Введение

Восстановление протяженных дефектов костной ткани, возникающих в результате травматических повреждений, резекции опухолей, инфекционных процессов или атрофии костной ткани, представляет одну из наиболее серьезных проблем современной челюстно-лицевой хирургии, стоматологии и травматологии [1]. В последнее время особое внимание уделяется разработке биосовместимых остеопластических материалов, способных не только заполнить костный дефект, но и направленно стимулировать регенерацию костной ткани. Одним из наиболее многообещающих подходов является создание ген-активированных матриксов (ГАМ) на основе аденовирусных векторов, содержащих гены остеоиндукторов, в частности, костного морфогенетического белка 2-го типа (BMP-2) — эффективного индуктора остеогенеза [2].

Включение аденовирусных конструкций с геном BMP2 в полимерные матрицы, такие как (поли(L-лактид-со-)гликолид (PLGA), позволит локально доставлять генетические конструкции в зону повреждения. PLGA широко используется в регенеративной медицине благодаря биосовместимости, способности к биорезорбции и возможности изготовления матриксов с пористой структурой [3, 4]. Технологии аддитивного производства (3D-печать) позволяют изготавливать из PLGA матриксы со сложной макро- и микроструктурой, полностью соответствующие геометрии конкретного костного дефекта, что критически важно для успешной интеграции имплантата и неоваскуляризации [5]. Для усиления регенеративного потенциала ГАМ перспективной стратегией является их комбинирование с ортобиологическими препаратами. Тромбоцитарный гель на основе богатой тромбоцитами плазмы (platelet-rich plasma, PRP), получаемый из аутологичной крови пациента, представляет собой естественный источник факторов роста и цитокинов, которые играют ключевую роль в регуляции воспалительной реакции, пролиферации и хемотаксисе клеток и ангиогенезе [6, 7]. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют, что применение тромбоцитарного геля в сочетании с остеоиндуктивными компонентами способствует лучшему заживлению костных дефектов по сравнению с таковым в группах без добавления PRP [8]. Таким образом, добавление к PLGA-матриксам, содержащим аденовирусные конструкции с геном BMP2, тромбоцитарного геля на основе PRP, может значительно улучшить биологические свойства материалов.

Цель исследования: изучение влияния добавления тромбоцитарного геля на биологические свойства 3D-матриксов на основе PLGA, импрегнированных аденовирусными конструкциями с геном BMP2.

Материал и методы

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани (ММСК ЖТ). Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки получали из жировой ткани крыс по описанной ранее методике [9]. Клетки культивировали в ростовой среде: ДМЕМ/F12 («ПанЭко», Россия) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, «BioWest», Франция), 0,584 мг/мл L-глутамина («ПанЭко», Россия), 5000 ед/мл пенициллина («ПанЭко», Россия) и 5000 мкг/мл стрептомицина («ПанЭко», Россия) при температуре 37 °C и 5% CO₂.

Для остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ культивировали в остеогенной среде на основе ростовой с добавлением 0,05 мг/мл L-аскорбиновой кислоты («Sigma Aldrich», США) и 2,16 мг/мл β-глицерофосфата натрия («Sigma Aldrich», США).

Ген-активированные матриксы. В работе использовали аденовирусные векторы с целевым геном костного морфогенетического белка 2 (Ad-BMP2) [10].

Матриксы изготавливали из PLGA (Purasorb PDLG 7507, «Corbion Purac», Нидерланды) с соотношением лактид/гликолид 75/25. Для получения 10 масс.% раствора 1 г PLGA смешивали с 9 г тетрагликоля («Sigma-Aldrich», США) с помощью магнитной мешалки («FlatSpin», Китай) в течение 48 ч при комнатной температуре. Матриксы на основе PLGA изготавливали методом антисольвентной 3D-печати на специально разработанном принтере [11] при температуре 25 °C с диаметром сопла 330 мкм.

Обогащенную тромбоцитами плазму (Platelet-rich plasma, PRP) получали из крови крыс методом пункции сердца согласно ранее разработанному протоколу [12]. Для активации PRP и образования тромбоцитарного геля к 80 мкл PRP добавляли 20 мкл раствора тромбина («PZ Cormay», Польша).

