Гетерогенность молекулярного фенотипа опухоли при миоме матки. Сообщение II

Миома матки представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему в связи с широкой распространенностью этого заболевания, неясным этиопатогенезом, тенденцией к рецидивированию и отсутствием оптимальных алгоритмов лечения и профилактики [1—3].

Хотя этиопатогенетические механизмы миомы матки до конца не вскрыты, сомнений в генетической гетерогенности происхождения этой опухоли не возникает [1, 4—6]. Явление генетической гетерогенности заключается в том, что один и тот же патологический фенотип может быть обусловлен различными мутациями в одном и том же гене либо мутациями в различных генах. Продукты генов, ответственные за возникновение генетически гетерогенной патологии, могут функционировать в одних и тех же тканях как структурные белки, ферменты, транскрипционные факторы или звенья сигнальной трансдукции [7, 8].

В настоящее время выделяют два молекулярных фенотипа миомы матки: ассоциированный с соматическими мутациями в гене MED12 (MED12+) и не ассоциированный с соматическими мутациями в гене MED12 (MED12–). Мутации в гене MED12 выявляются в клетках миоматозных узлов у 73% пациенток. Чаще всего это миссенс-мутации в кодоне 44 и делеции различной протяженности. Роль этих мутаций еще точно не выяснена. Предполагают, что они влияют на активность других генов, кодирующих белки, участвующие в росте и развитии лейомиомы матки [8, 9].

События, инициирующие развитие миомы матки и ее рецидивирование, пока неизвестны. В этом направлении перспективным представляется молекулярно-генетический анализ процессов, происходящих в опухоли и опухолевом микроокружении, призванный способствовать разработке критериев идентификации женщин, подверженных как развитию миомы матки, так и ее рецидивированию [10, 11].

Цель исследования — изучение профилей экспрессии 17 генов-кандидатов в клетках морфологически верифицированных миоматозных узлов и неизмененного миометрия при ассоциированном и не ассоциированном с мутациями в гене MED12 молекулярном фенотипе миомы матки.

Материал данного исследования представляет собой 133 биологических образца миоматозных узлов (85 образцов миоматозных узлов и 48 образцов морфологически неизмененного миометрия), полученных от 48 женщин, оперированных по поводу одиночной и множественной миомы матки в гинекологических отделениях ФГБУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента Российской Федерации и ГБУЗ «ГКБ №15 ДЗМ» в 2022—2023 гг.

Молекулярно-генетическое исследование проводили в лаборатории молекулярно-генетических методов и онкологической генетики Института репродуктивной генетики ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения РФ.

Исследовали экспрессионный профиль 17 генов-кандидатов (PAPPA1, GRPR, TYMS, PLAG1, VCAN, AVPR1A, ESR1, PLA2R1, RANKL, KLF11, KRT19, MMP11, ADAM12, MMP16, PCP4, SATB2, WIF1), предположительно вовлеченных в патогенез миомы матки (см. Приложение) и отобранных на основании биоинформатического анализа [12—14].

Образцы каждого миоматозного узла всех пациенток методом секвенирования по Сэнгеру тестировали на наличие соматических мутаций в гене MED12. С целью подтверждения соматической природы мутаций в гене MED12 также секвенировали образцы периферической крови всех пациенток.

Экспрессионный профиль отобранных генов измеряли в образцах ткани миоматозных узлов и образцах морфологически неизмененного миометрия с помощью методов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакцию ставили в двух повторах. Для каждого маркера рассчитывали среднее значение Ct по методике О.В. Бурменской и соавт. [15]. Уровень представленности транскриптов рассчитывали методом сравнения индикаторных циклов (методом ∆Ct) с нормировкой относительно нормировочного фактора, рассчитанного по референсным генам B2M, GUSB [16].

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование выполнено в 1-м патологоанатомическом отделении ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения РФ. Из каждого миоматозного узла вырезали блоки размером 1,5×1,5×0,7 см, которые фиксировались в забуференном формалине в течение суток. Материал обработан по стандартной методике и залит в парафин. Для гистологического исследования с парафиновых блоков получали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином. Для определения суррогатного молекулярного подтипа образцов лейомиом проводили иммуногистохимическое исследование. Парафиновые срезы наносили на стекла с адгезивным покрытием PCI (Citotes tLabware, Biovitrum). Микропрепараты окрашивали при помощи иммуностейнера BenchMark XT (Ventana, Roche, Швейцария) по стандартным протоколам (температура инкубации 37°C, время инкубации 20 мин) с помощью панели детекции DAB UniversalultraView (Ventana, Roche) по стандартной методике. При помощи метода ручного титрования на предметное стекло с адгезивным покрытием наносили первичное поликлональное антитело к HMGA2 (abcam, ab97276, концентрация 1/100). Реакция считалась положительной при наличии ядерного окрашивания в клетках опухоли.

