Введение

Лейомиома матки — моноклональная опухоль из гладкомышечных клеток шейки или тела матки [1], занимающая по частоте первое место среди доброкачественных новообразований женской репродуктивной системы, обнаруживается у 70—80% женщин, чаще в репродуктивном возрасте [2, 3]. При этом в последнее десятилетие случаи выявления миомы матки у молодых пациенток до 30 лет, не реализовавших репродуктивную функцию, значительно участились [4].

Лейомиома матки представляет собой наиболее распространенную доброкачественную опухоль женского репродуктивного тракта [5]. Миоматозные узлы, вызывающие выраженные клинические проявления, встречаются примерно у 30% женщин (при этом среди афроамериканок репродуктивного возраста эта цифра возрастает до 70%) [6, 7]. Несмотря на доброкачественность самого опухолевого процесса, его симптомы могут быть достаточно тяжелыми, а именно приводить к дисфункции тазовых органов, аномальным маточным кровотечениям, анемиям, вызывать болевой синдром [8]. Все эти проявления существенно ухудшают качество жизни женщин, снижая их работоспособность в связи с повышенной утомляемостью, хронической анемией, диспареунией и т.д., кроме того, увеличивается частота госпитализаций таких пациенток в гинекологический стационар. Именно миома матки становится главной причиной гистерэктомии во многих странах [7, 8]. Так, в США она является основанием для 600 тыс. гистерэктомий ежегодно [9]. В России, по различным данным, по поводу симптомной миомы матки производится до 50—70% операций в гинекологических стационарах, среди них до 370 тыс. гистерэктомий ежегодно [10, 11], что характеризует миому матки как одну из важнейших угроз репродуктивному здоровью женщин.

Молекулярные механизмы, ответственные за инициацию и развитие опухолей, являются в настоящее время областью пристального внимания исследователей. Учитывая важную роль молекулярных процессов в развитии лейомиомы матки, следует отметить широкий спектр молекулярных инструментов и ресурсов, которые можно использовать для разработки более эффективных методов обнаружения, классификации и лечения. Одним из важнейших процессов регуляции работы генома является метилирование или снятие метилирования с участков генома, называемых CpG-островками. Такие участки часто расположены в регуляторных областях генов и уровень метилирования этих областей напрямую связан с работой промотора и экспрессией регулируемого гена. За последние 15 лет в ряде исследований продемонстрирована эпигенетическая дисрегуляция отдельных генов в ткани лейомиом [12—14]. В 2012 г. исследованы общегеномные профили метилирования ДНК и экспрессии мРНК в лейомиоме матки и сопоставлены с профилями образцов ткани миометрия у 18 афроамериканских женщин [15]. Выявлено 55 генов с дифференциальным метилированием промотора и сопутствующими различиями в экспрессии мРНК при лейомиоме матки по сравнению с нормальным миометрием. Примерно 80% идентифицированных генов показали обратную зависимость между статусом метилирования ДНК и экспрессией мРНК в тканях лейомиомы матки, и большинство (62%) генов демонстрировали гиперметилирование, связанное со снижением или полным прекращением их экспрессии генов. В работе показано, что 3 гена, представляющие собой ранее известные опухолевые супрессоры KLF11, DLEC1 и KRT19, в лейомиомах гиперметилированы в области промотора, что ведет к подавлению синтеза мРНК и экспрессии белка. При этом инкубация гладкомышечных клеток первичной лейомиомы с ингибитором ДНК-метилтрансферазы (фермента, осуществляющего метилирование ДНК) восстанавливала уровни мРНК генов KLF11, DLEC1 и KRT19.

Поскольку результаты метилирования генов KLF11, DLEC1 и KRT19 были получены на образцах от женщин афроамериканского происхождения, экстраполяция этих данных на женщин других популяций невозможна без экспериментального подтверждения. Подтвердить универсальность данного механизма для развития всех типов лейомиом крайне важно в свете дальнейшей разработки терапевтических средств, регулирующих эпигенетические механизмы в клетках в целях предотвращения роста и развития миоматозных узлов.

Цель исследования — выполнить анализ метилирования промоторных областей двух генов-онкосупрессоров KLF11 и KRT19 в тканях лейомиом и миометрия.

Материал и методы

Исследованы образцы ДНК различных типов тканей от 54 пациенток, проходивших оперативное лечение в гинекологическом отделении отдела оперативной гинекологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России с 2018 по 2022 г. Сбор образцов тканей (узлы лейомиом, миометрий, участки аденомиоза) проводили непосредственно во время гинекологических операций. Кровь брали у пациенток после операций. Фрагменты тканей помещали в физраствор, отправляли в биобанк ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова», где замораживали при температуре –70 °C для последующего хранения в коллекции.

