Основные изменения нормальной микрофлоры пародонта при хроническом генерализованном пародонтите, выявленные с помощью метагеномного секвенирования

Хронический генерализованный пародонтит — инфекционно-воспалительный процесс, который характеризуется прогрессивной деструкцией пародонтальной связки и костной ткани альвеолы, приводящей к выпадению зубов [1]. Пародонтит является полиэтиологичным заболеванием, вызванным как генетическими, так и внешними факторами, такими как неудовлетворительная гигиена полости рта, характер питания, патология прикуса, мелкое преддверие полости рта, присутствие ортодонтических или ортопедических конструкций. Также одной из основных причин данного заболевания является неблагоприятный генотип пациента [2].

На сегодняшний день существует несколько исследований, в которых описывается анализ пародонтальной микрофлоры, выполненный с помощью генетических анализаторов второго поколения [3] и технологий микрочипа HOMIM [4]. Однако в этих работах рассматривались патогенные бактерии, а не нормальная микрофлора. Более того, пять самых известных пародонтопатогенов, такие как Aggregatibacteractinomicetecomitans, Porphyromonasgingivalis, Prevotellaintermedia, Treponemadenticola и Tannerellaforsythia, как правило, определяются с помощью обычных наборов для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Хотя негативное влияние этих бактерий очевидно, анализ соотношения между ними и ключевыми компонентами нормальной пародонтальной микрофлоры представляет собой наиболее уместный способ оценки состояния микрофлоры полости рта в целом. За счет этого становится более точным количественный анализ ПЦР, лучше выявляются механизмы, стабилизирующие пародонтальную микрофлору пациентов, становится возможным проведение исследований различных средств индивидуальной гигиены полости рта. Они должны не просто снижать количество нежелательных микроорганизмов, но и оптимизировать соотношение между желательными и нежелательными бактериями с учетом их симбиотических и антагонистических отношений.

Большинство операционных таксономических единиц (ОТЕ), которые мы использовали в своем исследовании, имеют статус рода, в то время как предыдущие исследователи работали с меньшими [5] или большими [6] таксонами.

В исследовании принимали участие пациенты с хроническим генерализованным пародонтитом (ХГП) и лица без заболевания пародонта (1-я группа — 10 пациентов со здоровым пародонтом, 2-я группа — 7 пациентов с ХГП). Данный проект является пилотным. Небольшая выборка пациентов обусловлена тем, что данный метод впервые испытывается в пародонтологии. Пациентов включали в исследование при условии подписания информированного согласия. Оценивали степень тяжести заболевания, наличие гноетечения из пародонтальных карманов, степень подвижности зубов, гигиенический индекс Силнесс-Лоэ, индекс кровоточивости Мюллемана. Также учитывали количество ежегодных обострений и неблагоприятную наследственность.

Пробы брали с помощью стерильных бумажных штифтов (4 пробы у каждого пациента: по две пробы, А из пародонтального кармана (ПК) в области жевательной группы зубов и по две пробы Б в области резцов). Штифты погружали в поддесневую область на максимальную глубину на 5 с. Затем каждый штифт помещали в пробирку типа Эппендорф объемом 1,5 мл, в которой было по 0,5 мл физиологического раствора и 1% бычьей сыворотки. Пробы хранили при температуре –20 °C не более 2 нед.

Из содержимого ПК извлекались ДНК (100 мкл каждой пробы, четыре пробы у каждого человека) с помощью комплекта реагентов Проба-ГС (Россия) согласно инструкции производителя. Чистые пробы разбавляли и анализировали с помощью обратной транскриптазной (ОТ) ПЦР комплекта dentoflor, при этом использовали 5 мкл препарата ДНК на реакцию (Россия). С помощью этого комплекта стало возможным определить количество бактериального 16s-РНК, специфические мишени-ДНК пародонтальных патогенов (A. actinomicetecomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. denticola, T. forsythia и Candidaalbicans) и человеческий геном. Пять лучших образцов ДНК из каждой группы исследовались с помощью ПЦР с 16s-РНК специфическими праймерами. Из каждой пробы получилось порядка 10 000 партий.

Полученные цепочки 16s-РНК были отнесены к определенному бактериальному роду с помощью оборудования для автоматического поиска Blast в НЦБИ GenBank. Статистическая разница между количеством каждого бактериального рода у пациентов и в контрольной выборке рассчитывалась с помощью программы Statistica.

