Среди факторов, осложняющих беременность и нарушающих нормальное развитие плода, важная роль принадлежит дисфункции плаценты, сопровождающейся различными изменениями в этом органе и, как следствие, модификацией взаимосвязей во всей системе мать—плацента—плод [1]. Плацентарная недостаточность (ПН) является одной из важных проблем акушерства, пери- и неонатологии [2]. С патологией плаценты непосредственно связаны 20% случаев перинатальной смерти [3, 4]. Однако, несмотря на имеющиеся в настоящее время данные по изучению функционально-метаболических нарушений при ПН [5], частота данной патологии во всем мире до настоящего времени остается достаточно высокой [6]. Это обосновывает актуальность дальнейшего исследования клеточно-молекулярных механизмов формирования ПН.

Аминокислотный баланс в системе мать—плацента—плод и особенно в плаценте, являющейся основным поставщиком трофических компонентов плоду, во многом определяет течение гестационного периода, нормальное функционирование плаценты, процессы роста и развития плода. Помимо участия в биосинтезе белков, аминокислоты выполняют многочисленные самостоятельные функции как предшественники биоактивных соединений, активаторы пролиферативных реакций, интенсивно протекающих в фетоплацентарном комплексе, регуляторы иммунного ответа и ионного равновесия, индукторы синтеза гормонов, участники энергетического обмена [7—10]. В то же время наиболее важную роль они играют как составные части белковых молекул, определяющие их структуру и пространственную организацию.

Имеются лишь единичные работы, посвященные изучению при ПН свободных аминокислот, а также аминокислот, входящих в состав белковых молекул и формирующих их первичную структуру [11, 12]. Однако отсутствуют данные об аминокислотах, нековалентно связанных с белками (т.е. не входящих в состав пептидной цепи) менее прочными связями: ионными, водородными, гидрофобными и дисульфидными. Эти связанные аминокислоты, являясь регуляторами вторичной и третичной структур, стабилизируют белковую молекулу. Поддержание нативного состояния всех структурных уровней белковой молекулы служит условием сохранения физико-химических свойств белков, необходимых для выполнения их многочисленных функций: регуляторных, пластических, транспортных, ферментативных, гормональных, позволяющих белкам играть ключевую роль во всех молекулярных процессах [13, 14].

Цель настоящей работы — изучение содержания аминокислот, нековалентно связанных с цитоплазматическими белками, в плаценте при физиологической беременности и ПН для уточнения молекулярных механизмов развития этой акушерской патологии.

В проспективное исследование включены 57 женщин в возрасте 24—30 лет, составившие две группы: 1-я (контрольная) группа представлена 27 практически здоровыми женщинами с неосложненным течением беременности и родов. Во 2-ю (основная) группу вошли 30 женщин, беременность которых осложнилась дисфункцией плаценты, верифицированной после родов. По возрасту, индексу массы тела, соматическому, акушерско-гинекологическому анамнезу, паритету беременностей и родов пациентки обеих групп были сопоставимы. В обеих группах преобладали первородящие женщины: в основной группе они составили 63,4%, в контрольной — 61,2%. В анамнезе прерывание беременности по желанию женщины было в 22,1 и 23,7% наблюдений соответственно в основной и контрольной группах. Самопроизвольные аборты у всех пациенток отсутствовали. Хронические заболевания имелись у 18,5 и 20% женщин соответственно. У пациенток обеих групп питание было полноценным и сбалансированным по основным ингредиентам, в том числе по аминокислотам и белкам. Масса тела у них до наступления беременности была нормальной. Во время беременности отмечались адекватные прибавки массы тела. Обследованные пациентки наблюдались в консультативной поликлинике Ростовского НИИ акушерства и педиатрии в рамках программы «Акушерский мониторинг». Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом института.

Критериями исключения из исследования служили инфекционные заболевания, декомпенсированные формы соматических заболеваний, многоплодная и недоношенная беременность, признаки преэклампсии и задержки роста плода, аутоиммунная патология, отсутствие информированного согласия на расширенный протокол исследования.