Выделение ДНК проводили с помощью набора Cleanup Standard (ЗАО «Евроген», Россия). После выделения выполняли бисульфитное конвертирование образцов ДНК с помощью набора EZ DNA Methylation-Gold Kit («Applied Biosystems, LLC», США). Амплификацию ДНК проводили на приборе ДТпрайм (ООО «ДНК-Технология», Россия). Полимеразную цепную реакцию проводили с праймерами на участках генов KLF11 и KRT19 (общая длина фрагментов 117 н.п. и 165 н.п. соответственно). Последовательности амплифицированных фрагментов определены методом секвенирования по Сенгеру на приборе ABI PRISM 3500 («Applied Biosystems, LLC», США) и генетическом анализаторе Нанофор-05 (ФГБУН Институт аналитического приборостроения Российской академии наук, ООО «Синтол», Россия). Наличие или отсутствие метилирования определяли визуально в программе-редакторе для нуклеотидных последовательностей FinchTV (https://finchtv.software.informer.com/1.4/).

Результаты

Множественные миомы (2 узла и более) выявлены у 34 пациенток из 55, у 21 имелись крупные одиночные опухоли. Всего проанализировано 105 миоматозных узлов и 55 образцов миометрия. На момент операции самой старшей пациентке был 51 год, самой младшей — 14 лет.

Соматические мутации в MED12 обнаружены в 18 (33%) из 54 образцов. В таблице представлены результаты анализа метилирования промоторных областей генов KLF11 и KRT19 в 6 типах тканей.

Как видно из таблицы, оба исследованных гена метилированы в миоматозных узлах, что является причиной снижения их экспрессии и вероятно, наряду с другими факторами, стимулирует развитие опухоли. При этом в тканях миометрия эти гены не метилированы. Промотор гена KRT19, в отличие от промотора KLF11, также метилирован в образцах аденомиоза, что показывает на генном уровне наличие как сходств, так и различий в молекулярных механизмах, регулирующих развитие аденомиоза и роста миоматозных узлов. На рисунке на цв. вклейке показаны варианты хроматограмм, полученных при секвенировании образцов, на которых визуально определяется как наличие метилирования, так и его уровень (см. рисунок, а — в двух миомах уровень метилирования 50 и 100%). В образцах крови, тканях плаценты и в амниотической жидкости метилирование обоих генов отсутствует, что указывает на полноценную экспрессию этих генов в нормальных тканях организма, тогда как экспрессия генов KRT19 и KLF11 при опухолевых процессах (в частности, при развитии миоматозного узла) подавляется за счет эпигенетической регуляции.

Результаты анализа метилирования промоторных областей генов

Профиль метилирования участка промотора гена KLF11 (а) и KRT19 (б) в трех тканях (аденомиоз, миома, миометрий).

Желтыми звездочками обозначены сайты метилирования, в которых метилирование отсутствует (на хроматограмме видны только красные пики тимидинов), красными — сайты с метил-группами на цитозиновых основаниях (на хроматограмме имеются синие пики цитозина либо вместе с красными пиками, либо без них, при 100% метилирования данного сайта).

Обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют о функциональной роли сайленсинга генов, регулируемого с помощью метилирования промоторных областей генов KLF11 и KRT19, в патогенезе лейомиомы матки, поскольку в подавляющем большинстве миоматозных узлов подтвердилось наличие метилирования в промоторных областях обоих генов.

Известно, что гены KLF11 (Круппель-подобный фактор) и KRT19 (цитокератин 19) являются опухолевыми супрессорами, а их метилирование дает возможность снизить экспрессию этих генов, тем самым давая клеткам миомы возможность бесконтрольно делиться. Ранее уже получены данные о метилировании этих генов на ограниченном числе образцов [16], поэтому потребовалось более широкое исследование для того, чтобы выяснить, насколько универсален данный эпигенетический механизм для лейомиом пациенток, в частности, в российской популяции.

Наши результаты продемонстрировали что механизм метилирования генов KLF11 и KRT19 универсален для всех миоматозных узлов и не зависит от этнической принадлежности пациенток. Примечателен то факт, что метилирование генов KLF11 и KRT19 в образцах миом подтвердилось практически в 99% случаев, однако в некоторых образцах миометрия также выявлено метилирование промотора KRT19 (в одном случае примерно 50%, еще в двух — слабое). Это позволяет предположить, что некоторые механизмы изменения статуса метилирования в ткани миометрии тоже могут существовать. Однако тот факт, что во всех исследованных миоматозных узлах есть метилирование, может быть полезен сразу в нескольких аспектах.

Как следует из ранее опубликованных данных, набор дифференциально метилированных генов между миоматозными узлами и здоровым эндометрием довольно обширен, и при сопоставлении результатов, полученных в разных лабораториях, совпадение лишь частичное [17—19].

Значительное перекрытие дифференциально экспрессируемых генов наблюдается между стромой шейки матки и миомой матки по сравнению с нормальным миометрием. Эти результаты указывают на возможную роль метилирования ДНК в биологии миомы и позволяют предполагать, что трансформация клеток миометрия в более цервикальный фенотип стромы может быть важным механизмом этиологии заболевания [20].