В 1-ю группу входили 10 человек со здоровым пародонтом, во 2-ю группу — 7 пациентов с ХГП (табл. 1).

Четыре независимо взятые пробы у каждого человека (два типа, А и два типа Б) обрабатывались с помощью набора Проба-ГС. Собранная бактериальная геномная ДНК в каждой пробе оценивалась с помощью ОТ-ПЦР комплекта dentoflor и выражалась как параметр C_t (пороговый цикл) обратно пропорциональный шаблонной концентрации ДНК. Пробы, в которых C_t превышал 22 цикла, не включали в исследование, чтобы избежать риска непропорциональной потери в них различных бактериальных видов. Другие пробы соответствующей ДНК были приняты.

На этой стадии из 1-й группы были исключены 3 пациента (001, 003 и 009). Во 2-й группе не было лиц с недостаточным качеством ДНК, подтверждая гипотезу о том, что у пациентов с пародонтитом бактериальная колонизация немного выше, чем у лиц со здоровым пародонтом. Затем из 1-й группы были исключены самые молодые пациенты 002 и 008, чтобы число человек не превышало 5. В результате в эту группу вошли лица 38—54 лет со средним C_t, показывающим бактериальный выход ДНК 18,7—21,3 (абсолютная средняя не превышает 6,1 раза).

Во 2-ю группу вошли 5 пациентов 37—45 лет со средним C_t, показывающим бактериальный выход ДНК 16,6—21,8. У 3 пациентов этой группы (306, 308 и 310) был самый высокий выход ДНК, недоступный здоровым лицам (средний C_t 16,6—16,9), в то время как у пациентов 300 и 303 выход был намного меньше по сравнению с 1-й группой (средний C_t 20,0—21,8).

Для секвенирования 16s-РНК ампликона гена мы выбрали в качестве мишени гипервариабельный участок V6, соотносящийся с позициями 984—1047 (Escherichiacoli). Хотя это довольно короткий участок, он успешно отвечает за распознавание различных филотипов [7]. С помощью базы данных Silva был проведен анализ с применением компьютерного моделирования эксперимента, который показал, что более 97% меток V6 можно однозначно поместить на родовой уровень [8]. Кроме того, V6 был не просто гипервариабельным участком 16s-РНК, используемым в первом исследовании NGS метагеномного ампликона [9], но и до сих пор самым применяемым в экологических и медицинских микробиологических проектах [10]. Более того, ампликоны отдельных гипервариабельных участков, у которых нет сохраненных промежуточных фрагментов и коротких мишеней, в целом более склонны к формированию химер, таким образом улучшая качество данных. В результате с помощью Ion Torrent было сгенерировано 4 892 600 показателей последовательности, варьирующихся от 599 933 до 650 416 на пробу, и 314 чипов.

Нижняя обработка последовательностей и фильтрация качества убрали порядка 12,5% данных секвенирования. Большинство последовательностей были исключены из дальнейшего исследования из-за невозможности отследить секвенирование или праймеры амплификации (~8%) и достаточно низких показателей качества (~4,5%). Химерные последовательности были обнаружены только в очень маленьких количествах (менее 1% за пробу). Последовательности каждого набора данных были в дальнейшем обработаны с помощью SLP, за счет чего от 9 до 14% всех данных были компенсированы из-за потенциальных ошибок в секвенировании, в результате чего получилось от 5210 до 8462 уникальных маркеров последовательности за пробу. Кластеры высококачественных показаний на уровне вида, определенные 3%-й разницей в последовательности, породили от 3,499 до 6058 ОТЕ на образец, большинство чего равнялось роду. Исключение одиночных ОТЕ до расчета показателей сообщества уменьшило число ОТЕ примерно на 50%, повлияв только на 0,5% данных секвенирования. Неодиночные ОТЕ варьировались от 1648 до 2659 на пробу.

