Исследование адгезии ММСК ЖТ на поверхности матриксов. По результатам исследования обнаружена зависимость адгезии клеток от шероховатости поверхности (рис. 3). Наибольшее число клеток, адгезированных на поверхности матриксов, наблюдалось в группе без обработки этанолом, которые также продемонстрировали максимальное значение шероховатости поверхности (см. табл. 3). Сглаживание поверхности матриксов приводит к снижению адгезии клеток. При этом наблюдалась пролиферация клеток на матриксах — для всех исследуемых образцов число клеток увеличивалось к 7-м суткам по сравнению с первыми сутками.

Рис. 3. Адгезия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, полученных из жировой ткани, на поверхности исследуемых матриксов, обработанных этанолом.

а — флуоресцентная микроскопия, ув. ×4; б — относительное количество клеток в поле зрения, * — p<0,05 vs. 1-е сутки соответствующей группы, ^# — p<0,05 vs. вода 12 ч.

Влияние шероховатости поверхности на адгезию клеток носит выраженный клеточно-специфический характер, что подтверждается результатами многочисленных исследований. Для таких клеток, как остеобласты, увеличение шероховатости является благоприятным фактором. Согласно данным литературы остеобласты демонстрируют усиление пролиферативной активности и функциональной дифференцировки на поверхностях с микрорельефом (около 0,81 мкм) [6]. Для фибробластов человека улучшение адгезии клеток наблюдается при значениях шероховатости 20—50 нм, тогда как увеличение данного параметра до почти 95 нм приводит к значительному уменьшению числа адгезивных клеток, что также подтверждается на линии фибробластов NIH/3T3 — увеличение шероховатости поверхности полимерных пленок из бактериального сополимера от 92,0±7,0 до 588,8±16,0 нм приводит к существенному снижению адгезии клеток [7—9].

Таким образом, указанные различия подчеркивают необходимость целенаправленного подбора топографических параметров поверхности в зависимости от конкретного типа клеток-мишеней для обеспечения их адгезии.

Заключение

Представленные результаты свидетельствуют, что улучшение физико-механических свойств поли(лактид-со-гликолид)-матриксов при их взаимодействии с этанолом, прежде всего, связано с релаксационными процессами, протекающими в пластифицированной структуре. При этом наблюдается значительное (на порядок) увеличение прочности на разрыв и четырехкратное повышение модуля упругости. Кроме того, этанол, являясь растворителем для поли(лактид-со-гликолида), приводил к изменениям в структуре поверхности и немонотонном снижении шероховатости образцов поли(лактид-со-гликолида), полученных антисольвентным методом.

Установлено, что снижение шероховатости поверхности образцов с 1 мкм до 200 нм приводит к снижению адгезии мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, полученных из жировой ткани, на матриксах. Вместе с тем данные литературы указывают на необходимость выбора характеристик поверхности в зависимости от типа клеток примерно в том же диапазоне. Это свидетельствует о необходимости оптимизации обработки поверхности в зависимости от спецификации имплантируемого изделия. Таким образом, пластификационная обработка полилактогликолида позволяет не только улучшить физико-механические свойства ПЛГ матриксов, но и оптимизировать тип их поверхности под определенный тип клеток.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-15-00425-П).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.