В целом биологическая значимость аберрантно метилированных и экспрессируемых генов играет огромную роль во множестве опухолевых процессов, в том числе онкогенных. Исследования дифференциального метилирования миом позволили выявить в них не только характерные для опухолевых процессов гены, но и ряд генов, специфично метилирующихся именно в миоматозных узлах. Так, R. Maekawa и соавт. обнаружили в миомах 22 гена-мишени рецептора эстрогена (ER) альфа, включая гены, связанные с апоптозом, которые имеют аберрантное метилирование ДНК в промоторе, что позволило им высказать гипотезу о том, что аберрантная эпигенетическая регуляция генов-мишеней ER альфа способствует аберрантной реакции на эстроген [15]. Это означает, что имеется множество мишеней для абберантного метилирования в миомах разных типов, однако пока не проведены исследования, позволяющие выяснить специфичность метилирования генов в миомах разных типов. В нашей работе также не удалось обнаружить разницы в метилировании генов в миоматозных узлах, содержащих соматическую драйвер-мутацию в гене MED12, и в узлах без такой мутации.

Относительно практического применения данных о специфическом метилировании некоторых генов в миомах некоторые исследования продемонстрировали эффективность терапевтического воздействия, меняющего метилирование генов [21—23].

В статье, опубликованной в журнале Endocrinology S. Liu и соавт., представлено исследование возможности препятствования развитию лейомиом с помощью лечения эпигенетическим модулятором 5’-Аза-цитидином [22]. Основываясь на своих предыдущих результатах и новых разработанных этой группой подходах [23, 24], ученые с помощью флуоресцентной сортировки клеток (FACs) с использованием CD34 и CD49 выделили из образцов тканей лейомиом три популяции клеток: стволовые клетки (LSC), промежуточные клетки (LIC) и дифференцированные клетки (LD), которые исследованы с помощью транскриптомного и метиломного анализов. Анализ экспрессии генов в этих трех типах клеток выявил нарушения регуляции специфических наборов генов для каждой клеточной популяции. В частности, в LDS-клетках происходит активация путей, связанных с трансформирующим фактором роста бета (TGF-β), что указывает на дифференцировку и старение, в то время как в LSC-клетках выявлены маркеры передачи сигналов клеточного цикла, а также кластеры генов, участвующих в иммунном ответе. Интересно, что белок TET1 (а также TET3 в меньшей степени) является основным фактором, участвующим в деметилировании генома, и именно этот ген экспрессируются на низком уровне в клетках LSC, что несколько противоречит здравому смыслу, учитывая, что деметилирование является особенностью менее дифференцированных клеток, по крайней мере, в эмбриональном развитии. Сопоставление данных по LSCS-клеткам и двух других популяций клеток выявило паттерны, характерные для стволовых клеток, регулирующих такие процессы как «дифференцировка эндотелия стволовых клеток», «передача сигналов Notch стволовыми клетками» и «реакция стволовых клеток на гипоксию». Авторы предполагают, что эта специфическая группа генов (деметилированных и сверхэкспрессированных) представляет собой движущую силу для стимуляции роста популяции клеток LSC при формировании лейомиомы и регулирует ее дальнейшее развитие. Кроме того, локус-специфичный геномный анализ выявил дифференциальное метилирование ряда других генов, важных для дифференцировки/пролиферации клеток, таких как ESR1, TIMP3, ROR2 и MYH11, в сочетании с изменением количества соответствующих мРНК вследствие терапевтического воздействия 5’-аза-цитидином (вещество, индуцирующее деметилирование генома). Лечение 5’AZA, вызывающее деметилирование генов, заставляет LSC-клетки превращаться в LSD-клетки, что замедляет рост опухоли за счет истощения популяции клеток с потенциями стволовых. Эти результаты могут в будущем помочь найти новый путь к лечению лейомиом [25].

Результаты, полученные в данной работе, могут быть в дальнейшем использованы для решения как минимум двух задач.

Во-первых, появилась возможность определения типа ткани — создания быстрой тест-системы, позволяющей отличить ткань миомы от другой опухолевой ткани (например, лейомиомаркомы) и других патологически измененных клеток миометрия. Такая задача в настоящее время решается методами гистопатологии, но это занимает много времени, тогда как вопрос о злокачественности/доброкачественности опухоли часто необходимо решать интраоперационно, в течение нескольких часов.

Во-вторых, гены, подвергающиеся в опухолях метилированию, могут служить мишенями для создания новых терапевтических средств, как уже описано выше, что имеет огромное значение для практического здравоохранения с учетом того, что миома матки встречается у каждой третьей пациентки репродуктивного возраста. В случае с генами KLF11 и KRT19 первый ген метилирован только в миомах и является маркером только для миоматозной ткани, а второй также метилирован и в аденомиозе, что может помочь создать терапевтический препарат, эффективный как в отношении миом, так и в отношении аденомиоза.

Заключение

Дальнейшие исследования роли эпигенетической регуляции генов в развитии лейомиом позволят выделить ряд генов, метилирование промоторных областей которых отличается в клетках миом различных молекулярных типов, и глубже понять механизмы развития опухолей на уровне регуляции работы генома.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Кузнецова М.В., Трофимов Д.Ю., Адамян Л.В.

Сбор и обработка материала — Тоноян Н.М., Свирепова К.А.

Написание текста — Тоноян Н.М., Кузнецова М.В.

Редактирование — Адамян Л.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.