Критериями при постановке диагноза (и для включения в основную группу) служили снижение фето- и маточно-плацентарного кровотока при допплерометрии без признаков централизации кровообращения. Скрининговое УЗИ с допплерометрией выполняли в сроке 30—34 нед (в соответствии с приказами МЗ РФ). Основным показателем дисфункции плаценты явились умеренные нарушения кровотока, соответствующие изменению гемодинамики I степени по классификации А.Н. Стрижакова (1988). Изолированные нарушения кровотока только в маточно-плацентарном звене (Ia стадия) были выявлены у 90,6% пациенток основной группы, в плодово-плацентарном (Iб стадия) — у 9,4% пациенток этой группы. При динамическом контроле (один раз в 10—14 дней) прогрессирования степени гемодинамических отклонений не отмечалось. Кроме того, у женщин основной группы наблюдались начальные проявления гипоксии плода по данным кардиотокографии, уменьшение активности специфических плацентарных изоферментов глутаматдегидрогеназы и термостабильной щелочной фосфатазы, снижение уровня плацентарного лактогена и прогестерона. По показателям ультразвуковой фетометрии отставание роста плода отсутствовало. Гистологическое исследование плаценты, проведенное на парафиновых препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином (использован микроскоп Nikon Eclipse 80i), выявило патологические изменения, являющиеся морфологическими критериями плацентарной недостаточности, — фиброз стромы ворсин, выпадение фибрина, вариант хаотичных склерозированных ворсин и эмбриональных ворсин, участки кальциноза, гиперваскуляризацию ворсин, кровоизлияние в строму ворсин. Выявленный признак считался положительным, если был отмечен более чем в 5 полях зрениях при анализе 10 полей при увеличении микроскопа ×100. Анализ исходов родов в основной группе показал, что средняя масса тела и длина новорожденного, составившие 3412±273,25 г и 52,24±2,01 см, массо-ростовой коэффициент 65,36±3,05 статистически значимо не отличались от таковых в контрольной группе (3485±286,45 г и 53,12±2,15 см, массо-ростовой коэффициент — 66,12±3,29), что сочеталось с данными ультразвуковой фетометрии. Дети у пациенток основной группы родились в асфиксии средней степени тяжести с оценкой по шкале Апгар 4—7 баллов с явлениями дыхательной недостаточности различной степени выраженности и метаболического ацидоза. У 10 новорожденных наблюдали цианоз кожных покровов и приглушенность сердечных тонов. В контрольной группе все новорожденные были клинически здоровыми с оценкой по шкале Апгар 8—10 баллов.

Материалом для исследования служила ткань плаценты. Образцы плаценты получали сразу после родов при соблюдении холодового режима (температура 2—4 °C). Для исследования брали центральную часть макроскопически нормальных участков плацентарного диска, включая плодовую и материнскую поверхности (без крупных сосудов, кровоизлияний, кальцификации, некроза, отложений фибрина). Вырезанные образцы (10 г) промывали охлажденным изотоническим раствором натрия хлорида для удаления остатков крови и амниотической жидкости, затем гомогенизировали (при температуре 4 °C) в 0,25 М растворе сахарозы, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-HCl (рН 7,4) в присутствии ингибиторов протеаз с помощью гомогенизатора Ultra-Turrax. Гомогенаты подвергали дифференциальному центрифугированию, осаждали ядра и митохондрии и получали супернатант после ультрацентрифугирования при 105 000 об/мин в течение 60 мин, который служил источником цитоплазматических белков. Разделение связанных и свободных аминокислот с помощью многоступенчатой обработки солевыми растворами проводили по методу Эллиота с некоторыми модификациями [15]. Количественное определение фракций связанных и свободных аминокислот осуществляли на автоматическом анализаторе ААА-400. Подготовку проб к анализу проводили согласно инструкции к анализатору по стандартной программе с использованием трех натрий-цитратных буферных растворов с рН 3,25, 4,25, 5,28. Скорость тока — 70 мл/ч. Идентификацию аминокислот, расчет площадей пиков и определение концентрации осуществляли по результатам анализа соответствующих стандартов для калибровки прибора.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0 фирмы «StatSoft Inc.»). Оценка характера распределения данных с помощью критерия Шапиро—Уилка свидетельствует об их нормальном распределении. Данные представлены в виде среднего значения (M) и стандартной ошибки среднего (m). Статистическую значимость различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) для независимых выборок. Результаты оценивали как статистически значимые при р<0,05.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в плаценте, подобно другим органам, общий фонд аминокислот слагается из двух фракций: истинно свободных и нековалентно связанных с высокомолекулярными компонентами клеток, в частности с белками (см. таблицу).

