Пептиды, имитирующие пространственную структуру α-цепи B эритропоэтина — новые возможности лечения и профилактики гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции

Сосудистый эндотелий представляет собой единый монослой динамически функционирующих клеток, которые посредством различных стимулов вырабатывают вазоактивные вещества для поддержания сосудистого тонуса и регуляции тканевого кровоснабжения. Исследования R. Furchgott и J. Zawadzki показали, что присутствие эндотелия в препаратах изолированной артерии является необходимым условием для осуществления ацетилхолин-индуцированной вазодилатации, и этот эффект был объяснен наличием субстанции, выделяемой эндотелием [1], впоследствии идентифицированной как оксид азота (NO) [2]. Позже стало понятно, что клетки эндотелия выделяют большое количество разных веществ как в кровь, так и в окружающие ткани, поэтому их можно рассматривать как самую большую эндокринную систему в организме человека [3]. В настоящее время под дисфункцией эндотелия понимают дисбаланс между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов [4].

Исследования роли гомоцистеина в реализации сердечно-сосудистого континуума начались в 1969 г., когда K. McCully предположил, что гипергомоцистеинемия связана с сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) [5]. Однако эта теория долгое время игнорировалась, вероятно, из-за низкой распространенности врожденных нарушений метаболизма, которые сопровождались тяжелой гипергомоцистеинемией. В 1976 г. гипергомоцистеинемия вызвала всемирный интерес, когда ученые выявили аномальное повышение гомоцистеина в плазме после пероральной нагрузки метионином у пациентов с ишемической болезнью сердца [6]. К настоящему времени многочисленные ретроспективные и проспективные исследования показали связь между уровнем общего гомоцистеина в плазме и ишемической болезнью сердца, заболеваниями периферических артерий, инсультом или венозным тромбозом [7, 8]. Результаты метаанализа C. Boushey и соавт. [7] показали, что увеличение гомоцистеина в плазме на 5 мкмоль/л увеличивает риск сердечно-сосудистых заболеваний в 1,6—1,8 раза. По данным многочисленных исследований, гипергомоцистеинемия вызывает эндотелиальную дисфункцию посредством ингибирования NO [9].

Очевидно, что коррекция эндотелиальной дисфункции и, как следствие, нарушений метаболизма NO (снижение его синтеза эндотелиоцитами и биодоступности) приводит к снижению риска возникновения, а также предупреждению патогенетических механизмов развития и клинических проявлений артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений.

Мы считаем, что одним из способов предотвратить повреждение эндотелия является применение молекул с универсальной цитопротективной активностью [10]. Одной из таких молекул является эндогенный гликопротеин эритропоэтин. Ряд проведенных нами исследований продемонстрировал, что эритропоэтин способен значительно улучшать морфофункциональное состояние сосудистой стенки при моделировании эндотелиальной дисфункции у крыс [10, 11].

Появление информации о реализации тканезащитных эффектов эритропоэтина через активацию гетеродимерного комплекса, состоящего из гетеродимерного комплекса рецептора эритропоэтина и CD131, привело исследователей к идее поиска коротких молекул, имитирующих α-спираль В эритропоэтина. В исследовании, опубликованном M. Brines и соавт., установлено, что 11-членный пептид pHBSP (QEQLERALNSS) имитирует особенности трехмерной структуры α-спирали В эритропоэтина [12].

Цель настоящего исследования — анализ эндотелио- и кардиопротективного действия производных 11-членного пептида pHBSP (QEQLERALNSS): EP-11-1 (UEHLERALNSS), EP-11-2 (UEQLERALNCS), EP-11-3 (UEQLERALNTS). Аминокислотные последовательности были получены путем гомологичного анализа для определения групп родственных пептидов исходного соединения с использованием программы BLAST.

Опыты проводились на белых крысах Wistar массой 200—250 г. Этические принципы обращения с лабораторными животными соблюдались в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (CETS №123) [13].

Гипергомоцистеин-индуцированную эндотелиальную дисфункцию моделировали с помощью внутрижелудочного введения метионина в дозе 3 г/кг. Раствор для внутрижелудочного введения метионина готовили ex tempore с помощью полисорбата ТВИН 80 и 1% крахмального раствора [14].

Животные были разделены на 7 групп (по 10 животных в каждой): 1-я группа (контроль) получала 10% раствор ТВИН 80 в дозе 1 мл/кг); 2-я — метионин 3 г/кг в течение 7 сут; 3-я — метионин+эритропоэтин; 4-я — метионин+pHBSP (QEQLERALNSS); 5-я — метионин+EP-11-1 (UEHLERALNSS); 6-я — метионин+EP-11-2 (UEQLERALNCS); 7-я — метионин+EP-11-3 (UEQLERALNTS). Исследуемые препараты вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мкг/кг на 1-е, 3-и и 6-е сутки эксперимента.

На 8-е сутки от начала эксперимента животным под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в бедренную вену. Показатели гемодинамики — систолическое АД (САД), диастолическое АД (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно с помощью аппаратно-программного комплекса Biopac. Помимо измерения АД проводили ряд функциональных проб в следующей последовательности: 1) проба на эндотелийзависимое расслабление сосудов (внутривенное введение раствора ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г); 2) проба на эндотелийнезависимое расслабление сосудов (внутривенное введение раствора нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г) [14, 15].

Степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных, а также степень ее коррекции исследуемыми препаратами оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД) [16].

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных, находящихся на управляемом дыхании, катетеризировали полость левого желудочка и проводили нагрузочные пробы в следующей последовательности: 1) проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 1,10—5,0 моль/л из расчета 0,1 мл на 100 г [17, 18], при выполнении пробы осуществлялась оценка максимального подъема левожелудочкового давления (ЛЖД) в ответ на введение адреналина; 2) нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 с), после проведения пробы рассчитывался показатель исчерпания миокардиального резерва (%), равный отношению прироста ЛЖД на 5-й секунде пережатия аорты к приросту ЛЖД на 25-й секунде пережатия аорты.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программной среды вычислений R. Характер распределения признаков в статистической выборке определяли с помощью критерия Шапиро—Уилка и критерия Шпигельхальтера (библиотека normtest), оценку равенства дисперсий — с помощью критерия Левене (библиотека lawstat). В зависимости от типа распределения признаков и равенства дисперсий значимость полученных результатов оценивали с применением параметрического (ANOVA) или непараметрического (критерий Краскела—Уоллиса) однофакторного дисперсионного анализа, а в качестве post hoc анализа для выявления различий при межгрупповых сравнениях использовали непарный t-критерий Стьюдента или критерий Манна—Уитни соответственно с поправкой Бенджамини—Хохберга на множественную проверку гипотез. Результаты считали достоверными при p≤0,05.

Установлено, что моделирование гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции не приводило к статистически значимому изменению САД и ДАД у экспериментальных животных. Внутрибрюшинное введение в дозе 25 мкг/кг рекомбинантного эритропотина, pHBSP (QEQLERALNSS), EP-11-1 (UEHLERALNSS), EP-11-2 (UEQLERALNCS) и EP-11-3 (UEQLERALNTS) также не оказывало выраженного влияния на показатели АД (табл. 1).

Таблица 1. Влияние рекомбинантного эритропоэтина и его 11-аминокислотных производных на артериальное давление и коэффициент эндотелиальной дисфункции

Примечание. NOx — концентрация конечных стабильных метаболитов NO. * — p≤0,05 при сравнении с группой животных, получавших 10% ТВИН 80; ** — p≤0,05 при сравнении с группой животных, получавших метионин 3 г/кг.

В то же время статистическая обработка результатов сосудистых проб эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилиатации позволила установить статистически значимое (p≤0,05 в сравнении с контролем) повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции при моделировании патологии. В группе животных, получавших метионин в дозе 3 г/кг, отмечалось повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3,5 раза (p≤0,05). Применение рекомбинантного эритропоэтина и исследуемых пептидов привело к статистически значимому снижению коэффициента эндотелиальной дисфункции. Наименьшая эффективность выявлена при применении соединения с лабораторным шифром EP-11-1, где снижение КЭД относительно группы животных с патологией составило 20% (p≤0,05). Максимальное снижение КЭД на 57,1% зарегистрировано в группе животных, получавших соединение с лабораторным шифром EP-11-3 (p≤0,05) (см. табл. 1).

При изучении NO-продуцирующей функции эндотелия установлено, что введение в дозе 25 мкг/кг рекомбинантного эритропотина, pHBSP (QEQLERALNSS), EP-11-2 (UEQLERALNCS) и EP-11-3 (UEQLERALNTS) приводит к статистически значимому в сравнении группой нелеченых животных (p≤0,05) увеличению концентрации стабильных метаболитов NO. Максимальное значение NOx (109,4±6,2 мкмоль) в экспериментальных группах наблюдалось у животных, получавших EP-11-3 (UEQLERALNTS), что приближается к соответствующему уровню в контрольной группе животных (130,6±8,5 мкмоль). Применение EP-11-1 не привело к изменению концентрации исследуемого показателя (см. табл. 1).

Далее проводилась оценка кардиогемодинамики в пробах на открытом сердце у животных, находящихся на управляемом дыхании. При выполнении пробы на адренореактивность в группе животных, которым моделировали гипергомоцистеин-индуцированную эндотелиальную дисфункцию путем введения метионина в дозе 3 г/кг, обнаружено статистически значимое (p≤0,05) увеличение максимальных значений ЛЖД на 33,3% в ответ на внутривенное введение адреналина (табл. 2). Кардиопротективное действие, выразившееся в статистически значимом (p≤0,05) уменьшении адренореактивности (на 6,8%), отмечалось в группе животных, получавших 11-аминокислотное производное эритропоэтина под лабораторным шифром EP-11-3 (см. табл. 2).

Таблица 2. Влияние рекомбинантного эритропоэтина и его 11-аминокислотных производных на функциональные показатели при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции

Примечание. * — p<0,05 при сравнении с группой животных, получавших 10% ТВИН 80; ** — p<0,05 при сравнении с группой животных, получавших метионин 3 г/кг.

