Введение

Бесплодие определяется как неспособность пары достичь беременности в течение года регулярной половой жизни без применения контрацепции. Частота бесплодия в мире, в том числе в России, среди пар достигает 17%, при этом на долю мужского фактора отдельно или в сочетании с женским фактором приходится до половины всех случаев [1]. Оценка мужской фертильности традиционно опирается на стандартный спермиологический анализ, который сам по себе не обладает достаточной прогностической точностью в отношении наступления как естественной беременности, так беременности, достигнутой с помощью вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Показано, что около 15% мужчин из бесплодных супружеских пар имеют нормальные показатели спермограммы [2]. Основные характеристики спермиологического анализа, такие как концентрация сперматозоидов, их подвижность и морфология, не отражают качество генетического материала сперматозоида, которое оказывает непосредственное влияние на успешность эмбрионального развития.

Однонитевые и двунитевые разрывы в ДНК сперматозоида определяются как фрагментация. Фрагментация ДНК сперматозоидов и ее связь с бесплодием является предметом изучения уже несколько десятилетий, за это время опубликовано более трех тысяч описаний исследований. Однако влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на оплодотворение, эмбриональное развитие и исход беременности остается предметом дискуссий [3].

В шестом издании руководства ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека анализ фрагментации ДНК сперматозоидов включен в раздел «Расширенное исследование» [1]. Вместе с тем в руководстве не указан однозначный метод детекции, а отсутствие определенного порогового значения в литературе приводит к необходимости использования референсных значений, специфичных для конкретной лаборатории. Следует отметить, что указанные для стандартного спермиологического анализа референсные значения позволяют дифференциировать норму или патологию, однако их клиническое значение является спорным, поскольку они не позволяют определить алгоритм лечения мужчины в каждом конкретном случае, что не отвечает современному запросу на персонализированный подход в медицине. Известно, что результаты спермограммы имеют суточную, сезонную, возрастную и даже этногеографическую вариабельность, а существующие референсные значения установлены ВОЗ для широкой мировой популяции. В России нет ни одной лаборатории, в которой установлены референсные значения доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК. В ФГБНУ «НИИ АГИР им. Д.О. Отта» Минобрнауки России анализ фрагментации ДНК сперматозоидов проводится более 10 лет. Накопленные данные позволяют предпринять попытку создания пороговых значений, имеющих клиническую значимость и специфичных для российской популяции мужчин.

Цель исследования — оценить связь между параметрами спермиологического анализа и фрагментацией ДНК сперматозоидов в эякуляте мужчин Северо-Западного региона России для определения референсного значения доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК.

Материал и методы

Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Исследование проведено в отделении ВРТ ФГБНУ «НИИ АГИР им. Д.О. Отта» Минобрнауки России в период с января 2019 г. по ноябрь 2023 г. Протокол исследования одобрен локальным этическими комитетом (выписка из протокола №129 от 30.10.2023). До включения в исследование у всех участников получено письменное информированное добровольное согласие. Проведено ретроспективное исследование результатов спермиологического анализа и анализа фрагментации ДНК сперматозоидов у 1731 мужчины. Пациенты заполнили анкету (n=1084), в которой указывали индекс массы тела (ИМТ), наличие/отсутствие детей, вредных привычек (алкоголь, табакокурение), прием специфических препаратов, а также сведения о перенесенных заболеваниях (COVID-19).

Спермиологический анализ

Спермиологический анализ проведен согласно руководству ВОЗ 2010 г. по оценке и обработке эякулята человека. Измеряли объем эякулята (мл) после разжижения с помощью градуированной пробирки. Оценивали концентрацию (млн/мл) и подвижность (прогрессивно-подвижные (PR), непрогрессивно-подвижные (NP), неподвижные (IM)) путем подсчета сперматозоидов в камере Маклера. Готовили суховоздушные препараты суспензии сперматозоидов на стекле. Стекла окрашивали с помощью набора для окрашивания «ДИАХИМ-ДИФФ-КВИК» (ООО «Научно-производственная фирма «АБРИС+», Россия). Морфологию сперматозоидов оценивали согласно критериям ВОЗ 2010. С использованием светового микроскопа (×400) детально анализировали головку, среднюю часть (шейку) и хвост сперматозоидов, оценивали 200 клеток на препарат.

Определение содержания антиспермальных антител (MAR-test)

В эякуляте пациентов (n=918) определяли присутствие антиспермальных антител (АСАТ) класса IgG (MAR-test, «FertiPro N.V.», Бельгия). Согласно инструкции производителя, 10 мкл эякулята смешивали с 10 мкл сыворотки и 10 мкл латексных шариков для выполнения смешанной антиглобулиновой реакции. Спустя 5 мин оценивали долю сперматозоидов, связавшихся с шариками.

