Введение

Миома матки — наиболее распространенная доброкачественная опухоль у женщин большинства стран мира. Считается, что миому матки диагностируют у 30—35% женщин репродуктивного возраста, чаще в позднем репродуктивном возрасте, а у каждой третьей пациентки она становится симптомной [1]. Лейомиома матки часто встречается в репродуктивном возрасте, и 60% случаев заболевания приходится на женщин в возрасте около 45 лет. В наиболее тяжелых случаях миомы вызывают боль в животе, нарушение менструального цикла, а также гиперменорею и вторичную анемию. Факторами риска развития лейомиомы матки считаются гормональные нарушения, ранняя менопауза, а также целый ряд патофизиологических и генетических предпосылок [2, 3].

Согласно современным представлениям о генетических детерминантах, вызывающих развитие миомы матки, описано четыре типа генетических изменений в клетках узлов. Наиболее распространенным (первым) типом является наличие в узлах соматических мутаций в гене MED12 (MED12-зависимые узлы), на долю которых приходится примерно 70% всех случаев. Соматические мутации в гене MED12 тесно связаны с фибромиомами без первичных кариотипических изменений [4]. Второй тип генетических изменений характеризуется гиперэкспрессией генов HMGA1/2. На миомы с гиперэкспрессией этих генов приходится примерно 50% узлов, не имеющих соматических мутаций в гене MED12. Относительно редким (третьим) типом является биаллельная инактивациия гена фумаратгидратазы (FH): это, как правило, обусловливает появление атипичных вариантов лейомиомы, их доля не превышает 1% всех узлов. Четвертым, достаточно редким типом являются варианты отсутствия перечисленных изменений генома, но с наличием делеции участка 22-й хромосомы с генами COL4A5-COL4A6 [5].

Считается, что соматические мутации в гене MED12 возникают спонтанно в недифференцированных (иногда используется термин «стволовые») клетках миометрия, при этом вопрос о том, как быстро после возникновения мутации клетка приступает к неконтролируемому делению с последующим формированием миоматозного узла, остается открытым [6—8].

Ряд исследований показали, что соматическая мутация в гене MED12 меняет транскрипционную работу клетки в целом. Искусственное внесение такой мутации в клетки миометрия с помощью CRISPR-CAS-инженерии мутаций MED12 Gly44 показало, что в таких клетках происходит ряд транскрипционных и метаболических изменений, сходных с изменениями в клетках миом, включая, например, изменение метаболизма триптофана/кинуренина. На клеточном уровне такие искусственные мутантные клетки увеличивают скорость пролиферации и формируют крупные очаги поражения in vivo с повышенной выработкой коллагена и отложением внеклеточного матрикса [9]. Кроме того, исследования показали связь соматических мутаций MED12 с активацией передачи сигналов по Wnt/β-катениновому пути [10]. Проведен также ряд исследований по оценке роли некодирующих РНК в патогенезе миомы матки и связи наличия соматических мутаций в гене MED12 с активацией таких РНК [11, 12].

Исследователи интенсивно изучают различные варианты соматических мутаций в гене MED12 [13]. Ранее нами установлено, что при множественной миоме в узлах у пациенток обнаруживаются разные однонуклеотидные замены, а также делеции и вставки участков последовательностей длиной от трех до нескольких десятков нуклеотидов [14]. Однако частота выявления разных типов мутаций в узлах одних и тех же пациенток ранее подробно не исследовалась. Согласно полученным нами данным [13], у пациенток с несколькими узлами часто встречаются разные соматические мутации, поэтому сбор данных о молекулярных характеристиках узлов при множественной миоме имеет научно-практический смысл для дальнейшего понимания патогенеза миомы матки.

Цель исследования — оценить частоту выявления различных типов соматических мутаций в гене MED12 при множественной миоме матки.

Материал и методы

Всего обследованы 62 пациентки с множественной миомой матки, прооперированные в гинекологическом отделении отдела оперативной гинекологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России с 2016 по 2024 г.

Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Все пациентки подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.