Статистический анализ осуществляли с помощью пакета программ IBM SPSS Statistics 17.0. Статистически значимыми считали различия при уровне p<0,05. В качестве меры центральной тенденции в группах исследования рассчитывали медиану (Me). Данные по группам исследования представлены в виде значений медиан (Me), 1-го и 3-го квартилей (Q₁; Q₃). Анализ сравнения двух групп проводился с использованием U-критерия Манна—Уитни.

Все образцы миоматозных узлов, в том числе от пациенток с множественными узлами, а также образцы периферической крови 48 пациенток тестировали на наличие мутаций во втором экзоне гена MED12 методом секвенирования по Сэнгеру. В результате исследуемая выборка пациенток разделилась на три группы в зависимости от наличия/отсутствия мутаций в гене MED12 в образцах тканей миоматозных узлов:

1) пациентки с мутациями в гене MED12 (17 пациенток, 28 миоматозных узлов, включая множественные);

2) пациентки без мутаций в гене MED12 (22 пациентки, 29 миоматозных узлов, включая множественные);

3) пациентки с тем и другим молекулярным фенотипом миоматозных узлов (9 пациенток, 29 миоматозных узлов).

В образцах периферической крови ни у одной из 48 пациенток мутации в гене MED12¹ не были обнаружены, что свидетельствует о соматическом происхождении (в клетках миомы матки) этих мутаций.

Для изучения особенностей молекулярных фенотипов миомы матки MED12+ и MED12– предпринят сравнительный анализ экспрессионного профиля генов-кандидатов HMGA2, PAPPA1, GRPR, TYMS, PLAG1, VCAN, AVPR1A, ESR1, PLA2R1, RANKL, KLF11, KRT19, MMP11, ADAM12, MMP16, PCP4, SATB2, WIF1 в соответствующих образцах миоматозных узлов и миометрия (табл. 1).

Таблица 1. Результаты сравнительного анализа экспрессионных профилей генов-кандидатов в образцах миоматозных узлов MED12+ и MED12–

Примечание. Здесь и далее: различия являются статистически достоверными при p<0,01.

Как видно в табл. 1, между экспрессионными профилями исследуемых генов в образцах миоматозных узлов MED12+ и MED12– обнаружены следующие различия:

1) уровень экспрессии генов PAPPA1, VCAN, PLA2R1, ESR1, AVPR1A, RANKL, KRT19, MMP11 и PCP4 в миоматозных узлах MED12+ достоверно повышен по сравнению с миоматозными узлами MED12–; и достоверное понижение экспрессии гена PLAG1;

2) уровень экспрессии гена HMGA2 в образцах миоматозных узлов MED12– повышен по сравнению с образцами миоматозных узлов MED12+, несмотря на видимое отсутствие статистической достоверности, что объясняется большим разбросом уровней экспрессии этого гена в разных миоматозных узлах. Зато на диаграмме отчетливо видно, что в образцах миоматозных узлов с молекулярным фенотипом MED12+ повышенная экспрессия гена HMGA2 практически не наблюдается (рис. 1).

Рис. 1. Экспрессионный профиль генов-кандидатов в миоматозных узлах с мутацией и без мутации в гене MED12.

Этот феномен побудил нас предпринять сравнительный анализ экспрессии генов-кандидатов в образцах миоматозных узлов MED12– с повышенным и пониженным уровнем экспрессии гена HMGA2 и в соответствующих образцах миометрия (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение экспрессионного профиля генов-кандидатов в образцах миоматозных узлов MED12– с повышенной экспрессией гена HMGA2 и в соответствующих им образцах миометрия

Примечание. p=0,05. Приемлемая граница статистической значимости — довольно большая вероятность ошибки (5%).

Как видно в табл. 2, в миоматозных узлах с повышенной экспрессией гена HMGA2 наблюдается достоверно повышенная экспрессия генов GRPR, PLAG1, WIF1 и достоверно сниженная экспрессия генов PAPPA1, VCAN, PLA2R1, KRT19 по сравнению с соответствующими образцами миометрия.

Для выяснения вопроса, имеются ли различия между экспрессионным профилем генов-кандидатов в миоматозных узлах MED12– с повышенной и пониженной экспрессией гена HMGA2 (HMGA2+ и HMGA2– соответственно), предпринят сравнительный анализ.

В табл. 3 видно, что в миоматозных узлах MED12– с повышенной экспрессией гена HMGA2 наблюдается повышенная экспрессия гена PLAG1 (гена полиморфной аденомы 1) и гена GRPR (гена гастрин-высвобождающего пептида) и пониженная экспрессия гена VCA по сравнению с миоматозными узлами MED12– с пониженной экспрессией гена HMGA2.