Оценка функциональной зрелости сперматозоидов по способности связываться с гиалуроновой кислотой (HBA-test)

Функциональную зрелость сперматозоидов у пациентов (n=95) оценивали по способности связываться с гиалуроновой кислотой — Hyaluronan binding assay (HBA-test, «ORIGIO A/S», Дания). Согласно инструкции производителя, 10 мкл эякулята наносили на специальное стекло, на которое нанесен гиалуронат, и накрывали покровным стеклом со счетной решеткой. Спустя 10 мин проводили подсчет сперматозоидов, связавшихся с гиалуронатом.

Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов методом TUNEL

Для всех пациентов (n=1731) проведена оценка фрагментации ДНК в сперматозоидах методом флуоресцентного мечения однонитевых и двунитевых разрывов ДНК (Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) assay) с использованием коммерческого набора (Roche, Германия) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя с собственными модификациями по методике, опубликованной ранее [4, 5].

Подготовленные препараты эякулята проводили по 5 мин через две смены буферного раствора 1×PBS pH~7,4 при комнатной температуре. После этого препараты дополнительно фиксировались в 4% растворе параформальдегида на протяжении 10 мин. Затем проводили пермобилизацию головок сперматозоидов, используя раствор, состоящий из 0,1% натрия цитрата и 0,1% Triton X-100, в течение 15 мин на льду. После этого препараты снова обрабатывали в течение 5 мин двумя сменами буферного раствора 1×PBS pH~7,4 при комнатной температуре. На влажные стекла добавляли 4,5 мкл 1xTdT буфера и 0,5 мкл фермента, накрывали покровным стеклом и инкубировали 1 ч при температуре 37°C во влажной камере. Отмывку препаратов проводили в трех сменах буфера 1×PBS pH~7,4 по 5 мин каждая при комнатной температуре, после чего препараты ополаскивали дистиллированной водой. Далее промывали стекла через серию спиртов возрастающей концентрации. Препараты заключали в фотозащитный раствор, содержащий краситель Vectashield с DAPI в концентрации 1 мкг/мл («Vector Laboratories Inc.», США).

Статистические анализ

Статистический анализ выполнен в программе Statistica 12. Проведена однофакторная оценка зависимости показателей доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК от различных факторов. Для оценки зависимости показателей доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК от количественных факторов выполнен последовательный однофакторный регрессионный анализ. Оценка зависимости показателей от категориальных факторов проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Для определения порогового значения разделения доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК выполнен ROC-анализ. Определение оптимального порогового значения проведено на основании индекса Юдена и по принципу равенства чувствительности (Sens — sensitivity) и специфичности (Sp — specificity). В последующем проведено разделение выборки в зависимости от уровня доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК и выполнен сравнительный анализ полученных групп. Количественные переменные представлены как среднее арифметическое и стандартное отклонение (Mean±SD). Различия между двумя группами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента, а в случае неравенства дисперсий по тесту Левена использовали поправку Уэлча. Степень различий отображалась в виде стандартизованного коэффициента d Коэна. Категориальные переменные представлены в виде абсолютных частот и относительных долей. Различия в таблицах сопряженности оценивали с помощью критерия хи-квадрат Пирсона и точного критерия Фишера при минимальных ожидаемых частотах менее 10. Степень различий представлена в виде отношения шансов (OR — odds ratio) с 95% доверительным интервалом (CI — confidence interval). Пороговый уровень статистической значимости принят для p<0,05.

Результаты

Исследование проведено с участием 1731 мужчины, средний возраст составил 36,4±6,5 года (минимальный возраст 21 год, максимальный возраст 69 лет). Среднее по доле сперматозоидов с фрагментированной ДНК составило 14,8±8,9% (минимум 0%, максимум 65,8%) (рис. 1).

Рис. 1. Распределение показателя доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте обследованных мужчин (n=1731).

Проведена однофакторная оценка зависимости показателей доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК от различных факторов. Результаты однофакторной оценки представлены в табл. 1. Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК статистически значимо зависела от возраста мужчины (p<0,001), количества дней воздержания (p<0,001), подвижности сперматозоидов (PR, %) (p<0,001), а также от доли морфологически нормальных сперматозоидов (p=0,002). В то же время объем эякулята, концентрация сперматозоидов, ИМТ, наличие/отсутствие детей, курение и прием алкоголя не оказывали статистически значимого влияния на показатель доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в однофакторном анализе.