3D-матриксы на основе PLGA, тромбоцитарный гель и Ad-BMP2 с концентрацией вирусной ДНК 125 нг/мкл использовали для получения нескольких вариантов ГАМ:

1. PLGA-Ad: аденовирусную суспензию наносили на PLGA и инкубировали в течение 24 ч для сорбции вирусных частиц на PLGA-матриксах.

2. PLGA-Ad + PRP: на PLGA матриксы с адсорбированными Ad-BMP2 наносили PRP и добавляли раствор тромбина для полимеризации геля.

3. PLGA + (Ad-PRP): суспензию аденовирусов с геном BMP2 смешивали с PRP, наносили на PLGA и добавляли раствор тромбина для формирования ГАМ.

Кинетика высвобождения аденовирусных конструкций из матриксов. Для оценки кинетики высвобождения аденовирусных векторов матриксы инкубировали в 2 мл изотонического раствора хлорида натрия («ПанЭко», Россия) в течение 7 сут, отбирая по 100 мкл раствора каждые 3 дня. Из образцов выделяли вирусную ДНК с использованием набора QIAamp MinElute Virus Spin Kit («QIAGEN», Германия) согласно инструкции производителя и оценивали ее концентрацию на спектрофотометре Nano Drop OneC («Thermo Fisher Scientific», США) при 260 нм.

МТТ-тест. ММСК ЖТ высевали на дно 24-луночных планшетов с системой Transwell (с порами 8 мкм «SPL Lifesciences», Корея), через 24 ч помещали ГАМ в верхние вкладыши и инкубировали в ростовой среде в течение 14 сут. Контрольные клетки культивировали без добавления матриксов. Относительное количество живых клеток после инкубации с ГАМ оценивали методом МТТ-теста. Для этого к ММСК ЖТ добавляли 0,5 мг/мл MTT (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромид, («ПанЭко», Россия) и инкубировали в течение 2 ч при температуре 37 °C. Затем кристаллы формазана растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО, «ПанЭко», Россия), перемешивая на шейкере в течение 20 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны 570 нм с вычитанием фона при 620 нм с помощью фотометра BioRad Reader XMark («Bio-Rad Laboratories», США).

Адгезия ММСК ЖТ на поверхности ГАМ. ГАМ помещали на дно лунок 24-луночных планшетов, сверху наслаивали суспензию клеток, предварительно окрашенных красителем PKH26 (red fluorescent cell linker kit, «Sigma», США) в соответствии с инструкцией производителя. По окончании эксперимента через 1 и 7 сут с целью выявления живых клеток на поверхнотсти исследуемых матриксов ММСК ЖТ окрашивали 0,5 мкМ Кальцеин AM («Biotium», США) в течение 35 мин, а для выявления мертвых клеток использовали краситель DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) в концентрации 5 мкг/мл в течение 10 мин при температуре 37 °C. Затем получали изображения клеток с использованием микроскопа («Agilent BioTek Lionheart FX», США).

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Экспрессию генов остеогенных маркеров (BMP2, остеопонтина — Spp1, остеокальцина — Bglap и щелочной фосфатазы — Alpl) оценивали методом ПЦР-РВ через 14 сут после культивирования ММСК ЖТ в присутствии ГАМ. Общую РНК выделяли с применением набора RNeasy Plus Mini («Qiagen», Германия), кДНК синтезировали с использованием набора RevertAid («Thermo Scientific», Германия) согласно инструкциям производителей. Далее проводили амплификацию на термоциклере BioRad iQ Cycler («BioRad», США) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I («Евроген», Россия). Данные экспрессии целевых генов нормировали относительно референсных генов Gapdh и Actβ.

Активность щелочной фосфатазы. Остеогенную дифференцировку ММСК ЖТ после инкубации с ГАМ также оценивали по изменению активности Alpl. Анализ выполняли в клеточных лизатах с использованием набора («Elabscience Biotechnology», Ухань, Китай) согласно инструкции производителя.

Статистический анализ. Статистическую обработку полученных данных и построение графиков выполняли в программе SigmaPlot v14.0 («Systat Software Inc.», США). Сравнение экспериментальных групп проводили с использованием One Way ANOVA Holm-Sidak тест. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Оценка кинетики высвобождения аденовирусных конструкций из матриксов на основе PLGA и PRP. Скорость и продолжительность высвобождения аденовирусных векторов из ГАМ является одним из ключевых параметров для эффективной регенерации костной ткани. Для эффективной трансдукции фибробластов и остеопрогениторных клеток in vivo необходимо обеспечить достаточную концентрацию генетических конструкций в зоне повреждения в период миграции клеток — спустя несколько дней после имплантации ГАМ [13].

