Введение

Без сомнения, правильнее считать, что термин «бесплодие неясного генеза» (неуточненное) не предусматривает существования у женщин известных сейчас причин инфертильности и поэтому исключает какие-либо попытки отнести к нему другие состояния, может быть и редко встречающиеся, но ранее принятые в арсенал причин бесплодия. В то же время чрезвычайно быстро развивающаяся генетика, все шире охватывающая различные области медицины, включая и сферу репродукции человека, не позволяет оставаться в этой сфере на прежних позициях и заставляет пересмотреть многие ее положения, в частности, касающиеся бесплодия неясного генеза. Это побудило нас, наряду с ретроспективной клинико-эмбриологической оценкой результатов ВРТ у таких пациенток для уточнения наличия, сущности и характера этого состояния провести молекулярно-генетическое исследование методом секвенирования нового поколения (NGS).

С учетом пока еще неразрешенных вопросов, относящихся к диагностике и лечению бесплодия неясного генеза, и довольно убедительных данных о возможности его генетической природы [1, 2], поводом для настоящего исследования послужили возникшие благодаря научному прогрессу условия для изучения связи особенностей «созревания» ооцитов и развития эмбрионов при неясном происхождении инфертильности с вероятными генетическими факторами, влияющими на характер этих процессов и его определяющими.

Цель исследования — выявить причины недостаточной эффективности лечения бесплодия с помощью ВРТ.

Материал и методы

В период с 01.01.19 по 21.12.20 в клинике ГБУЗ МО МОНИИАГ под нашим наблюдением находились 1003 бесплодные супружеские пары, направленные структурами ОМС Московской области для проведения лечения с применением ВРТ (у некоторых пациентов неоднократно, включая перенос криоконсервированных эмбрионов (ПЭ) в матку матери, а также использование сперматозоидов и/или ооцитов донора). Всего выполнено 1879 программ лечения. Возраст женщин в супружеских парах колебался от 19 до 36 лет и в среднем составлял 31,1±2,2 года. С первичным бесплодием было 568 пациенток, со вторичным — 435. Продолжительность бесплодия у 309 женщин этих пар составляла от 1 года до 5 лет, у 407 — от 5 до 10, у остальных — свыше 10 лет.

Для подтверждения факта наступившей беременности по определению уровня бета-хорионического гонадотропина человека (β-ХГЧ) в сыворотке крови использовали наборы компании «Tosoh Corporation» (Япония), согласно которым показатель менее 0,5 мМЕ/мл соответствует здоровым мужчинам и небеременным женщинам. Клинико-эмбриологическая оценка факта беременности завершалась ультразвуковым исследованием (УЗИ).

Все супружеские пары перед вступлением в программу ВРТ обследованы с помощью общепринятых методов. Женщины (дополнительно по показаниям) обследованы с применением гистероскопии, гистеросальпингографии, а также им проведено УЗИ фолликулярного аппарата яичников в динамике для подтверждения или исключения факта произошедшей овуляции. 426 пациенткам выполнена лапароскопия (включая ее проведение ранее, в анамнезе).

При сочетании причин инфертильности (или их комбинации) у одной и той же пациентки (или у супружеской пары) она отнесена к той или иной форме бесплодия; первостепенным считали преобладание ведущего к инфертильности фактора.

В зависимости от характера и причины инфертильности супружеские пары распределены в две группы.

Первую (I), контрольную, группу составили 945 (94,2%) пар с бесплодием, обусловленным очевидными причинами, установленными в результате обследования в ГБУЗ МО МОНИИАГ или ранее проведенного наблюдения врачом-акушером-гинекологом по месту жительства, а также на основании данных о перенесенных операциях на органах брюшной полости и матке. Это состояния, приводящие к бесплодию: нарушения овуляции [2, 3], эндометриоз [4—6], обусловливающие инфертильность трубно-перитониальные, маточные, цервикальные и мужские факторы [7].

В эту группу не вошли супружеские пары с другими формами женского бесплодия, иногда сопутствующими или вызывающими, пусть даже временно, инфертильность: синдром лютеинизации неовулировавшего фолликула [8, 9], антифосфолипидный синдром [7, 10], совместимость супругов по антигенам HLA-комплекса гистосовместимости [11, 12] и т. п., поскольку на сегодняшний день эти состояния еще не четко определены как не связанные с генетическим компонентом, сдерживающим наступление или прогрессирование беременности и, возможно, способны повлиять на результат проводимой работы.

