Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Погорелова Т.Н.

Ростовский НИИ акушерства и педиатрии

Гунько В.О.

Ростовский НИИ акушерства и педиатрии

Никашина А.А.

ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Минздрава России, Ростов-на-Дону, Россия

Каушанская Л.В.

Научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, Ростов-на-Дону, Россия

Аллилуев И.А.

НИИ акушерства и педиатрии ФГБУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, Ростов-на-Дону, Россия;
Академия биологии и биотехнологии Южного федерального университета, Ростов-на-Дону, Россия

Ларичкин А.В.

Научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии Ростовского государственного медицинского университета Минздрава России, Ростов-на-Дону, Россия

Модификация связывания аминокислот с цитоплазматическими белками плаценты при осложненной беременности

Авторы:

Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Никашина А.А., Каушанская Л.В., Аллилуев И.А., Ларичкин А.В.

Подробнее об авторах

Журнал: Российский вестник акушера-гинеколога. 2019;19(6): 5‑10

Просмотров: 702

Загрузок: 11

Как цитировать:

Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Никашина А.А., Каушанская Л.В., Аллилуев И.А., Ларичкин А.В. Модификация связывания аминокислот с цитоплазматическими белками плаценты при осложненной беременности. Российский вестник акушера-гинеколога. 2019;19(6):5‑10.
Pogorelova TN, Gun'ko VO, Nikashina AA, Kaushanskaya LV, Alliluev IA, Larichkin AV. Modification of binding of amino acids with placental cytoplasmic proteins in complicated pregnancy. Russian Bulletin of Obstetrician-Gynecologist. 2019;19(6):5‑10. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/rosakush2019190615

?>

Введение

Среди факторов, осложняющих беременность и нарушающих нормальное развитие плода, важная роль принадлежит дисфункции плаценты, сопровождающейся различными изменениями в этом органе и, как следствие, модификацией взаимосвязей во всей системе мать—плацента—плод [1]. Плацентарная недостаточность (ПН) является одной из важных проблем акушерства, пери- и неонатологии [2]. С патологией плаценты непосредственно связаны 20% случаев перинатальной смерти [3, 4]. Однако, несмотря на имеющиеся в настоящее время данные по изучению функционально-метаболических нарушений при ПН [5], частота данной патологии во всем мире до настоящего времени остается достаточно высокой [6]. Это обосновывает актуальность дальнейшего исследования клеточно-молекулярных механизмов формирования ПН.

Аминокислотный баланс в системе мать—плацента—плод и особенно в плаценте, являющейся основным поставщиком трофических компонентов плоду, во многом определяет течение гестационного периода, нормальное функционирование плаценты, процессы роста и развития плода. Помимо участия в биосинтезе белков, аминокислоты выполняют многочисленные самостоятельные функции как предшественники биоактивных соединений, активаторы пролиферативных реакций, интенсивно протекающих в фетоплацентарном комплексе, регуляторы иммунного ответа и ионного равновесия, индукторы синтеза гормонов, участники энергетического обмена [7—10]. В то же время наиболее важную роль они играют как составные части белковых молекул, определяющие их структуру и пространственную организацию.

Имеются лишь единичные работы, посвященные изучению при ПН свободных аминокислот, а также аминокислот, входящих в состав белковых молекул и формирующих их первичную структуру [11, 12]. Однако отсутствуют данные об аминокислотах, нековалентно связанных с белками (т.е. не входящих в состав пептидной цепи) менее прочными связями: ионными, водородными, гидрофобными и дисульфидными. Эти связанные аминокислоты, являясь регуляторами вторичной и третичной структур, стабилизируют белковую молекулу. Поддержание нативного состояния всех структурных уровней белковой молекулы служит условием сохранения физико-химических свойств белков, необходимых для выполнения их многочисленных функций: регуляторных, пластических, транспортных, ферментативных, гормональных, позволяющих белкам играть ключевую роль во всех молекулярных процессах [13, 14].

Цель настоящей работы — изучение содержания аминокислот, нековалентно связанных с цитоплазматическими белками, в плаценте при физиологической беременности и ПН для уточнения молекулярных механизмов развития этой акушерской патологии.