Таблица 3. Результаты сравнительного анализа экспрессионных профилей генов-кандидатов в образцах миоматозных узлов MED12– с HMGA2+ и образцах миоматозных узлов MED12– с HMGA2–

Интерес представляют результаты иммуногистохимического исследования миоматозных узлов с молекулярным фенотипом MED12– и с повышенной и пониженной экспрессией гена HMGA2. Так, при определении суррогатного молекулярного подтипа опухолей в 39% случаев обнаружена повышенная экспрессия гена HMGA2(рис. 2). При обзорной световой микроскопии микропрепаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, в миоматозных узлах с молекулярным фенотипом MED12– и повышенной экспрессией гена HMGA2 чаще обнаруживалась гиперваскуляризация по сравнению с образцами миоматозных узлов дикого типа (36,4% и 17,6% соответственно) (рис. 3а). Кроме того, в миоматозных узлах с молекулярным фенотипом MED12– и повышенной экспрессией гена HMGA2 чаще наблюдалась повышенная клеточность по сравнению с миоматозными узлами с пониженной экспрессией гена HMGA2(рис. 3б).

Рис. 2. Результаты иммуногистохимического исследования с антителом к HMGA2.

а, б — положительная ядерная реакция в клетках лейомиомы; в, г — отрицательная реакция в клетках опухоли.

Рис. 3. Морфологические признаки в группе опухолей, связанных с мутацией HMGA2.

а — образование большого количества сосудов в структуре опухолевой ткани (гиперваскуляризация). Окраска гематоксилином и эозином, ×100; б — гиперцеллюлярные зоны в лейомиоме. Окраска гематоксилином и эозином, ×50.

Представлены данные, которые свидетельствуют о том, что при разных молекулярных фенотипах миомы матки, ассоциированных и не ассоциированных с соматическими мутациями в гене MED12 (MED12+ и MED12– соответственно), экспрессионный профиль определенных генов, первоначально отобранных в качестве потенциальных патогенетических маркеров миомы матки, достоверно различается. Главным различием является пониженный уровень экспрессии гена HMGA2 в миоматозных узлах MED12+ и, наоборот, гиперэкспрессия гена HMGA2 в миоматозных узлах MED12– по сравнению с соответствующими образцами миометрия. По-видимому, соматическая мутация в гене MED12 непосредственно влияет на экспрессию гена HMGA2.

Как известно, одной из функций гена HMGA2 является регуляция транскрипции. Этот ген часто подвергается амплификации и различным перегруппировкам, которые ведут к увеличению его экспрессии [17, 18]. Повышенная экспрессия гена HMGA2 способна индуцировать мезенхимальный и эпителиальный онкогенез, а также участвует в генезе доброкачественных и злокачественных опухолей, происходящих из тканей-производных мезенхимы, имеющих дизэмбриогенетическое происхождение. Чаще всего это опухоли пищевода, желудка и лейомиома [19].

Согласно данным настоящего исследования, в части миоматозных узлов с молекулярным фенотипом MED12– наблюдается гиперэкспрессия гена HMGA2, а в части — пониженная экспрессия гена HMGA2. Экспрессионный профиль других генов-кандидатов в миоматозных узлах MED12– с повышенной/пониженной экспрессией гена HMGA2 также различается. К тому же, согласно данным проведенного иммуногистохимического исследования, в 39% образцов миоматозных узлов с молекулярным фенотипом MED12– и HMGA2+ чаще, чем в образцах миоматозных узлов с молекулярным фенотипом MED12– и HMGA2–, определяется гиперваскуляризация и повышенная клеточность.

Таким образом, на данном этапе исследования получены результаты, свидетельствующие о том, что патогенез миомы матки, несомненно, гетерогенен. Для понимания роли как соматических мутаций в гене MED12, так и роли гена HMGA2 и других генов в патогенезе гетерогенных вариантов миомы матки и ее рецидивирования требуются дальнейшие исследования. Не исключено, что и фенотип пациенток, страдающих миомой матки с разными молекулярными фенотипами, имеет свои особенности, что, собственно, и предстоит выяснить в последующих исследованиях. Результаты нашей работы могут пролить свет на практическую значимость данной проблемы уже на этапе обследования пациенток с учетом маркеров MED12+/– и особенности гетерогенности молекулярного генотипа опухоли для определения тактики оперативного лечения, противорецидивной терапии и методов восстановительного лечения у больных репродуктивного возраста с миомой матки и бесплодием.

Источник финансирования. Номер гранта РНФ 23-15-00069.

Source of funding. The RGNF grant number is 23-15-00069.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Адамян Л.В., Акуленко Л.В., Нерсесян Е.А., Кузнецова М.В.

Сбор и обработка материала — Нерсесян Е.А., Кузнецова М.В., Чернышенко Т.А., Ненахов Ф.В., Бурменская О.В., Тоноян Н.М., Михайловская Г.В., Свирепова К.А., Трофимов Д.Ю.

Статистическая обработка данных — Нерсесян Е.А., Раснер П.И.

Написание текста — Нерсесян Е.А., Акуленко Л.В., Кузнецова М.В., Бадлаева А.С.

Редактирование — Кузнецова М.В., Адамян Л.В., Акуленко Л.В., Асатурова А.В., Нерсесян Е.А.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

HMGA2 — кодируемый белок функционирует как архитектурный фактор, является важным компонентом энхансеосом, содержит структурные ДНК-связывающие домены и может действовать как фактор, регулирующий транскрипцию [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

PAPPA1 — обеспечивает активность металлоэндопептидазы. Расположен во внеклеточном пространстве, учувствует в ответе на фолликулостимулирующий гормон и глюкокортикоиды. Ортологичен человеческому PAPP-A [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

GRPR — гастрин-высвобождающий пептид (GRP) является мощным митогеном для неопластических тканей [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

TYMS — тимидилатсинтаза катализирует метилирование дезоксиуридилата до дезокситимидилата с использованием 10-метилентетрагидрофолата (метилен-THF) в качестве кофактора. Полиморфизмы в этом гене связывают с этиологией неоплазии, включая рак молочной железы, и ответом на химиотерапию [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

PLAG1 — протоонкоген, фактор транскрипции, активация которого приводит к усилению регуляции генов-мишеней, таких как IGFII, что приводит к неконтролируемой пролиферации клеток. При сверхэкспрессии в культивируемых клетках наблюдается более высокая скорость пролиферации и трансформации. Другие гены-мишени, такие как CRLF1, CRABP2, CRIP2, PIGF, сильно индуцируются в клетках с индукцией PLAG1 [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

VCAN — кодируемый белок является основным компонентом внеклеточного матрикса, участвует в клеточной адгезии, пролиферации, миграции и ангиогенезе, играет центральную роль в морфогенезе и поддержании тканей [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

AVPR1A — белок, кодируемый этим геном, действует как рецептор аргинина-вазопрессина. Рецептор опосредует сокращение и пролиферацию клеток, агрегацию тромбоцитов, высвобождение фактора свертывания и гликогенолиз [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

ESR1 — белок, кодируемый этим геном, регулирует транскрипцию многих эстроген-индуцируемых генов, которые играют роль в росте, метаболизме, половом развитии, беременности и других репродуктивных функциях, и экспрессируется во многих нерепродуктивных тканях [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

PLA2R1 — ген представляет собой рецептор фосфолипазы A2. Полиморфизмы в этом локусе связаны с восприимчивостью к идиопатической мембранозной нефропатии [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

RANKL — участвует в регуляции функций факторов некроза опухоли и клеточного апоптоза [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

KLF11 — промоторные области отвечают за структурную целостность эпителиальных клеток, экспрессируются в различных тканях, в том числе в эндометрии, яичнике, плаценте и других. Белок часто метилирован в тканях миом, тогда как в морфологически неизмененном миометрии метилирование отсутствует [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

KRT19 — участвует в разрушении внеклеточного матрикса и ремоделировании тканей, часто метилирован в тканях миом, тогда как в морфологически неизмененном миометрии метилирование отсутствует [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

MMP11 — участвует в нормальных физиологических процессах созревания органов репродуктивной системы в период эмбрионального развития [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

ADAM12 — ген участвует в различных биологических процессах, включая взаимодействие «клетка — клетка» и клеточный матрикс. Экспрессия этого гена была использована в качестве сывороточного маркера внутриутробного развития. Изоформы связаны с мембраной [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

MMP16 — белки семейства матриксных металлопротеиназ (MMP) участвуют в разрушении внеклеточного матрикса в эмбриональном развитии, репродукции и ремоделировании тканей [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

PCP4 — обеспечивает активность связывания ионов кальция и кальмодулина. Участвует в сигнальном пути кальмодулин-зависимой киназы и в позитивной регуляции дифференцировки нейронов. Биомаркер болезни Гентингтона и лейомиомы [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

SATB2 — ген кодирует ДНК-связывающий белок, специфически связывающий участки прикрепления ядерного матрикса. Кодируемый белок участвует в регуляции транскрипции и ремоделировании хроматина [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

WIF1 — ген действует как ген-супрессор опухоли, он эпигенетически подавляется при различных видах рака [база данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov].

¹ В дальнейшем в тексте молекулярный фенотип миомы матки с соматической мутацией в гене MED12 обозначается как MED12+, а без мутации — как MED12–.