Конечно, к контрольной группе могут быть отнесены и некоторые пациентки с сочетанием очевидных причин инфертильности и генетическими нарушениями процессов «созревания» фолликулов и эмбриогенеза. Однако, судя по обнаруженным в дальнейшем достаточно высоким результатам применения ВРТ, при весьма большом числе пациенток в этой группе такими довольно редко встречающимися сочетаниями, вероятно, возможно пренебречь.

Предполагая на основании данных литературы и общепринятого мнения специалистов [1—3], что бесплодие может быть обусловлено и генетическими причинами (отсутствием, нарушением строения или функции соответствующих генов), существующими постоянно с рождения ребенка (или еще до этого) или возникающими de novo, уже в период реализации репродуктивной функции, во вторую (II) исследуемую группу мы включили оставшиеся 58 супружеских пар, отобранных в соответствии с представлениями о неясной причине инфертильности и поэтому не входящих в контрольную группу.

Женщины исследуемой группы страдали первичной инфертильностью и отнесены к ней после исключения с помощью лапароскопии даже слабо выраженных органических поражений репродуктивной системы, присущих пациенткам первой группы (нарушений овуляции, спаечного процесса в брюшной полости, эндометриоидных гетеротопий и т. п.), а также пороков развития половых органов и состояний, относящихся, помимо бесплодия неясного генеза, к другим ранее указанным формам инфертильности. Пациенты этой группы первоначально охарактеризованы как имеющие только бесплодие неясного генеза. Продолжительность бесплодия у пациентов этой группы в среднем составила 4,8±2,1 года (от 2 до 14 лет). Ранее все они безуспешно проходили соответствующее лечение, в том числе и с использованием ВРТ.

Всем супружеским парам, наблюдавшимся в ГБУЗ МО МОНИИАГ, проведено лечение с помощью обычных общепринятых в стране ВРТ с индивидуальным подходом к стимуляции суперовуляции и использованием препаратов, зарегистрированных в РФ [13]. Однако пациентам II (исследуемой) группы инсеминацию проводили только путем инъекции сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (ИКСИ), а в сомнительных случаях применяли ультразвуковую систему экспертного класса Alpio 500, «Canon Medical Systems Corporation», Япония. В ходе проводимого лечения в матку переносили эмбрионы на стадии бластоцисты общим числом не более 2 [7].

При проведении молекулярно-генетического исследования контрольную группу составили 50 пациенток из общего числа 945 бесплодных женщин с очевидными причинами инфертильности трубно-перитониального происхождения (окклюзией или отсутствием маточных труб, после операций по поводу гидросальпинкса, эндометриоза, спаечного процесса в малом тазу и т. п.), с вторичным бесплодием, имеющих или имевших детей без генетических нарушений, при явном отсутствии предположения о генетическом вкладе в клиническую картину бесплодия (за исключением незначительной возможности влияния на результаты исследования генетических особенностей полученного для анализа материала, возникших de novo), а в исследуемую группу включены 34 (58,6%) из 58 инфертильных женщин с первичным бесплодием неясного генеза.

В качестве объекта молекулярно-генетического исследования использовали нативную ДНК пациенток, выделенную из лимфоцитов их венозной крови методом фенольной экстракции. Исследование проводили при помощи полупроводникового секвенатора Proton Ion Torrent («Thermo Fisher Scientific», США). Из результатов исследования образцов генетического материала сформировали библиотеки. Информацию о последовательностях нуклеотидов, полученных у пациентов исследуемой группы, сохраняли на «облачном» сервере секвенатора и автоматически сопоставляли с предварительно подготовленными усредненными референтными значениями у пациентов контрольной группы. В работе использована панель «Female Infertility Panel» GTR000592369.1, в которую входят 93 гена, ассоциированные с женским бесплодием.

Для дополнительной проверки полученных результатов исследования проведено секвенирование проб по методике Сенгера (Sanger) [14].

Необходимо подчеркнуть, что данные, полученные в результате настоящего исследования, могут быть лишь обоснованием возможности и необходимости более глубокого изучения влияния генов, регулирующих процессы «созревания» ооцитов и развития эмбрионов. Это заставило оценивать результаты большей части работы сразу после получения ооцитов в программах ВРТ, в процессе культивирования ооцитов и эмбрионов и/или при задержке очередной менструации на 1—3 недели, в период до появления кровяных выделений, обычно обозначающих прерывание беременности, то есть еще при возможности наступления «биохимической» беременности, когда только повышается уровень ХГЧ в крови или моче. Беременность принято считать «клинической» лишь при обнаружении плодного яйца с помощью УЗИ, что становится возможным значительно позже, при сроке беременности 4—5 недель [7].