Материал и методы

В проспективное исследование включены 57 женщин в возрасте 24—30 лет, составившие две группы: 1-я (контрольная) группа представлена 27 практически здоровыми женщинами с неосложненным течением беременности и родов. Во 2-ю (основная) группу вошли 30 женщин, беременность которых осложнилась дисфункцией плаценты, верифицированной после родов. По возрасту, индексу массы тела, соматическому, акушерско-гинекологическому анамнезу, паритету беременностей и родов пациентки обеих групп были сопоставимы. В обеих группах преобладали первородящие женщины: в основной группе они составили 63,4%, в контрольной — 61,2%. В анамнезе прерывание беременности по желанию женщины было в 22,1 и 23,7% наблюдений соответственно в основной и контрольной группах. Самопроизвольные аборты у всех пациенток отсутствовали. Хронические заболевания имелись у 18,5 и 20% женщин соответственно. У пациенток обеих групп питание было полноценным и сбалансированным по основным ингредиентам, в том числе по аминокислотам и белкам. Масса тела у них до наступления беременности была нормальной. Во время беременности отмечались адекватные прибавки массы тела. Обследованные пациентки наблюдались в консультативной поликлинике Ростовского НИИ акушерства и педиатрии в рамках программы «Акушерский мониторинг». Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом института.

Критериями исключения из исследования служили инфекционные заболевания, декомпенсированные формы соматических заболеваний, многоплодная и недоношенная беременность, признаки преэклампсии и задержки роста плода, аутоиммунная патология, отсутствие информированного согласия на расширенный протокол исследования.

Критериями при постановке диагноза (и для включения в основную группу) служили снижение фето- и маточно-плацентарного кровотока при допплерометрии без признаков централизации кровообращения. Скрининговое УЗИ с допплерометрией выполняли в сроке 30—34 нед (в соответствии с приказами МЗ РФ). Основным показателем дисфункции плаценты явились умеренные нарушения кровотока, соответствующие изменению гемодинамики I степени по классификации А.Н. Стрижакова (1988). Изолированные нарушения кровотока только в маточно-плацентарном звене (Ia стадия) были выявлены у 90,6% пациенток основной группы, в плодово-плацентарном (Iб стадия) — у 9,4% пациенток этой группы. При динамическом контроле (один раз в 10—14 дней) прогрессирования степени гемодинамических отклонений не отмечалось. Кроме того, у женщин основной группы наблюдались начальные проявления гипоксии плода по данным кардиотокографии, уменьшение активности специфических плацентарных изоферментов глутаматдегидрогеназы и термостабильной щелочной фосфатазы, снижение уровня плацентарного лактогена и прогестерона. По показателям ультразвуковой фетометрии отставание роста плода отсутствовало. Гистологическое исследование плаценты, проведенное на парафиновых препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином (использован микроскоп Nikon Eclipse 80i), выявило патологические изменения, являющиеся морфологическими критериями плацентарной недостаточности, — фиброз стромы ворсин, выпадение фибрина, вариант хаотичных склерозированных ворсин и эмбриональных ворсин, участки кальциноза, гиперваскуляризацию ворсин, кровоизлияние в строму ворсин. Выявленный признак считался положительным, если был отмечен более чем в 5 полях зрениях при анализе 10 полей при увеличении микроскопа ×100. Анализ исходов родов в основной группе показал, что средняя масса тела и длина новорожденного, составившие 3412±273,25 г и 52,24±2,01 см, массо-ростовой коэффициент 65,36±3,05 статистически значимо не отличались от таковых в контрольной группе (3485±286,45 г и 53,12±2,15 см, массо-ростовой коэффициент — 66,12±3,29), что сочеталось с данными ультразвуковой фетометрии. Дети у пациенток основной группы родились в асфиксии средней степени тяжести с оценкой по шкале Апгар 4—7 баллов с явлениями дыхательной недостаточности различной степени выраженности и метаболического ацидоза. У 10 новорожденных наблюдали цианоз кожных покровов и приглушенность сердечных тонов. В контрольной группе все новорожденные были клинически здоровыми с оценкой по шкале Апгар 8—10 баллов.