Таблица 1. Результаты однофакторного анализа зависимости показателя доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК от количественных и категориальных факторов

Примечание. Значения представлены как среднее и стандартное отклонение (Mean±SD), размах варьирования представлен как минимальное и максимальное значения (min—max); p-value — уровень статистической значимости. ИМТ — индекс массы тела; PR — прогрессивно-подвижные сперматозоиды.

Для оценки референсного значения доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК, связанного с различными отклонениями количественных показателей от нормы, проведен ROC-анализ. Оптимальное пороговое значение выбрано с использованием индекса Юдена, а также по принципу равенства чувствительности и специфичности. Результаты ROC-анализа представлены на рис. 2.

Рис. 2. Результаты ROC-анализа.

В левой части графика представлены значения AUC (area under curve — площадь под кривой) и границы CI (доверительного интервала). Для показателей подвижности сперматозоидов и морфологии p-value составило 0,002 и 0,01 соответственно. Для остальных показателей p-value>0,05; в правой части графика представлены пороговые значения по доле сперматозоидов с фрагментированной ДНК: светлый круг — значение, определенное по индексу Юдена, темный треугольник — по принципу равенства чувствительности (Sens — sensitivity) и специфичности (Sp — specificity). PR — прогрессивно-подвижные сперматозоиды.

Значения доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК не показали предиктивной значимости в отношении объема эякулята, концентрации сперматозоидов, результатов теста на АСАТ (MAR-теста) и теста на связывание с гиалуроновой кислотой (HBA-теста). При этом значение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК можно использовать для оценки вероятности нарушения подвижности (PR <32%) и морфологии (<4%). Для нарушения подвижности сперматозоидов выбрано пороговое значение 14,2%, которое имеет как наибольший индекс Юдена, так и сопоставимые значения чувствительности и специфичности. Для нарушения морфологии выбраны значения 19,7% (по индексу Юдена) и 13% (по принципу равенства чувствительности и специфичности). Усреднение полученных пороговых значений приближено к 15%.

Данный порог 15% обусловлен наиболее выраженной предиктивной значимостью для нарушения подвижности сперматозоидов и морфологии и выбран в качестве точки разделения выборки на две группы. В первую группу вошли 998 (57,7%) человек, у которых доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК была меньше 15% — «TUNEL<15%», вторую группу составили 733 (42,3%) пациента с долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК на уровне 15% и выше — «TUNEL≥15%».

Проведен сравнительный анализ полученных исследуемых групп (табл. 2). Возраст пациентов группы «TUNEL<15%» оказался статистически значимо меньше, чем пациентов группы «TUNEL≥15%» (36±6,2 и 37±6,7 года соответственно; p=0,001). Число дней воздержания, напротив, у пациентов группы «TUNEL<15%» было статистически значимо меньше, чем у пациентов группы «TUNEL≥15%» (3,74±1,73 и 4,12±2,7 дня соответственно; p=0,006). В группе «TUNEL<15%» случаи перенесенной инфекции COVID-19 наблюдались на 26,6% реже, чем в группе «TUNEL≥15%» (49,6% и 55,7% соответственно; p=0,048). Вакцинация, наличие детей и курение в группах сравнения значимо не различались (p=0,671, p=0,162, p=0,802 соответственно). Пациенты группы «TUNEL<15%» употребляли алкоголь на 31,6% реже, чем пациенты группы «TUNEL≥15%» (26,1% и 31,8% соответственно; p=0,038).

Таблица 2. Характеристика групп пациентов в зависимости от доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК

Примечание. Значения представлены как среднее и стандартное отклонение (Mean±SD), p-value — уровень статистической значимости. OR — отношение шансов; CI — доверительный интервал.

Проведен сравнительный анализ количественных показателей (табл. 3). Объем эякулята у пациентов группы «TUNEL<15%» был в среднем статистически значимо меньше, чем у пациентов группы «TUNEL≥15%» (3,39±1,54 мл и 3,55±1,63 мл соответственно; p=0,049). Показатель подвижности сперматозоидов (%, PR) у пациентов группы «TUNEL<15%» был в среднем статистически значимо больше, чем у пациентов группы «TUNEL≥15%» (55,8±16% и 52,9±17,5% соответственно; p<0,001. Доля морфологически нормальных сперматозоидов у пациентов группы «TUNEL<15%» была в среднем статистически значимо больше, чем у пациентов группы «TUNEL≥15%» (4,41±3,44% и 4,07±3,23% соответственно; p=0,037). Концентрация, результаты теста на АСАТ (MAR-теста) и на связывание с гиалуроновой кислотой (HBA-теста), ИМТ оказались сопоставимыми в группах сравнения (p>0,05 во всех случаях).