Результаты

Полученные ретроспективно данные (показатели) о течении клинического и эмбриологического этапов исследования чрезвычайно интересны! При анализе представленных в таблице данных прежде всего обращает на себя внимание значительная разница между почти всеми показателями, зарегистрированными у участников I (контрольной) группы и II (исследуемой) группы, то есть у ранее не беременевших при длительной регулярной половой жизни женщин с установленным диагнозом «бесплодие неясного генеза».

Клинико-эмбриологические показатели пациенток исследуемых групп

Примечание. ПЭ — перенос эмбрионов.

Именно у пациентов II группы выявлены и меньшее число полученных у женщин «зрелых» ооцитов вплоть до сниженной возможности дальнейшей криоконсервации эмбрионов, и более низкая частота их оплодотворения, и относительно невысокая частота ПЭ на пациентку, наступление «клинической» и «биохимической» беременности при более высокой частоте прерывания последней.

После проведенного анализа данных, полученных ретроспективно в результате секвенирования генетического материала, удалось выявить их значимые особенности у 19 (55,9%) из 34 пациенток с бесплодием неясного генеза по сравнению с усредненными референтными значениями пациенток контрольной группы. Эти особенности имели характер точечных мутаций: транзиций (замены азотистых оснований в нуклеотидной паре) или микроделеций (выпадения определенных участков гена размерами 20—30 пар нуклеотидов). У 10 из этих пациенток обнаружены изменения генов группы дефекта созревания ооцитов (OOMD), у 5 — дефекты генов группы преимплантационной летальности бластоцист (PREMBL) и у 4 — выраженные нарушения сосудистых факторов, возможно, принимающих участие в процессе имплантации.

Обсуждение

Само по себе существование «биохимической» беременности, конечно, наблюдается у беременных всегда независимо от того, произошло зачатие естественным путем или в программе ВРТ. Но замеченная пониженная ее частота у пациенток с бесплодием неясного генеза в большой степени может быть обусловлена неполноценностью получаемых из фолликулов ооцитов, возможно, связанной с неадекватной работой ассамблеи генов, кодирующих процессы оогенеза и эмбриогенеза. Это же, по-видимому, касается и зарегистрированной у пациенток II группы очень высокой частоты прерывания «биохимической» беременности, сочетающейся с низким наступлением у них «клинической» беременности.

Такое явление не вызывает удивления, поскольку оно, наверное, нередко связано с переносом в матку дефектной бластоцисты, существенно измененной на предыдущих стадиях развития эмбриона. Крайней степенью ее неполноценности в этом случае является выраженный дефект, исходящий и из внутриклеточной массы бластоцисты, и из ее трофэктодермы (по классификации Гарднера (D.K. Gardner) и соавт. [15] — аббревиатура «СС»).

Можно предположить, что именно от достижения полноценным ооцитом (после его оплодотворения и превращения в эмбрион) стадии лишенной дефектов бластоцисты, способной к нидации в эндометрий (не учитывая качество ПЭ), главным образом и в первую очередь зависит положительный эффект лечения бесплодия путем использования ВРТ.

Несостоявшееся или существенное ограничение достижения эмбрионом этапа ПЭ у пациенток II группы оказалось для них характерным, что позволяет считать его основным и наиболее важным признаком дефектного состояния ооцитов и эмбрионов.

В значительной степени такой вопрос касается и женщин старшего репродуктивного возраста с первичным бесплодием, поскольку именно у них при отрицательном опыте лечения инфертильности наиболее часто наблюдается генетическое нарушение процессов репродукции [16].

К группе генов OOMD относятся PANX I и PATL 2, кодирующие белки, участвующие в снятии блока М-1 [17, 18], TUBB8, кодирующий β-тубулин и формирующий метафазную пластинку при делении клетки [19], и ZP1, кодирующий основной структурный компонент блестящей оболочки ооцита [20].

В группе PREMBL выявлены микроделеции и транзиции в генах TLE6 [21], NLRP2 и NLRP5, кодирующих ферменты и белки-регуляторы, которые участвуют в первых дроблениях эмбриона [22], и в PADI6, ответственном за формирование нервной трубки развивающегося эмбриона [23].

Генетические особенности, выявленные в ходе секвенирования генома у оставшихся 15 пациенток, требуют дальнейшего изучения и интерпретации с целью установления значимости отклонения от референтных значений и возможного вклада в проявления бесплодия.

Для большей демонстративности на рисунке представлены обнаруженные у женщин исследуемой группы (с первичным бесплодием неясного генеза) наиболее яркие проявления генетических отклонений от установленных усредненных референтных значений у женщин контрольной группы (с очевидными причинами инфертильности), основанные на разнице в интенсивности флюоресценции исследуемого материала.

Примеры графического изображения генетических особенностей пациенток исследуемых групп.

Анализ результатов применения ВРТ в исследуемой группе показал, что нарушения репродуктивной функции, наверное, могут происходить как на клеточном, так и на субклеточном уровне в различные критически важные моменты процессов развития и «созревания» ооцитов, их оплодотворения и раннего эмбриогенеза.

Перечисленные выше аномалии могут быть жестко детерминированы, увязаны между собой и проявляться как последовательно, так и раздельно на каждом из обозначенных этапов, представляя собой относительно автономные проблемы и имея более или менее независимые причины. Указанные же процессы, скорее всего, являются мишенями для детального осмысления клеточных и молекулярных механизмов нарушения фертильности с целью дальнейшего совершенствования подходов к разработке рациональной тактики ведения подобных пациентов.

Молекулярно-генетические особенности, лежащие в основе расстройств репродуктивной сферы, в последнее время подвергаются особенно интенсивному изучению. Исследование генетических основ инфертильности и, в частности, бесплодия неясного генеза может помочь раскрыть фундаментальную природу механизмов бесплодия, в то время как известно, что генетические изменения, приводящие к ним, включают аномалии больших хромосом, микроскопические хромосомные делеции и дупликации, а также вариации нуклеотидных последовательностей в ДНК отдельных генов, контролирующих огромное число биологических процессов репродуктивной сферы [24].

Обнаруженные же особенности у пациенток исследуемой группы с выраженными нарушениями на эмбриологическом этапе проявляются, скорее всего, блоками развития эмбрионов, отсутствием оплодотворения и ошибками на этом этапе, а, следовательно, могут иметь существенное влияние на репродуктивный потенциал яйцеклеток.

Показано, что абсолютное большинство нуклеотидных изменений представлено точечными мутациями (транзициями и микроделециями) в генах, относящихся к группе OOMD. Эта группа включает различные гены, как мейоз-специфичные, так и неспецифичные, объединенные в соответствии с патологией, развивающейся при их дефекте. Все такие гены несут различные функции, большинство из них является генами-регуляторами и кофакторами транскрипционных процессов, однако встречаются и напрямую кодирующие структурные элементы, играющие крайне важную роль в «созревании» ооцитов [25].

Основываясь на модельных экспериментах, проведенных на животных, можно заключить, что многие эмбриональные гены вовлечены в события уже на ранних стадиях дробления (4—8 бластомеров) и участвуют в ремоделировании хроматина и регуляции эпигенетического репрограммирования, а также задают вектор будущей специализации клеток. Часть таких генов идентифицирована совсем недавно, благодаря использованию полноэкзомного секвенирования ДНК пациентов с соответствующими фенотипическими проявлениями и подробно задокументированным клиническим данным [26].

В экспериментах на животных также показано, что ген WEE2 экспрессируется только в ооцитах, причем его экспрессия усиливается в процессе фолликулогенеза, достигая максимума к моменту овуляции [27]. Имеются убедительные свидетельства того, что у животных разных групп этот ген вовлечен в обеспечение важнейших процессов, таких как поддержание состояния покоя на стадии GV, завершение метафазы 1 (М1), формирование пронуклеусов. Действие этого гена локализовано в строго определенных компартментах ооцитов, что обеспечивает эффективный контроль цепи процессов мейоза [28, 29].

В клинической практике зафиксированы случаи многократно повторяемых неудачных попыток оплодотворения с применением технологий ЭКО/ИКСИ, в которых не удавалось получить полноценную зиготу. В исследованиях последних лет предпринимались попытки обнаружить нуклеотидные полиморфизмы гена WEE2, ответственного за указанные выше аномалии и у человека. В то же время имеются данные о его гомозиготных мутациях, приводящих к аресту оплодотворения яйцеклеток у женщин с бесплодием. Таким образом, ооциты пациенток с патогенными вариантами этого гена не способны к оплодотворению, так как его дефекты обусловливают неспособность яйцеклетки завершить выход из метафазы второго деления мейоза (М II) и образовать второе полярное тельце (PB2).