Материалом для исследования служила ткань плаценты. Образцы плаценты получали сразу после родов при соблюдении холодового режима (температура 2—4 °C). Для исследования брали центральную часть макроскопически нормальных участков плацентарного диска, включая плодовую и материнскую поверхности (без крупных сосудов, кровоизлияний, кальцификации, некроза, отложений фибрина). Вырезанные образцы (10 г) промывали охлажденным изотоническим раствором натрия хлорида для удаления остатков крови и амниотической жидкости, затем гомогенизировали (при температуре 4 °C) в 0,25 М растворе сахарозы, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-HCl (рН 7,4) в присутствии ингибиторов протеаз с помощью гомогенизатора Ultra-Turrax. Гомогенаты подвергали дифференциальному центрифугированию, осаждали ядра и митохондрии и получали супернатант после ультрацентрифугирования при 105 000 об/мин в течение 60 мин, который служил источником цитоплазматических белков. Разделение связанных и свободных аминокислот с помощью многоступенчатой обработки солевыми растворами проводили по методу Эллиота с некоторыми модификациями [15]. Количественное определение фракций связанных и свободных аминокислот осуществляли на автоматическом анализаторе ААА-400. Подготовку проб к анализу проводили согласно инструкции к анализатору по стандартной программе с использованием трех натрий-цитратных буферных растворов с рН 3,25, 4,25, 5,28. Скорость тока — 70 мл/ч. Идентификацию аминокислот, расчет площадей пиков и определение концентрации осуществляли по результатам анализа соответствующих стандартов для калибровки прибора.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0 фирмы «StatSoft Inc.»). Оценка характера распределения данных с помощью критерия Шапиро—Уилка свидетельствует об их нормальном распределении. Данные представлены в виде среднего значения (M) и стандартной ошибки среднего (m). Статистическую значимость различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) для независимых выборок. Результаты оценивали как статистически значимые при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в плаценте, подобно другим органам, общий фонд аминокислот слагается из двух фракций: истинно свободных и нековалентно связанных с высокомолекулярными компонентами клеток, в частности с белками (см. таблицу).

Содержание свободных и связанных аминокислот в плаценте при физиологической беременности и ПН (M±m) Примечание. Статистическая значимость различий при физиологической беременности и ПН между показателями: р1 — свободных аминокислот; р2 — связанных аминокислот.
Среди всех изученных аминокислот преобладает свободная форма. При физиологической беременности коэффициент отношения свободных аминокислот к связанным колеблется в пределах 2,3—6,6. Наибольшая часть связанной формы от общего уровня аминокислот обнаружена у лизина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также цистеина, тирозина и фенилаланина, что нашло отражение в низком коэффициенте соотношения разных форм (2,4—3,6). При беременности, осложненной ПН, содержание обеих форм большинства аминокислот изменялось по сравнению с таковым в плаценте женщин контрольной группы. Увеличение связывания с белковыми молекулами отмечено для дикарбоновых аминокислот: глутаминовой и аспарагиновой кислот (в среднем на 30%), лизина (на 32,1%) и глицина (на 23,1%). Для этих аминокислот характерно также повышение общего количества их связанной и свободной форм. Противоположная направленность при ПН наблюдалась для гистидина, аргинина, треонина, серина, глутамина, цистеина, уровень которых снижался в пределах 12—26%. Однако даже незначительные отклонения в концентрации связанных форм аминокислот, очевидно, сопровождаются нарушением, прежде всего, вторичной структуры белков, формирующейся с помощью большого количества водородных связей и электростатических взаимодействий [16].

Присоединение связанных форм аминокислот к аминокислотам (особенно боковым), входящим в состав белковой молекулы, меняет состояние акцепторных групп протеинов. Так, увеличение при ПН заряженных полярных аминокислот: глутаминовой, аспарагиновой и лизина — по сравнению с гидрофобными метионином, аланином, валином и лейцином нарушает степень электростатических взаимодействий, что дестабилизирует структуру белка. К аналогичным последствиям приводит уменьшение в плаценте при ПН количества незаряженных полярных аминокислот — треонина, серина, глутамина. Обнаруженное снижение связанной формы цистеина может служить причиной модификации дисульфидных связей между этой формой аминокислоты и остатками концевого цистеина в белковой молекуле, что тоже вносит негативный вклад в регуляторные возможности белков.