Высвобождение аденовирусных конструкций с геном BMP2 из матриксов происходило постепенно, но с различной скоростью в зависимости от состава (рис. 1). Наибольшая скорость высвобождения наблюдалась из PLGA матриксов без добавления PRP: 75% вирусных конструкций обнаружено в растворе через 24 ч и 100% к 7-м суткам. Кинетика высвобождения аденовирусных частиц из матриксов с добавлением тромбоцитарного геля была сходной. В течение первых суток высвободилось 63 и 59% вирусных векторов из PLGA-Ad + PRP и PLGA + (Ad-PRP) соответственно, а к 7-м суткам выход составил около 95% для матриксов обоих типов. Таким образом, включение тромбоцитарного геля в состав ГАМ на основе PLGA позволяет добиться более контролируемого и продолжительного высвобождения генетических конструкций.

Рис. 1. Кинетика высвобождения Ad-BMP2 из матриксов на основе PLGA и PRP. Спектрофотометрия.

Ad-BMP2 — аденовирусные векторы с целевым геном костного морфогенетического белка 2-го типа; PLGA — (поли(L-лактид-со-)гликолид; PRP — богатая тромбоцитами плазма.

Исследование цитосовместимости и адгезионных свойств ГАМ на основе PLGA и PRP. По результатам MTT-теста через 1 и 7 сут показано отсутствие цитотоксического действия всех исследуемых матриксов при инкубации с ММСК ЖТ (рис. 2, а). Аденовирусные конструкции с геном BMP2 в составе ГАМ не влияли на жизнеспособность клеток. Включение PRP в состав PLGA-матриксов обеспечивало статистически значимое увеличению количества жизнеспособных клеток по сравнению с контролем и матриксами без тромбоцитарного геля на 1-е и на 7-е сутки.

Рис. 2. Оценка цитосовместимости ГАМ на основе PLGA и PRP при инкубации с ММСК ЖТ.

а — относительная жизнеспособность клеток, МТТ-тест, * — p<0,05 (по сравнению с контролем); б, в — адгезия ММСК ЖТ на поверхности ГАМ через 1 (б) и 7 сут (в), клетки, окрашенные PKH-26 (красный), живые клетки, окрашенные кальцеином AM (зеленый), и мертвые клетки, окрашенные DAPI (синий), флуоресцентная микроскопия, ув. ×4. ГАМ — ген-активированные матриксы; PLGA — (поли(L-лактид-со-)гликолид; PRP — богатая тромбоцитами плазма; ММСК ЖТ — мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани.

Методом флуоресцентной микроскопии показана адгезия ММСК ЖТ на поверхности всех исследуемых матриксов на первые сутки (рис. 2, б). К 7-м суткам количество адгезированных клеток существенно увеличивалось, что свидетельствует об их активной пролиферации на матриксах (рис. 2, в). Окрашивание ММСК ЖТ кальцеином АМ и DAPI подтвердило цитосовместимость всех исследуемых матриксов: среди большинства живых клеток встречаются единичные мертвые. При этом на матриксах с добавлением тромбоцитарного геля было адгезировано больше клеток, чем на образцах без PRP. Аденовирусные конструкции с геном BMP2 в составе матриксов не оказывали влияния на адгезивные свойства ГАМ.

Ранее биосовместимость матриксов на основе PLGA была подтверждена в различных исследованиях in vitro и in vivo [4, 14]. Включение в состав матриксов на основе PLGA тромбоцитарного геля приводило к существенному увеличению скорости пролиферации клеток. Подобные результаты также получены в других исследованиях с использованием различных синтетических и прородных материалов [8, 12, 15, 16]. Такой эффект может быть обусловлен наличием ростовых факторов, входящих в состав PRP.

Оценка эффективности трансдукции ММСК ЖТ аденовирусными конструкциями с геном BMP2, импрегнированными в матриксы на основе PLGA и PRP. При культивировании ММСК ЖТ в присутствии ГАМ PLGA-Ad и PLGA-Ad + PRP через 14 сут наблюдалось статистически значимое повышение уровня экспрессии гена BMP2 в 2,9±0,1 и 2,8±0,6 раза соответственно относительно контрольной группы (рис. 3). Таким образом, аденовирусные конструкции с геном BMP2, высвобождающиеся из матриксов на основе PLGA и тромбоцитарного геля, эффективно трансдуцировали ММСК ЖТ.