Присоединение связанных форм аминокислот к аминокислотам (особенно боковым), входящим в состав белковой молекулы, меняет состояние акцепторных групп протеинов. Так, увеличение при ПН заряженных полярных аминокислот: глутаминовой, аспарагиновой и лизина — по сравнению с гидрофобными метионином, аланином, валином и лейцином нарушает степень электростатических взаимодействий, что дестабилизирует структуру белка. К аналогичным последствиям приводит уменьшение в плаценте при ПН количества незаряженных полярных аминокислот — треонина, серина, глутамина. Обнаруженное снижение связанной формы цистеина может служить причиной модификации дисульфидных связей между этой формой аминокислоты и остатками концевого цистеина в белковой молекуле, что тоже вносит негативный вклад в регуляторные возможности белков.

Что касается ароматических аминокислот, в частности гистидина, содержащего имидазольную группу, то снижение уровня его связанной формы при ПН, несомненно, понижает защищенность ряда участков полипептидной цепи к действию протеолитических ферментов, которые повреждают структуру белков. Уменьшение в плаценте женщин 2-й группы содержания связанной формы еще одной диаминокислоты — аргинина, характеризующегося сильно ионизированным гидроксильным радикалом, по-видимому, приводит к нарушению таких белковых характеристик, как величина полярности, электрокинетические свойства. Кроме того, изменение содержания связанных форм описанных диаминокислот (гистидина и аргинина) может менять доступность карбоксильных групп белков для образования водородных связей с гидроксилами фенольных радикалов тирозина [17]. Поддержание нормальных величин данных связей, как уже указывалось, необходимо для формирования вторичной структуры белков, прежде всего, степени спирализации и растворимости, поэтому снижение их уровня приводит к нарушению важных характеристик белковой молекулы. Следует подчеркнуть, что отрицательные последствия этих изменений имеют особую значимость, когда касаются цитоплазматических белков, в состав которых входят специфические протеины беременности [18, 19].

Все обнаруженные при ПН модификации плацентарных связанных форм аминокислот способны также нарушать комплексирование белков с другими макро- и микрокомпонентами, в частности с нуклеиновыми кислотами и нуклеотидами. Именно такие сложные белки весьма необходимы для обеспечения многих метаболических процессов [16, 20].

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что развитие ПН происходит на фоне изменения связывания аминокислот нековалентными связями с белковыми молекулами, что модифицирует их структуру, физико-химические свойства и, следовательно, различные регуляторные функции, особенно необходимые для такого быстро развивающегося органа, как плацента. Выявленные отклонения в балансе связанных форм аминокислот и их влияние на многофункциональные цитоплазматические белки плацентарной ткани, по-видимому, являются важными звеньями в общей цепи молекулярно-биохимических нарушений при ПН не только в плаценте, но и в фетоплацентарном комплексе в целом.

Результаты настоящего исследования позволяют расширить наши представления о механизмах формирования и дальнейшего развития ПН.

Содержание плацентарных аминокислот, не входящих в состав белков, но связанных с ними непрочными связями: гидроксильными, водородными, гидрофобными и др., — при ПН отличается от такового при физиологической беременности.

Увеличение связывания с цитоплазматическими белками при ПН отмечается для дикарбоновых аминокислот — глутаминовой и аспарагиновой, а также лизина и глицина. Противоположная направленность изменений при ПН обнаружена для гистидина, аргинина, треонина, серина, цистеина и метионина, уровень связанных форм которых снижается.

Разнонаправленные отклонения содержания гидрофобных и гидрофильных аминокислот, в том числе положительно и отрицательно заряженных, модифицируют структуру участков полипептидной цепи, с которыми аминокислоты нековалентно связываются. Эти модификации, несомненно, отражаются на свойствах белковых молекул и их функциональной активности, которые определяют механизм развития молекулярно-биохимических нарушений при плацентарной недостаточности.

Сведения об авторах

Погорелова Т.Н. — д.б.н., проф.; e-mail: tnp.rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-0400-0652;

Гунько В.О. — к.б.н.; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8607-9052;

Никашина А.А. — к.б.н.; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8099-9093;

Каушанская Л.В. — д.м.н.; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8574-6394;

Аллилуев И.А. — м.н.с., преподаватель кафедры биохимии и микробиологии; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-7654-0650;

Ларичкин А.В. — м.н.с.; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-1207-0554

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Никашина А.А., Каушанская Л.В., Аллилуев И.А., Ларичкин А.В. Модификация связывания аминокислот с цитоплазматическими белками плаценты при осложненной беременности. Российский вестник акушера-гинеколога. 2019;19(6):-10. https://doi.org/10.17116/rosakush201919061