Таблица 3. Результаты сравнительного анализа количественных показателей в зависимости от доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК

Примечание. Значения представлены как среднее и стандартное отклонение (Mean±SD), p-value — уровень статистической значимости. MAR-тест — доля сперматозоидов с положительной реакцией на содержание антиспермальных антител АСАТ; HBA-тест — доля сперматозоидов, связавшихся с гиалуронатом.

Проведен сравнительный анализ заключений по результатам спермограмм у пациентов исследуемых групп (рис. 3). Нормозооспермия, тератозооспермия (доля морфологически нормальных сперматозоидов <4%), олигозооспермия (концентрация сперматозоидов <15 млн/мл, общее количество сперматозоидов <39 млн/мл), а также такие сочетания видов патологии, как олиготератозооспермия и олигоастенотератозооспермия у лиц групп сравнения, встречаются с сопоставимой частотой (p>0,05 во всех случаях). Астенозооспермия (доля прогрессивно-подвижных сперматозоидов <32%, общая подвижность <40%) в группе «TUNEL<15%» встречалась на 58,7% реже, чем в группе «TUNEL≥15%» (7,1% и 10,9% соответственно; p=0,006). А сочетание астенозооспермии с тератозооспермией встречалось на 69,5% реже (4,4% и 7,2% соответственно; p=0,012). В целом сочетанная патология у пациентов группы «TUNEL<15%» наблюдалась несколько реже, чем у пациентов группы «TUNEL≥15%» (8,3% и 10,8% соответственно). Различия статистически значимы на уровне, близком к пороговому (p=0,082).

Рис. 3. Результаты сравнительного анализа заключений спермограмм у пациентов с долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК <15% и ≥15%.

Значения в правой части графика — OR (отношение шансов) и CI (доверительный интервал). Статистически значимые различия по числу пациентов с астенозооспермией и астенотератозооспермией между группами. В остальных случаях p-value>0,05. HBA — доля сперматозоидов, связавшихся с гиалуронатом.

Обсуждение

Согласно данным литературы, частота мужского бесплодия варьирует от страны к стране, а иногда и от региона к региону одной и той же страны [6, 7]. В настоящее время большое внимание уделяется диагностике идиопатического бесплодия, которое устанавливается в случае нормальных показателей спермиологического анализа у мужчины и адекватной овуляторной функции и проходимости маточных труб у женщины. Идиопатическое бесплодие составляет примерно 15—30% от всех диагностированных случаев. Результаты спермиологического анализа не всегда отражают реальную клиническую ситуацию. Нередко необходимы дополнительные методы исследования фертильности мужчины, такие, например, как оценка фрагментации ДНК сперматозоидов.

Основными механизмами, приводящими к возникновению повреждений ДНК сперматозоидов, являются абортивный апоптоз, дефекты ремоделирования хроматина в спермиогенезе и окислительный стресс [8]. Окислительный стресс, в свою очередь, может быть вызван как эндогенными факторами, так и экзогенными, например образом жизни и условиями окружающей среды, которые оказывают влияние посредством активных форм кислорода (АФК) [9].

Отсутствие универсального метода детекции повреждений ДНК сперматозоидов и общепризнанного порогового значения в клинической практике приводит к необходимости создания референса, адаптированного к локальной популяции и специфике каждой лаборатории.

Согласно данным литературы, одним из факторов, влияющих на мужскую фертильность, является возраст. Исследования подтверждают, что с возрастом у мужчин отмечается снижение уровня тестостерона и концентрации сперматозоидов. Тем не менее некоторые мужчины в старшем репродуктивном возрасте сохраняют фертильность, но для достижения зачатия им может понадобиться больше времени [10]. Показано, что вероятность повреждения ДНК в сперматозоидах у мужчин старше 45 лет повышается статистически значимо [11]. Средний возраст нашей выборки составил 36 лет и сильно варьировал — от 21 года до 69 лет. При этом доля мужчин в возрасте 45 лет и старше составила 10,5%, что немало и соответствует специфике пациентов клиник ВРТ. В нашем исследовании доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК статистически значимо увеличивалась с возрастом. Следовательно, необходимо учитывать фактор мужского возраста при обследовании и планировании беременности в паре.