Рис. 3. Относительная экспрессия гена BMP2 после инкубации ММСК ЖТ с ГАМ на основе PLGA и PRP, ПЦР-РВ.

* — p<0,05 (по сравнению с контролем). ММСК ЖТ — мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани; ГАМ — ген-активированные матриксы; PLGA — (поли(L-лактид-со-)гликолид; PRP — богатая тромбоцитами плазма; ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Исследование остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ после инкубации с ГАМ на основе PLGA и PRP. Инкубация клеток с ГАМ индуцировала остеогенную дифференцировку ММСК ЖТ (рис. 4). Наблюдалось повышение уровней экспрессии генов маркеров остеогенеза: экспрессия генов Bglap, Spp1 и Alpl в клетках после культивирования с PLGA-Ad увеличивалась в 3,6±1,2, 2,2±1,2 и 3,0±1,0 раза соответственно по сравнению с контрольной группой. При этом в клетках после инкубации с PLGA-Ad + PRP уровни экспрессии этих генов увеличились значительно сильнее — в 8,9±2,0, 14,0±5,0 и 18,2±3,2 раза соответственно. Кроме того, активность Alpl в ММСК ЖТ в присутствии матриксов PLGA-Ad и PLGA-Ad + PRP увеличилась в 3,7±0,8 и 5,0±0,1 раза соответственно. Эти данные свидетельствуют, что добавление тромбоцитарного геля в состав матриксов на основе PLGA существенно усиливает остеоиндуктивные свойства ГАМ.

Рис. 4. Относительный уровень экспрессии генов маркеров остеогенной дифференцировки (ПЦР-РВ) и активность Alpl (спектрофотометрия) через 14 сут после инкубации ММСК ЖТ с ГАМ на основе PLGA и PRP.

* — p<0,05 (по сравнению с контролем). а — Bglap; б — Spp1; в — Alpl; г — активность Alpl. ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в режиме реального времени; ММСК ЖТ — мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани; ГАМ — ген-активированные матриксы; PLGA — (поли(L-лактид-со-)гликолид; PRP — богатая тромбоцитами плазма.

Добавление в состав ГАМ тромбоцитарного геля не влияло на уровень экспрессии целевого гена BMP2 по сравнению с матриксами без нее. При этом остеогенная дифференцировка ММСК, которые культивировали в присутствии ГАМ с добавлением PRP, была значительно выше. Эти данные подтверждают, что PRP играет важную роль в остеоиндукции и может способствовать ускорению восстановления костной ткани. Аналогичные данные получены в других исследованиях с использованием полилактидных микрочастиц [12] или матриксов на основе коллагена [16] с добавлением PRP, импрегнированных полиплексами с геном BMP2. Однако используемые в настоящем исследовании 3D-матриксы более перспективны для применения в регенеративной медицине благодаря возможности моделирования в соответствии с формой дефекта.

Заключение

Разработанные ген-активированные матриксы на основе (поли(L-лактид-со-)гликолиада и богатой тромбоцитами плазмы демонстрируют высокую цитосовместимость и способность поддерживать адгезию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани. Аденовирусные конструкции с геном BMP2, высвобождающиеся из матриксов, обеспечивают эффективную трансдукцию клеток и индуцируют остеогенную дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани. Добавление тромбоцитарного геля в состав ген-активированных матриксов обеспечивает не только статистически значимое усиление пролиферации клеток, но и способствует увеличению экспрессии ключевых остеогенных маркеров и активности щелочной фосфатазы по сравнению с ген-активированными матриксами без богатой тромбоцитами плазмы, что свидетельствует о синергетическом эффекте аденовирусных конструкций с геном BMP2 и факторов роста, входящих в состав богатой тромбоцитами плазмы. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о преимуществах комбинированной терапии, а разработанный ген-активированный матрикс на основе (поли(L-лактид-со-)гликолида, богатой тромбоцитами плазмы и аденовирусные векторы с целевым геном костного морфогенетического белка 2-го типа является перспективным остеопластическим материалом и при подтверждении эффективности и безопасности в доклинических и клинических исследованиях может применяться в области клинической медицины для восполнения костных дефектов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-15-00425-П).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.