Сбор образцов тканей миом производился непосредственно во время операций по миомэктомии или гистерэктомии, объем изымаемых тканей зависел от размера и количества узлов (от каждой пациентки взяты образцы от 2 до 14 миоматозных узлов). Всего собраны фрагменты 264 миоматозных узлов. Фрагменты тканей помещали в физиологический раствор, отправляли в биобанк ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, где замораживали при температуре –70°C для последующего хранения в коллекции. Сбор образцов периферической крови проводили на следующие сутки после операции в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) для предотвращения свертывания. В качестве материала для исследований использовалась венозная кровь, собранная по стандартной методике в вакутейнеры. Выделение ДНК проводилось набором ExtractDNA Blood (ЗАО «Евроген», Россия).

Из всех образцов ДНК с помощь полимеразной цепной реакции (ПЦР) получали фрагмент экзона 2 гена MED12 (общая длина ампликона 320 н.п.), который затем секвенировали по Сэнгеру. Полученные последовательности анализировали на наличие соматических мутаций. Амплификацию ДНК проводили на приборе «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Последовательности нуклеотидов определены путем секвенирования методом Сэнгера на приборе ABI PRISM 3500 («Life Technologies Corporation», США, регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2010/07007). Полученные хроматограммы анализировались на однонуклеотидные замены, а также делеции и вставки участков последовательностей в экзоне 2 гена MED12.

Результаты

Различные варианты соматических мутаций в экзоне 2 гена MED12 обнаружены в подавляющем большинстве исследованных миоматозных узлов (табл. 1), в целом в нашей выборке выявлено 56% узлов с мутацией. Всего обнаружено 148 мутаций, при этом у 59 из 62 обследованных пациенток соматическая мутация определена минимум в одном из узлов.

Таблица 1. Частота выявления соматических мутаций в узлах множественной миомы (включая делеции)

Примечание. * — собственные данные.

У нескольких пациенток с максимальным количеством узлов (более 10) выявлены идентичные мутации в нескольких узлах, наиболее часто встречались варианты 130G/A и 131G/A. В табл. 1 представлены варианты обнаруженных мутаций, их количество и частота в общей выборке узлов.

Наиболее часто в узлах выявлялась однонуклеотидная замена 131G/A (41%), тогда как второй по частоте мутацией были делеции различной длины (19%), на третьем месте — однонуклеотидная замена 130G/A (14%).

В третьем столбце приведены полученные нами ранее данные в большой выборке узлов, куда входили как одиночные, так и множественные миомы (537 узлов). Сопоставление показывает, что частота различных мутаций практически одинакова, существенных различий нет, и абсолютно совпадает порядок частот по возрастанию. Помимо сопоставления частоты выявления мутаций в миомах проведен сравнительный анализ наших данных и результатов исследования частоты однонуклеотидных мутаций в миометрии [14]. Результаты анализа представлены в табл. 2 и включают только данные в отношении 5 однонуклеотидных замен (из нашей выборки мы также убрали делеции и часть замен), поскольку методика NGS в исследовании коллег не позволяла достоверно выявлять делеции, а также редко встречающиеся однонуклеотидные замены.

Таблица 2. Частота выявления однонуклеотидных мутаций в миометрии и миоматозных узлах

Сопоставление данных о соматических мутациях в узлах показывает, что, несмотря на совпадения в основном, значения частоты двух мутаций, 131G/A и 131G/T, различаются существенно. Замена 131G/A — наиболее частая из соматических мутаций, найденных в миомах, согласно всем опубликованным исследованиям. Однако в миометрии ее частота ниже примерно на 20%. Обратная ситуация с заменой 131G/T в этом же сайте: в миомах она встречается реже, тогда как в миометрии — чаще на 9%.

В табл. 3 представлены данные о размерах и частоте обнаружения делеций в области экзона 2 гена MED12. Большинство обнаруженных делеций по протяженности кратны трем, то есть такая делеция в последовательности экзона не нарушает считывание аминокислотной последовательности. Наиболее часто встречались делеции длиной 9 и 15 нуклеотидов.