При пробе на нагрузку сопротивлением в группе животных, получавших метионин в дозе 3 г/кг, было зарегистрировано снижение миокардиального резерва на 24,1% (p≤0,05) (см. табл. 2). При применении рекомбинантного эритропоэтина, pHBSP (QEQLERALNSS), EP-11-2 (UEQLERALNCS) и EP-11-3 (UEQLERALNTS) наблюдалось статистически значимое (p≤0,05) в сравнении группой нелеченых животных предотвращение исчерпания миокардиального резерва к 25 секунде проведения нагрузочной пробы. Наиболее эффективно, на 24,7%, миокардиальный резерв повышался в группе животных, получавших пептид с лабораторным шифром EP-11-3 (см. табл. 2).

В 2004 г. группой ученых доказано, что негематопоэтические эффекты эритропоэтина реализуются через гетеродимерный комплекс EPOR/CD131 [19]. Открытие, показавшее, что эритропоэтические и тканезащитные свойства эритропоэтина реализуются через две разные рецепторные системы, привело к созданию предпосылок для принципиально нового направления в поиске инновационных молекул с цитопротекторной активностью. В 2008 г. те же авторы представили обобщенные результаты исследования цитопротекторной активности пептида из 11 аминокислот на основе α-спирали B эритропоэтина, которая имитирует пространственную часть молекулы, взаимодействующую с гетеродимерным рецептором EPOR/CD131, но не взаимодействующую с гомодимерным рецептором EPOR/EPOR [12]. Этот пептид pHBSP продемонстрировал способность значительно улучшать морфофункциональное состояние тканей при диабетическом отеке сетчатки, почечной ишемии-реперфузии и значительно улучшать когнитивные функции на модели галантамин-индуцированной амнезии при отсутствии какого-либо воздействия на эритропоэз [13].

Полученные в рамках настоящего исследования результаты подтверждают выдвинутое нами предположение об эндотелио- и кардиопротективной активности инновационных пептидов, имитириующих пространственную структуру α-цепи B эритропоэтина. В рамках формирования подходов к фармакологической коррекции эндотелий-ассоциированной патологии нами ранее была изучена эндотелиопротективная активность ряда соединений, препаратов и их комбинаций на различных экспериментальных моделях эндотелиальной дисфункции [16, 20, 21].

Также нами было проведено исследование эндотелиопротективной активности базового пептида pHBSP с аминокислотной последовательностью QEQLERALNSS [22]. При использовании модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции было обнаружено, что pHBSP может прменяться в качестве атеропротектора из-за его способности предотвращать гибель эндотелиальных клеток, а также уменьшать ремоделирование и провоспалительную активацию сосудистой стенки. Тем не менее протромботические свойства пептида ограничивают его использование в качестве средства для профилактики и лечения заболеваний, связанных с атеросклерозом [22, 23].

В связи с этим мы пришли к выводу, что следует продолжить поиск соединений — потенциальных эндотелиопротекторов среди пептидов, родственных исходному пептиду pHBSP, не обладающих протромботической активностью или обладающих антикоагулянтными свойствами. Поиск таких соединений может быть решен несколькими способами, включая добавление аминокислотных мотивов с антикоагулянтными свойствами к аминокислотной последовательности или путем поиска групп родственных пептидов исходного соединения с помощью программы BLAST. Пептиды, проанализированные в настоящем исследовании, были получены с использованием второго подхода — скрининга с использованием программы BLAST.

На 1-м этапе изучения фармакологической активности полученных производных в рамках настоящего исследования мы провели изучение эндотелио- и кардиопротективной активности производных pHBSP под лабораторными шифрами EP-11-1 (UEHLERALNSS), EP-11-2 (UEQLERALNCS), EP-11-3 (UEQLERALNTS). Результаты иследования показали, что рекомбинатный эритропоэтин и базовое соединение, имитирующее пространственную структуру α-цепи В эритропоэтина (pHBSP), обладают эндотелио- и кардиопротективным действием, что выражается в статистически значимом снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, повышении концентрации конечных стабильных метаболитов NO, увеличении миокардиального резерва при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. Отобранные с помощью BLAST-скрининга производные pHBSP также обладают в разной степени выраженным протективным действием на модели гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции. А соединение EP-11-3 (UEQLERALNTS) продемонстрировало максимальную эффективность среди всех серий экспериментов.

В результате проведенного эксперимента доказано, что разработанные нами соединения, имитирующие α-спираль В эритропоэтина, обладают выраженной эндотелио- и кардиопротективной активностью, и дальнейшие исследования молекулы-лидера EP-11-3 (UEQLERALNTS) позволят ответить на вопросы использования этих соединений в качестве пептидов с эндотелиопротективной, кардиопротективной и антиагрегантной активностью.

Исследование выполнено при поддержке гранта Президента РФ №МД-757.2020.7.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — М.В. Корокин, М.В. Покровский; сбор и обработка материала — Л.В. Корокина, В.О. Солдатов, О.В. Анциферов, В.В. Васюткин; статистическая обработка — В.О. Солдатов, В.В. Гуреев; написание текста — М.В. Корокин; редактирование — М.В. Корокин, М.В. Покровский.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.