И наконец, ген TUBB8 кодирует одну из субъединиц тубулина — β-тубулин, необходимую для сборки веретена деления. В ооцитах пациенток — носителей патологичных вариантов этого гена веретено деления или не собирается вовсе, или организовано аномально и дезорганизовано. В этих случаях обычно отделение полярного тельца не происходит. Однако имеются немногочисленные примеры, когда все же первое полярное тельце отделяется, но эмбрионы при оплодотворении такой яйцеклетки не развиваются дальше стадии 4—8 бластомеров. Это означает, что участие в воплощении репродуктивной функции указанных генов, контролирующих адекватность процессов оогенеза и эмбриогенеза не подлежит сомнению, и от их правильного функционирования во всех случаях зависит результат борьбы с бесплодием и воспроизводства себе подобных.

Вызывает неподдельную настороженность только отсутствие до настоящего времени убедительных результатов генетического обоснования чрезвычайно важного для репродукции момента происходящей овуляции у человека. Решение этого вопроса, по-видимому, не заставит себя долго ждать.

Исходя из приведенных сведений, можно предположить, что функцию репродукции обеспечивает большое число генов, играющих ведущую роль в фундаментальных процессах дифференцировки клеток, внутри- и межклеточных сигнальных взаимодействиях, обладающих тканевой специфичностью, а также определяющих слаженную работу органов и физиологических систем организма. Постоянно же растущее число исследований с применением полноэкзомного и геномного секвенирования позволяет постепенно пополнять цепочку причинно-следственных связей, ведущих к пониманию пока еще неизвестных, но интенсивно изучаемых, основополагающих причин и фундаментальных механизмов возникновения бесплодия неясного генеза и других дисфункций репродуктивной сферы.

Следует заметить, однако, что приведенные данные во многих случаях пока что не позволяют связать существующие важные генетические находки с конкретными процессами, происходящими в репродуктивной сфере, что еще сдерживает возможность их использования в практической работе.

Заключение

Представленные данные свидетельствуют о довольно низкой частоте женского бесплодия неясного генеза в популяции инфертильных супружеских пар (по нашим данным, около 5,8%, при имеющихся в настоящее время диагностических возможностях), но это тем не менее вполне заметно отрицательно влияет на результаты лечения бесплодного брака с помощью вспомогательных репродуктивных технологий.

Более половины таких состояний связано с нарушением генетических механизмов репродукции. В последнем случае низкие возможности клинического и эмбриологического «созревания» ооцитов и развития эмбрионов нередко приводят к несохранению даже «биохимической» беременности и, естественно, «клинической». Это приоткрывает еще одну страницу, объясняющую относительно низкую эффективность вспомогательных репродуктивных технологий и заставляет задуматься об индивидуальном подходе к лечению больных с подобными нарушениями.

При генетически обусловленном несохранении, в данном случае, естественной фертильности, для исключения возможности применения на сегодняшний день малоперспективного и ненадежного общепринятого лечения пока что является более разумным использование в программе вспомогательных репродуктивных технологий лишь ооцитов донора или усыновление/удочерение «чужих», ранее уже родившихся, детей.

Наступление «нормальной» беременности с помощью вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с бесплодием неясного генеза, обусловленного генетической несостоятельностью, хотя и не часто, но все же возможно, особенно в тех случаях, когда характер этих нарушений незначителен. Тем не менее и у таких пациенток иногда потребуются многократные попытки лечения. Дети, родившиеся у этих женщин, все же остаются угрожаемыми по возникновению пороков развития, что делает необходимым привлечение врача-генетика и для помощи в установлении причины инфертильности, и для оценки риска рождения больного ребенка.

PS: Использование в тексте терминов «наверное», «возможно», «может быть» и т. п., конечно, не позволяет что-нибудь утверждать. Но как еще можно обойтись без них в период стремительно происходящего, многообещающего слияния генетики с акушерством, гинекологией и эмбриологией?

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Здановский В.М., Краснопольская К.В., Ляхов А.В.

Сбор и обработка материала — Ляхов А.В.

Написание текста — Здановский В.М., Воскобоева Е.Ю.

Редактирование — Краснопольская К.В., Воскобоева Е.Ю.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.