Таблица 3. Распределение делеций по длинам в нуклеотидах

Обсуждение

Генетические триггеры, ответственные за формирование лейомиом, можно разделить на две группы. Первую из них формируют более редкие и малоизученные генетические варианты, которые наследуются в ряду поколений и ответственны за предрасположенность конкретного индивидуума к развитию опухолей (в нашем случае — к развитию лейомиом у женщин). Вторая группа генетических аберраций, связанных с развитием лейомиом, представляет собой соматические мутации в геноме клеток миометрия. В результате клетка становится «родоначальницей», то есть исходной клеткой, из которой в дальнейшем развивается миома, тогда как в обычных дифференцированных клетках окружающего миоматозные узлы интактного миометрия и во всех других тканях организма таких мутаций нет. За 10—15 лет достигнут значительный прогресс в понимании причин наследуемости лейомиомы и вариантов спонтанных аберраций соматического генома таких опухолей. Отчасти это связано с применением новых генетических технологий, таких как исследования по выявлению однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), а также полногеномное секвенирование (NGS), выполненные на больших выборках пациенток с установленными фенотипами по миоме матки [15—17].

Молекулярно-генетические исследования миоматозных узлов показали, что примерно в 40—50% миом выявляются хромосомные аномалии [18—21]. Такие цитогенетические аберрации весьма разнообразны, но обычно включают делеции в хромосомных областях 6p21, 7q, 1p и 1q, а также в миомах встречаются трисомии по хромосоме 12 и различные транслокации между хромосомами 12 и 14 с участием гена HMGA2, расположенного в области 12q15. В результате такой перестройки происходит слияние фрагментов генов HMGA2 и RAD51L1, начинается синтез патобиологически значимых гибридных транскриптов [22].

Общая нестабильность генома присуща целому ряду других опухолей, но для миом в целом выявлен характерный паттерн наиболее частых хромосомных перестроек. Хаотические множественные перестройки (хромотрипсис) в миомах встречаются крайне редко и, возможно, только в узлах, которые склонны к злокачественному перерождению [23].

Помимо хромосомных перестроек в клетках миом известно о шести наиболее частых однонуклеотидных заменах в экзоне 2 гена MED12 в миоматозных узлах, затрагивающих две конкретных пары оснований (координаты 130 и 131). Именно к таким мутациям относится большинство (около 70%) определяемых в миомах соматических мутаций. Во всех случаях такие однонуклеотидные мутации являются гетерозиготными (обнаруживаются только в одной из двух копий гена в клетке) и локализуются только в ткани миоматозного узла, тогда как в ткани псевдокапсулы опухоли и окружающего миометрия этих мутаций нет [24].

В нашей выборке мутации обнаружены в 56% узлов, тогда как во многих опубликованных ранее работах их количество оценивается как 70% и более, причем максимальная частота таких мутаций (73,2%) обнаружена в миомах женщин афроамериканского происхождения, у которых и сами опухоли возникают гораздо чаще, чем у женщин других рас [25].

Помимо восьми наиболее часто встречающихся однонуклеотидных замен в 19% миоматозных узлов обнаружены делеции различной длины (от 3 до 49 н.п.) экзона 2 гена MED12, в подавляющем большинстве эти делеции включают в себя область наиболее частых однонуклеотидных замен — кодоны 130 и 131. Большинство обнаруженных делеций по протяженности кратны трем, то есть такая делеция в последовательности экзона не нарушает считывание аминокислотной последовательности. Однако в базе данных GenBank содержатся данные и о делециях, которые нарушают считывание генетического кода (длиной, например, 5, 17 или 41 нуклеотид). Вместе с тем экспериментальные данные показывают, что белок MED12 в клетках лейомиом с соматической мутацией синтезиреутся и функционирует [26].

Мутации в гене MED12 с одинаковой частотой обнаруживаются как в кариотипически нормальных лейомиомах, так и в опухолях с хромосомными перестройками [17].

Основной вопрос после открытия соматических мутаций в MED12 в миомах: в какой именно момент возникают эти мутации — до того, как клетка встанет на путь перерождения в опухолевую, или само возникновение такой мутации сразу же «переключает» работу генома клетки на превращение в клетку-предшественник миоматозного узла, каждый из которых является клоном одной единственной клетки-предшественника.

Недавно опубликованы результаты исследований, свидетельствующие о неслучайном появлении мутаций в последовательности экзона 2 гена MED12 в клетках неизмененного здорового миометрия. Полученные в этой работе данные свидетельствуют о том, что соматические мутации в клетках миометрия появляются заранее, еще до начала перерождения клетки в предшественника опухоли [14]. Для того чтобы получить данные об отдельных клетках, потребовался сложный высокотехнологичный анализ результатов высокопроизводительного секвенирования. Поскольку ни секвенирование по Сэнгеру, ни стандартная методика NGS не могут выявить соматическую мутацию, если в тестируемом образце доля аллели с заменой составляет менее 0,1%, использован дуплексный анализ с глубоким секвенированием (DDS), чтобы преодолеть это ограничение.

Полученные в данной работе результаты показали, что мутации во втором экзоне гена MED12 определяются в тканях миометрия, образцы которых взяты после гистерэктомии. Это открытие дает нам представление о роли таких «заранее возникающих» соматических мутаций как генетического триггера развития лейомиомы. В клетках интактного миометрия обнаружены неслучайные мутации в экзоне 2 гена MED12, максимальное число которых затрагивало позиции 130 и 131 н.п. Это первое исследование, в ходе которого выявлены соматические мутации в неопухолевых клетках миометрия из свежесобранных образцов ткани. Его результаты позволяют глубже понять мутационное давление в ткани миометрия, действующее еще до начала роста миоматозных узлов. Таким образом, мутации в гене MED12 возникают заранее в клетках миометрия и ждут благоприятного момента для начала развития опухоли. В настоящее время нет данных о том, происходят ли такие мутации в клетках других тканей.

Согласно современным представлениям, рост каждого единичного узла начинается с единственной клетки, в которой произошла драйверная мутация (или в гене MED12, или хромосомная перестройка, затрагивающая ген HMGA2, или несколько более редких изменений соматического генома). Для поддержания и дальнейшего роста миомы матки решающее значение имеет популяция гладкомышечных клеток-предшественников, обладающих повышенной пролиферативной активностью, при этом такая популяция клеток составляет около 5% всех клеток миомы. Образование внеклеточного матрикса является ключевым компонентом миоматозного узла, несущего мутацию в MED12, но ни одна из опухолей не выжила бы и не росла без активно пролиферирующей популяции неопластических стволовых клеток. Установлено, что эти 5% стволовых клеток в лейомиомах экспрессируют очень низкие уровни рецептора эстрогена (ESR1) и при этом очень высокие уровни рецепторов инсулиноподобных факторов роста (IGF), таких как рецептор инсулина-А, а также рецепторов сайтов интеграции MMTV (WNTs), таких как frizzled-6 (FZD6), и цитокинов, таких как активатор рецептора ядерного фактора κ-B (RANCL). Эти рецепторы служат частью дополнительной паракринной системы для приема сигналов роста (например, WNT4, IGF-1, IGF-2 и лиганда-активатора рецептора ядерного фактора κ-B — RANKL) от промежуточных или полностью дифференцированных популяций клеток лейомиомы, которые экспрессируют высокие уровни ESR1 и PGR, стимулируемых прогестероном [27—31].

Заключение

Мутации в гене MED12 являются самым распространенным триггером, вызывающим перерождение клетки миометрия. В российской популяции распространенность таких мутаций в узлах лейомиомы матки составляет 50—60%. При множественной миоме у пациенток встречаются узлы с разными мутациями (как однонуклеотидными, так и делециями) наряду с узлами, в которых таких мутаций нет. Это ставит под сомнение наследственную природу повышенной вероятности таких мутаций, поскольку затрагиваемый ими регион гена MED12, очевидно, является «горячей точкой» соматического мутагенеза и спонтанные мутации в нем, по-видимому, происходят постоянно. Однако механизмы, запускающие развитие и рост миоматозного узла, могут иметь наследственный компонент и должны быть предметом дальнейшего изучения. Кроме того, как ранее указано в наших работах [32], необходимо более глубокое изучение генетических и эпигенетических аспектов механизмов развития и рецидивирования миомы матки у женщин с множественной формой заболевания, что оказывает сильное влияние на реализацию репродуктивной функции.

Финансирование: проект РНФ 23-15-00069 «Разработка профилактической вакцины для предотвращения развития лейомиомы матки у пациенток, планирующих беременность».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Кузнецова М.В., Тоноян Н.М., Адамян Л.В.

Сбор и обработка материала — Аветисян Д.С., Серёгина В.Ю., Карягина В.Е.

Написание текста — Кузнецова М.В.

Редактирование — Карягина В.Е., Тоноян Н.М., Адамян Л.В., Рогожин А.С., Степанян А.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.