Что касается ароматических аминокислот, в частности гистидина, содержащего имидазольную группу, то снижение уровня его связанной формы при ПН, несомненно, понижает защищенность ряда участков полипептидной цепи к действию протеолитических ферментов, которые повреждают структуру белков. Уменьшение в плаценте женщин 2-й группы содержания связанной формы еще одной диаминокислоты — аргинина, характеризующегося сильно ионизированным гидроксильным радикалом, по-видимому, приводит к нарушению таких белковых характеристик, как величина полярности, электрокинетические свойства. Кроме того, изменение содержания связанных форм описанных диаминокислот (гистидина и аргинина) может менять доступность карбоксильных групп белков для образования водородных связей с гидроксилами фенольных радикалов тирозина [17]. Поддержание нормальных величин данных связей, как уже указывалось, необходимо для формирования вторичной структуры белков, прежде всего, степени спирализации и растворимости, поэтому снижение их уровня приводит к нарушению важных характеристик белковой молекулы. Следует подчеркнуть, что отрицательные последствия этих изменений имеют особую значимость, когда касаются цитоплазматических белков, в состав которых входят специфические протеины беременности [18, 19].

Все обнаруженные при ПН модификации плацентарных связанных форм аминокислот способны также нарушать комплексирование белков с другими макро- и микрокомпонентами, в частности с нуклеиновыми кислотами и нуклеотидами. Именно такие сложные белки весьма необходимы для обеспечения многих метаболических процессов [16, 20].

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что развитие ПН происходит на фоне изменения связывания аминокислот нековалентными связями с белковыми молекулами, что модифицирует их структуру, физико-химические свойства и, следовательно, различные регуляторные функции, особенно необходимые для такого быстро развивающегося органа, как плацента. Выявленные отклонения в балансе связанных форм аминокислот и их влияние на многофункциональные цитоплазматические белки плацентарной ткани, по-видимому, являются важными звеньями в общей цепи молекулярно-биохимических нарушений при ПН не только в плаценте, но и в фетоплацентарном комплексе в целом.

Результаты настоящего исследования позволяют расширить наши представления о механизмах формирования и дальнейшего развития ПН.

Заключение

Содержание плацентарных аминокислот, не входящих в состав белков, но связанных с ними непрочными связями: гидроксильными, водородными, гидрофобными и др., — при ПН отличается от такового при физиологической беременности.

Увеличение связывания с цитоплазматическими белками при ПН отмечается для дикарбоновых аминокислот — глутаминовой и аспарагиновой, а также лизина и глицина. Противоположная направленность изменений при ПН обнаружена для гистидина, аргинина, треонина, серина, цистеина и метионина, уровень связанных форм которых снижается.

Разнонаправленные отклонения содержания гидрофобных и гидрофильных аминокислот, в том числе положительно и отрицательно заряженных, модифицируют структуру участков полипептидной цепи, с которыми аминокислоты нековалентно связываются. Эти модификации, несомненно, отражаются на свойствах белковых молекул и их функциональной активности, которые определяют механизм развития молекулярно-биохимических нарушений при плацентарной недостаточности.

Сведения об авторах

Погорелова Т.Н. — д.б.н., проф.; e-mail: tnp.rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-0400-0652;

Гунько В.О. — к.б.н.; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8607-9052;

Никашина А.А. — к.б.н.; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8099-9093;

Каушанская Л.В. — д.м.н.; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8574-6394;

Аллилуев И.А. — м.н.с., преподаватель кафедры биохимии и микробиологии; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-7654-0650;

Ларичкин А.В. — м.н.с.; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-1207-0554

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Никашина А.А., Каушанская Л.В., Аллилуев И.А., Ларичкин А.В. Модификация связывания аминокислот с цитоплазматическими белками плаценты при осложненной беременности. Российский вестник акушера-гинеколога. 2019;19(6):-10. https://doi.org/10.17116/rosakush201919061

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail