Введение
Гибель клеток является основой большинства патологических процессов, а также незаменимым элементом регуляции роста и развития нормальных тканей. До недавнего времени сохранялось мнение о том, что существует две формы гибели клеток: регулируемая гибель клеток (RCD) и некроз. Апоптоз считали синонимом RCD, но в последние годы открыто несколько типов неапоптотических RCD. Термин ферроптоз введен в употребление в 2012 г. [1] для описания формы гибели клеток, вызванной низкомолекулярным эрастином, который ингибирует импорт цистина, что приводит к истощению глутатиона и инактивации фосфолипидпероксидазы глутатионпероксидазы 4 (GPX4) [2]. GPX4 превращает потенциально токсичные гидропероксиды липидов (LOOH) в нетоксичные.
Фактически, еще до введения термина ферроптоз эта форма гибели клеток уже наблюдалась in vitro: две группы исследователей обнаружили, что два низкомолекулярных соединения, эрастин и RSL3 (низкомолекулярный ингибитор GPX4), избирательно вызывали гибель опухолевых клеток, мутантных по гену RAS [3, 4]. Этот процесс может быть предотвращен хелаторами железа и опосредован наличием клеточного железа. Ферроптоз отличается от апоптоза, аутофагии и некроза на биохимическом, морфологическом и генетическом уровнях [5]. Именно поэтому данный процесс получил самостоятельное название [1, 3, 4, 6]. Исследователи постепенно уточняют механизм ферроптоза, продемонстрировав, что в этом процессе участвуют аминокислоты, липиды и реакция окисления—восстановления [1, 2, 7—9]. Железозависимое накопление перекисей липидов и повышение уровня перекисей липидов, вызванное ингибированием GPX4, являются двумя основными путями, ведущими к ферроптозу. Таким образом, подавление перекисного окисления липидов необходимо в клетках млекопитающих для предотвращения начала ферроптоза, который может возникать по умолчанию в условиях, когда GPX4 инактивирована.
Ферроптоз играет жизненно важную роль в организме человека и участвует в инициации и развитии множества заболеваний, например, в онкогенезе, ишемическом повреждении, почечной недостаточности, заболеваниях нервной системы и гематологических заболеваниях [2, 9—11]. Считается, что ферроптоз может быть физиологическим, а не патологическим или органоспецифическим процессом, и часто выявляется в организме млекопитающих. Ферроптоз имеет несколько общих черт с другими формами клеточной гибели [10, 12]. Большинство исследователей сходятся во мнении, что в клетках, подвергающихся ферроптозу, обычно обнаруживаются морфологические изменения, подобные некрозу [12]. Эти особенности включают нарушение целостности плазматической мембраны, набухание цитоплазмы (онкоз) и цитоплазматических органелл, умеренную конденсацию хроматина. На ультраструктурном уровне в ферроптозных клетках обычно обнаруживаются аномалии митохондрий, такие как конденсация или набухание, повышенная плотность мембраны, уменьшение или отсутствие крист, а также разрыв внешней мембраны [1, 6, 9]. Несмотря на значительные изменения морфологии митохондрий, роль этих органелл в ферроптозе остается спорной. Митохондрии являются центром метаболизма и важным источником активных форм кислорода (АФК) в большинстве клеток млекопитающих. В противоречие с ранним исследованием, показывающим, что продукция АФК, опосредованная митохондриями, не является необходимой для ферроптоза [1], более свежие данные свидетельствуют, что митохондриально-опосредованная продукция АФК, стресс ДНК и метаболическое перепрограммирование необходимы для перекисного окисления липидов и индукции ферроптоза [13, 14].
Механизм ферроптоза
Пероксиды железа и липидов являются двумя основными участниками ферроптоза [1, 6—8]. Накопление перекисей липидов, в основном фосфатидилэтаноламин-OOH (ФЕ-OOH), в конечном итоге приводит к ферроптозу [7], в то время как железо служит катализатором или компонентом ключевого регулятора ферроптоза [15]. Таким образом, хелаторы железа (например, дефероксамин) и некоторые липофильные антиоксиданты (например, α-токоферол) могут предотвратить ферроптоз [16]. Кроме того, АФК, которые образуются в результате реакции Фентона, катализируемой железом, способствуют инициации ферроптоза [15].
Накопление перекиси липидов
В физиологических условиях перекиси липидов (например, ФЕ-OOH) восстанавливаются до соответствующих высших спиртов (например, ФЕ-OH) редуктазой для защиты клеток от окислительного стресса [2, 17]. Эти процессы, вызывающие накопление перекиси липидов, условно можно разделить на две группы: процессы, которые способствуют образованию перекисей липидов, и процессы, которые ингибируют восстановление перекиси липидов.
Процессы, которые ингибируют восстановление перекисей липидов
GPX4 восстанавливает токсичные перекиси жирных кислот до нетоксичных высших спиртов в присутствии кофактора GPX4 глутатиона (GSH) [2, 17]. GPX4 защищает клетки от ферроптоза путем устранения внутриклеточных пероксидов жиров. Ингибирование GPX4 запускает ферроптоз [2, 8, 18]. Содержащая 8 нуклеофильных аминокислот GPX4 может вступать в реакцию с электрофилами в клетке [8]. Селен необходим GPX4 для поддержания его резистентной к ферроптозу активности, а замена селеноцистеина цистеином сенсибилизирует клетки к ферроптозу [8, 19]. Инактивация или отсутствие GPX4 вызывает накопление перекисей липидов, что рассматривается как сигнал ферроптотической гибели клеток. Таким образом, ингибирование GPX4 является критическим этапом ферроптоза.
Процессы, способствующие образованию перекисей липидов
Липиды играют решающую роль в энергообеспечении и составе внутриклеточной мембранной системы. Оксигенация фосфолипидов (ФЛ) (например, фосфатидилхолин, кардиолипин) способствует ферроптозу в клетках [7, 8, 20]. Известно, что перекиси липидов образуются в клетках тремя основными путями, для осуществления каждого из которых необходимо железо:
1) липидные АФК, образующиеся в результате реакции Фентона неферментативным путем. Ионы железа (II) окисляются пероксидом водорода до ионов железа (III):
Fe2++H2O2 → Fe3++OH+OH−;
2) перекиси липидов, образующиеся при оксигенации и этерификации полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) [7, 8, 21];
3) перекиси липидов, образующиеся при аутоксидации липидов способом, катализируемым железом [22]. Реакция Фентона является неорганической химической реакцией и широко встречается в природе.
Эти пути, безусловно, участвуют в ферроптозе, но неизвестно, является ли какой-то из них основным или они параллельны. Еще больше свидетельств в пользу вывода о том, что перекисное окисление ПНЖК является основным регулятором ферроптоза.
Автоокисление липидов, катализируемое железом
Липоксигеназы — это железосодержащие негеминовые диоксигеназы, которые катализируют введение кислорода в ПНЖК в бис-аллильном положении в бислойных ФЛ-структурах [7, 23]. Некоторые ферменты могут окислять жирные кислоты в клетках [24], но только ингибиторы арахидонат-5-липоксигеназы (LOX-5) могут предотвратить ферроптоз [7]. Похоже, что ферроптоз является LOX-зависимым процессом, но R. Shah и соавт. обнаружили, что не все ингибиторы LOX предотвращают ферроптоз. Все соединения, способные ингибировать ферроптоз, идентифицированы как антиоксиданты, захватывающие радикалы (РТС), функция которых заключается в защите клеток от автоокисления — автокаталитической классической свободнорадикальной цепной реакции, способной генерировать гидроперекиси липидов в присутствии железа [20]. В этой работе показано, что автоокисление липидов может быть конечным процессом ферроптоза, а не контролируемым LOXs перекисным окислением липидов. Автоокисление липидов, во-первых, участвует в ферроптозе, во-вторых, может быть конечным процессом ферроптоза, а не контролируемым липооксигеназами перекисным окислением липидов, в-третьих, приводит к конечному процессу гибели клеток, в то время как перекисное окисление липидов просто способствует инициации автоокисления липидов. Кроме того, ненасыщенность ПНЖК делает молекулу более чувствительной к автоокислению [20]. Это объясняет, почему ПНЖК являются основными субстратами, которые окисляются при ферроптозе.
Окисление ПНЖК вредно для клеток при истощении GSH; однако этот летальный эффект незначителен при нормальном уровне внутриклеточного GSH [8]. Получается, что истощение, инактивация или потеря GSH может вносить больший вклад в ферроптоз, чем окисление ПНЖК; то есть процессы, ингибирующие восстановление перекисей липидов, вносят больший вклад в инициацию ферроптоза, чем процессы, способствующие образованию перекисей липидов. Таким образом, мы приходим к выводу, что ферроптоз — это окислительная гибель клеток, вызванная уменьшением восстановительных реакций.
Следует также отметить, что ферроптоз может происходить двумя основными путями: это внешний или транспортно-зависимый путь (например, снижение поглощения цистеина или глутамина и увеличение поглощения железа), а также внутренний или ферментативный регулируемый путь (например, ингибирование GPX4).
Обобщенные данные показывают, что ферроптоз отличается от других форм клеточной смерти, но эти различные формы клеточной смерти не являются независимыми. Различные формы гибели клеток, вероятно, связываются друг с другом, образуя сеть, опосредующую доступность клеток. Исследования этой сети, безусловно, помогут лучше понять трудноизлечимые заболевания, такие как опухоли, нейродегенеративные заболевания и мужское бесплодие.
В последнем случае есть несколько факторов, которые нацеливают исследователей на изучение роли ферроптоза в развитии этой патологии. Во-первых, плазматическая мембрана сперматозоидов млекопитающих образована высокими концентрациями ПНЖК, что делает ее восприимчивой к процессу перекисного окисления липидов, приводящему к необратимому повреждению клеток, и может стать причиной бесплодия. Во-вторых, известно [25], что доставка железа в клетки осуществляется с помощью трансферрина и рецепторов к нему, а также лактотрансферрина [26], а сперматозоиды покрыты слоем скаферрина (аналог лактотрансферрина), и нарушение в этой системе может вызвать ферроптоз. В-третьих, доказана [27] важная роль цинка в формировании мужской фертильности и в функции сперматозоидов. Можно предположить, что цинк может играть роль, как и железо, в ферроптозе, так как способен продуцировать АФК по реакции Фентона.
Бусульфан обычно используется для химиотерапии рака, тем не менее он вызывает мужское бесплодие через повреждение половых клеток. Авторы исследования [28] сделали попытку выяснить основной механизм этого явления. Продемонстрировано, что ферроптоз участвует в развитии вызванной бусульфаном олигоспермии у мышей. Мышам делали тестикулярную инъекцию бусульфана с обеих сторон в дозе 4 мг на 1 кг массы тела для установления модели олигоспермии. Спустя 4 недели у мышей, получавших бусульфан, наблюдались пониженная концентрация и подвижность сперматозоидов наряду с особенностями типичного ферроптоза в яичке, такими как повышенное содержание малонового диальдегида (MDA), экспрессия мРНК простагландин-эндопероксидсинтазы (PTGS2), снижение содержания NADPH. Ингибирование ферроптоза ферростатином-1 (Fer-1) или дефероксамином (DFO) частично облегчает индуцированную бусульфаном олигоспермию у мышей. Кроме того, обнаружено, что обработка бусульфаном вызывала ферроптоз сперматогенных клеток путем подавления экспрессии фактора 2-го типа, связанного с ядерным фактором-E2 (Nrf2) и GPX4, и снижения выделения железа за счет снижения экспрессии ферропортина 1-го типа (FPN1). Fer-1 или DFO, очевидно, ингибировали вызванный бусульфаном ферроптоз путем увеличения экспрессии Nrf2, GPX4 и FPN1. Кроме того, после активации Nrf2 сульфорафаном концентрация и подвижность сперматозоидов у мышей, получавших бусульфан, увеличилась, что сопровождалось усилением экспрессии GPX4 и FPN1. Эти данные предполагают, что индуцированный бусульфаном ферроптоз может быть опосредован посредством ингибирования сигнального пути Nrf2-GPX4 (FPN1), и подчеркивают, что нацеливание на ферроптоз служит потенциальной стратегией для предотвращения индуцированного бусульфаном повреждения и мужского бесплодия.
Наиболее частой причиной мужского бесплодия является нарушение функции сперматозоидов, на которое могут влиять генетические нарушения, инфекции половых путей, медицинские вмешательства, загрязнение окружающей среды. Курение сигарет также признано риском для мужского здоровья. Однако молекулярные механизмы этого влияния не ясны. Группа исследователей из Гуанчжоу оценила основные параметры спермы у некурящих и заядлых курильщиков. Уровни GSH, реактивных форм кислорода (ROS), железа и GSH-зависимого белка GPX4 наблюдались в семенной плазме человека и в культуре клеток, подвергшихся воздействию конденсата сигаретного дыма (CSC) [29].
Сигаретный дым содержит высокие концентрации оксида азота, пероксинитрита и свободных радикалов, которые потенциально могут вызывать выработку АФК в организме человека. В это исследование включены образцы спермы 70 заядлых курильщиков и 75 некурящих, получавших лечение от бесплодия. Оценены основные параметры спермы у некурящих и заядлых курильщиков. Уровни GSH, АФК, железа и уровня белка GSH-зависимой GPX4. Исследования проводились в семенной плазме человека и в культуре клеток GC-2Spd, подвергшихся воздействию CSC. Показано, что у заядлых курильщиков были значительно более высокие отклонения (жизнеспособность сперматозоидов и прогрессивная подвижность сперматозоидов), чем у некурящих. По сравнению с некурящими уровень GSH у заядлых курильщиков снижен (p<0,05). А уровень АФК и железа значительно повышен (p<0,05). В культуре клеток GC-2Spd уровень GSH снизился после воздействия CSC в течение 24 часов, в то время как уровни АФК и железа повысились (p<0,05). Эти изменения не происходили при совместном культивировании с Fer-1 (p<0,05). Уровень GPX4 снижался после обработки CSC в течение 24 ч и возвращался к норме после совместного культивирования с Fer-1 (p<0,05). Авторы делают вывод, что курение приводит к высокому уровню ферроптоза в семенной плазме и влияет на качество спермы.
Окислительный стресс является основной причиной многих заболеваний, в том числе мужского бесплодия. Последние данные о соматических клетках связывают окислительный стресс с индукцией нового способа гибели клеток, называемого ферроптозом. Ферроптоз инициируется инактивацией фермента репарации липидов GPX4 и усугубляется активностью арахидонат-15-липоксигеназы (ALOX15), фермента липоксигеназы, который способствует деградации липидов. Авторы следующего исследования показали, что половые клетки самцов мыши проявляют признаки ферроптоза, включая независимое от каспаз снижение жизнеспособности после воздействия условий окислительного стресса, индуцированного электрофильным 4-гидроксиноненалом или активаторами ферроптоза (эрастин и RSL3), а также реципрокную повышающую регуляцию ALOX15 и понижающую регуляцию экспрессии GPX4. Более того, стадия развития круглых сперматид может быть сенсибилизирована к ферроптозу за счет действия длинноцепочечного члена семейства ацил-КоА-синтетазы (ACSL4), который изменяет липидный состав мембран способом, благоприятным для перекисного окисления липидов [30]. Эта работа дает импульс для изучения вклада ферроптоза в гибель клеток зародышевой линии в периоды острого стресса на моделях in vivo.
С положениями процитированной работы согласуется работа [31], целью которой было изучить механизм индуцированной ишемическим стрессом гибели клеток Сертоли. Этот патофизиологический прием имитирует перекрут яичек. Авторы проводили исследование на культуре TM4 клеток Сертоли мыши. Продемонстрировано, что кислородно-глюкозная депривация и реоксигенация вызывают ишемию и гибель клеток в культуре TM4. Гибель клеток удалось предотвратить ингибитором АФК N-ацетилцистеином, а также ингибиторами перекисного окисления липидов липроксстатином 1-го типа и хелатором железа дефероксамином. Ингибиторы апоптоза, некроза или аутофагии не вызывали ожидаемого эффекта. Уровни железа и АФК повысились при ишемии, митохондрии уменьшились в размере и увеличилась плотность их мембраны, что также указывает на ферроптоз. Кроме того, образование АФК предполагает накопление железа и истощение GSH. Экспрессия белка ферропортина (Fpn) и мРНК снижалась в клетках TM4. Примечательно, что сверхэкспрессия Fpn ингибирует ферроптоз, образование АФК и накопление железа. Кроме того, GPX4 инактивирована истощением GSH после ишемии, тогда как активация GPX4 блокировала индуцированный ишемией ферроптоз за счет снижения уровня АФК. Результаты этого исследования показали, что ферроптоз является распространенным типом гибели клеток, вызванной повреждением клеток Сертоли, и обеспечивает новый взгляд на применение цитопротекции при потере клеток, вызванной ишемией яичек.
Группа исследователей из университета Рима [32] показала, что ядерная форма глутатионпероксидазы 4 (nGPx4) имеет своеобразное распределение в головке сперматозоида, локализовавшись в ядерном матриксе и акросоме, и что сперматозоиды, лишенные nGPx4, более склонны к деконденсации in vitro. Недостаток nGPx4 отрицательно влияет на фертильность самцов, вызывая заметное снижение общего числа детенышей и беременностей, значительное сокращение пронуклеусов (PN) эмбрионов в анализах оплодотворения in vitro и задержку оплодотворения яйцеклеток in vivo примерно на 2 ч. Авторы пришли к выводу, что мужские ацетилированные гистоны и акросомный nGPx4 непосредственно участвуют в оплодотворении. Это исследование напрямую не упоминает о ферроптозе сперматозоидов, но снижение активности GPX4 — один из основных его признаков.
Снижению активности GPX4 посвящено и другое исследование [33], показавшее, что дефицит селена, поступающего с пищей, может снизить экспрессию GPx4 и селенопротеина 1-го типа в семенниках, что в дальнейшем влияет на подвижность сперматозоидов и, вероятно, вызывает их деформацию. Аналогичное исследование [34] проведено на мышах с мутацией селеноцистеина активного сайта Gpx4, проявляющейся в нулевой активности GPX4. Морфологически сперма, выделенная из гетерозиготных мышей Gpx4_U46S, имела множество структурных аномалий, особенно в средней части сперматозоидов, из-за неправильного окисления и полимеризации капсульных белков сперматозоидов и аномалий развития митохондриальной капсулы, окружающей и стабилизирующей митохондрии сперматозоидов. Эти результаты напоминают сперму, выделенную у грызунов, лишенных селена, или у мышей, у которых специфически отсутствует митохондриальный Gpx4, и авторы признают негативное влияние ферроптоза на мужскую фертильность.
Заключение
Таким образом, в литературе накопилось достаточно данных, свидетельствующих о негативной роли нового вида регулируемой клеточной смерти в нарушении мужской фертильности, и открываются перспективы лечения этой патологии ингибиторами ферроптоза.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.