Для каждой группы пациентов было подсчитано арифметическое значение получившихся данных (% каждой ОТЕ в пробе) (табл. 2). Затем для каждой ОТЕ рассчитывалось значение Т с учетом его релевантности для различения когорт: Т более 3 означало статистически достоверное преобладание ОТЕ в когорте 1 (здоровые лица); Т, равное 2—3, означало, что ОТЕ, скорее, ассоциируется со здоровым фенотипом; Т менее –3 означает статистически достоверную связь ОТЕ с хроническим пародонтитом. Если же величина Т варьируется между –2 и –3, то это значит, что ОТЕ преобладает у пациентов с хроническим пародонтитом. Величина Т между –2 и 2 означает, что появление ОТЕ никак не связано с воспалением пародонта.

Анализ данных табл. 2 показал, что род Veillonella — единственная ОТЕ, четко связанная с высокой степенью сохранности пародонта. Более того, это одна из самых многочисленных бактериальных групп (занимает третье место после Fusobacterium и Prevotella у здоровых лиц). Согласно нашим данным, у пациентов с хроническим пародонтитом количество этих бактерий в 4—5 раз меньше, чем у лиц без заболевания пародонта, что однозначно представляет собой отрицательный клинический признак. Более того, низкая погрешность в параметре С2 свидетельствует об отсутствии пародонтита в случае, когда эта бактерия присутствует в нормальном количестве.

Что касается других пяти ОТЕ, связанных со здоровым пародонтом, то здесь эта корреляция выражена не так явно. Речь идет о Streptococcus, Bergeyella, Granulicatella, Kingella и Corynebacterium.

Обнаружено, что относительно много ОТЕ (8) четко связаны с хроническим пародонтитом. К ним относятся Porphyromonas, Treponema, Synergistaceae, Tannerella, Filifactor, Ruminococcaceae, Parvimonas и Mycoplasma. Интересно, что Treponema, Synergistaceae и Filifactor сильнее всего ассоциируются с ХГП, в то время как известные пародонтопатогены, такие как Porphyromonas и Tannerella, связаны с ХГП лишь частично. Более того, колонизация пародонта родами Prevotella [11] и Aggregatibacter [6] оказалась никак не связана с воспалительными заболеваниями пародонта, хотя они часто считаются самыми опасными инфекционными возбудителями, напрямую ответственными за разрушение тканей пародонта. Возможно, объясняется это тем, что только определенные серотипы A. аctinomycetecomitans имеют пародонтопатогенность, в то время как другие серотипы этих видов, и особенно других видов рода Aggregatibacter, не связаны с хроническим пародонтитом [12].

Учитывая, что данные о клиническом воздействии нескольких ОТЕ (например, Filifactor, Prevotella и Aggregatibacter) не соответствовали ранее имевшимся данным [13], была проведена дополнительная проверка аккуратности процедуры очистки ДНК. Кроме того, для дальнейшего применения ПЦР в режиме реального времени необходимо было каждый раз проводить сравнение метагеномного секвенирования (МС) и данных ПЦР, касающихся процента каждой ОТЕ в клиническом материале, что позволяло осуществлять анализ с высокой степенью выработки отбракованных наборов образцов.

Согласно данным, полученным в ходе сравнения ПЦР с помощью набора dentoflor, в пародонтальной микрофлоре всех лиц (включая здоровых и пациентов с пародонтитом) полностью отсутствует A. actinomycetemcomitans (табл. 3).

Это значит, что A. аctinomycetemcomitans не является важным фактором запуска пародонтита. Данные анализа ПЦР, представленные в табл. 3, очевидно противоречат данным МС (см. табл. 2). Сравнив два правых столбца в табл. 3, можно предположить, что это несоответствие объясняется исследованием видов внутри рода Aggregatibacter, используемого как ОТЕ для метагеномного анализа. В результате этого анализа (табл. 4) видно, что Aggregatibactersegnis превалирует в пародонтальной микрофлоре всех пациентов. A. haemophilussimilae и A. aphrophilus не так много, но по силе они превосходят A. actinomycetemcomitans. Таким образом, нельзя утверждать, что род Aggregaticabter вызывает хронический пародонтит. Важно отметить, что в комплекте dentoflor, основанном на ПЦР, используются видоспецифичные молекулярные маркеры и таким образом обеспечиваются результаты, соотносящиеся с МС.

Также было проведено похожее сравнение данных ПЦР в реальном времени и МС по известным пародонтальным патогенам Porphyromonasgingivalis, Tannerellaforsythia и Treponemadenticola (табл. 5). Судя по нему, между двумя типами данных наблюдается соответствие. Как и ожидалось, с помощью анализа ПЦР в реальном времени можно получить точные данные по силе определенного патогена для конкретного человекапо сравнению с другими людьми. Однако разная чувствительность к парам праймеров исключает сравнение степени пародонтальной колонизации разными видами. Это явствует из сравнительных данных по P. gingivalis и T. Denticola, где параметры с относительным C_t в обоих когортах выше для первых видов, в то время как настоящая колонизация периодонта P. Gingivalis в 2—3 раза превышает T. denticola.

По нашим данным видно, что Veillonella — единственная ОТЕ (рода или единицы более высокого ранга), которая четко ассоциируется со здоровым пародонтом. Согласно исследованию зарубежных авторов [14], высокая степень колонизации Veillonella связана с кариесом молочных зубов. Streptococcus — это еще одна ОТЕ, отвечающая за кариес, однако при его преобладании человек в меньшей степени подвержен пародонтиту.

Изложенное выше подтверждает гипотезу о том, что гигиенические меры, направленные на борьбу с кариесом, могут провоцировать хронический пародонтит из-за нарушения баланса между компонентами микрофлоры. Возможно также, что Veillonella способствует защите пародонта за счет поглощения сукцината и лактата, которые превращаются в ацетат и пропионат (Hamilton, 1971).

Хотя можно предположить, что Veillonella выступает как средство защиты пародонта и представляет собой положительный прогностический маркер пародонтита, она может провоцировать серьезные заболевания, такие как эндокардит [15], менингит [16], септический шок [17], пиелонефрит и вторичную бактериемию [18].

В других исследованиях говорилось об иных предполагаемых маркерах низкой подверженности пародонтиту. Авторами было установлено, что преобладание Bergeyella положительно влияет на пародонт и является маркером, прогнозирующим появление бляшек у собак [19]. Granulicatella и Veillonella рассматривались как компонент нормальной микрофлоры полости рта [20], хотя эти виды, возможно, ответственны за эндодонтическую инфекцию и могут вызывать серьезные повреждения плода у беременных женщин. Похожие результаты получили исследователи в 2012 г. [21], изучавшие метагеном здоровых и больных участков при локальном пародонтите у афро-американских детей в США. В здоровых участках преобладали Selenomonas spp., Veillonella spp., Streptococcus spp., Bergeyella spр. и Kingellaoralis. В целом Streptococcus spр., Campylobactergracilis, Capnocytophagagranulosa, Haemophilusparainfluenzae и Lautropiamirabilis чаще всего встречались у здоровых детей, а A. actinomycetecomitans, Filifactoralocis, Tannerella spр., Solobacteriummoorei, Parvimonasmicra, и Capnocytophaga spр. у лиц с локализованным пародонтитом.

В 2012 г. также было проведено сравнение изменений поддесневой микрофлоры при пародонтите до и после терапии с помощью чипа для определения микроба полости рта (HOMIM) [13] и были сделаны выводы, схожие с нашими. Capnocytophagasputigena, Cardiobacteriumhominis, Gemellahaemolysans, Haemophilusparainfluenzae, Kingellaoralis, Lautropiamirabilis, Neisseriaelongata, Rothiadentocariosa, Streptococcusaustralis и Veillonella spp. скорее ассоциировались с терапевтическим успехом.

Corynebacterium ранее не связывалась с пародонтитом. Ее роль в прогнозировании агрессивного пародонтита возможно связана с тем, что этот род в отличие от всех вышеупомянутых ОТЕ относится к аэробным бактериям.

Предполагаемыми отрицательными маркерами следует считать высокое преобладание представителей Synergistaceae, Filifactor, Ruminococcaceae, Mycoplasma и Parvimonas, а не Aggregatibacteractinomicetecomitans и так называемого «оранжевого комплекса» Porphyromonasgingivalis, Prevotellaintermedia, Treponemadenticola и Tannerellaforsythia.

Из всех ОТЕ больше всего в пародонте встречается Fusobacter, которая не связана ни с отрицательным, ни с положительным прогнозом хронического пародонтита. По этой причине ее специфические хромосомные маркеры можно считать дополнительной полезной мишенью для нормализации данных ПЦР в реальном времени, касающихся преобладания пародонтопатогенных или пародонтопротекторных видов.

Все авторы в равной степени принимали участие в подготовке материала.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.