Согласно рекомендациям ВОЗ, для анализа порции эякулята оптимальный период воздержания составляет от 2 до 7 дней [1]. По данным литературы, более длительное воздержание связано с повышением объема эякулята и увеличением числа сперматозоидов [12]. В ходе сперматогенеза сперматозоиды накапливаются в придатках яичек для хранения до момента эякуляции. Считается, что сперматозоиды в придатке яичка больше подвержены негативному воздействию окислительного стресса, так как еще не смешались со всем секретом желез. Исследования показывают, что спермиоплазма содержит высокие уровни низкомолекулярных антиоксидантов, таких как витамин C, таурин, мочевая кислота и тиоредоксин. В ней также присутствуют специализированные внеклеточные ферменты, включая различные изоформы супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, которые помогают снизить негативное влияние свободных радикалов на сперматозоиды [13]. Следовательно, длительное пребывание в придатке яичка является фактором риска повышения фрагментации ДНК сперматозоидов. Действительно, в нашем исследовании у мужчин с повышенной долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК такие факторы, как объем эякулята и количество дней воздержания, были статистически значимо больше. Согласно данным литературы, одной из стратегий улучшения показателя фрагментации ДНК сперматозоидов может являться сокращение дней воздержания перед сдачей эякулята [14].

Многочисленные исследования демонстрируют влияние образа жизни и факторов окружающей среды на мужскую фертильность. Употребление алкоголя, курение, высококалорийное питание приводят к окислительному стрессу за счет нарушения баланса окислительно-восстановительной системы, что, в свою очередь, обусловливает повышение фрагментации ДНК сперматозоидов [15]. По результатам нашей работы, в группе пациентов с повышенной фрагментацией ДНК сперматозоидов число лиц, отметивших употребление алкоголя, было статистически значимо выше. В то же время курение в исследуемой выборке не влияло на повышение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК. Вероятно, в такого рода исследованиях необходимо учитывать не только факт употребления, но и дозу вещества, а также время последнего употребления перед сдачей материала для анализа.

Показано, что репродуктивная система человека может быть потенциально уязвима для различных вирусов, таких как ВИЧ-1, вирус Зика, вирус гриппа, коронавирус и др. [16]. Так, например, SARs-CoV-2 имеет сильное сродство к ангиотензинпревращающему ферменту 2 (ACE2) на поверхности клеток человека и использует его совместно с трансмембранной сериновой протеазой типа II (TMPRSS2) для проникновения в клетки-мишени. Экспрессия ACE2 и TMPRSS2 обнаруживается в сперматогониях, клетках Лейдига и Сертоли в семенниках человека, а также в других мужских репродуктивных органах, таких как предстательная железа, семенные пузырьки и бульбоуретральные железы, которые обеспечивают сперму семенной жидкостью. Предположительно, SARs-CoV-2 может инфицировать мужские репродуктивные органы и тем самым непосредственно влиять на мужское репродуктивное здоровье [17]. Помимо этого, большинство инфекций вирусной природы нарушают целостность гематотестикулярного барьера, который становится проницаемым как для атакующих сперматозоиды клеток иммунной системы, так и для самого вируса. Известно также, что вирусные инфекции стимулируют воспалительные реакции, что приводит к высвобождению провоспалительных цитокинов, вызывающих окислительный стресс. Согласно данным литературы, нарушение окислительно-восстановительного баланса, вызванное вирусной инфекцией, приводит к повреждению яичек, атрофии семенных канальцев и клеток Сертоли, а также к снижению количества клеток Лейдига. Это сопровождается снижением уровня циркулирующего тестостерона, нарушением сперматогенеза, снижением подвижности сперматозоидов, перекисным окислением липидов, фрагментацией ДНК и апоптозом сперматозоидов [18]. Развитие воспаления и окислительного стресса негативно сказывается на функциональном состоянии сперматозоидов. Исследователи отмечают увеличение фрагментации ДНК у пациентов с COVID-19, особенно в старшем репродуктивном возрасте [19, 20]. Действительно, по данным нашего исследования, у мужчин с повышенной долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте статистически значимо чаще отмечена новая коронавирусная инфекция в анамнезе, которая подтверждена лабораторно. Перенесенная инфекция COVID-19 выступает как обобщенная модель воспалительного процесса, а результаты исследования, вероятно, могут быть справедливыми и для других вирусных заболеваний.

Стандартный спермиологический анализ эякулята считается отправной точкой для оценки фертильности бесплодной пары. Отмечено, что у мужчин с нарушением параметров спермограммы (концентрации, подвижности, морфологии) наблюдается повышенный уровень фрагментации ДНК сперматозоидов [21]. В то же время даже у мужчин с нормальными показателями спермограммы примерно в 11% случаев отмечен повышенный уровень фрагментации ДНК сперматозоидов [22]. Считается, что эффективная оценка морфологии сперматозоидов играет важную роль в определении потенциала фертильности мужчины. В нашем исследовании снижение доли морфологически нормальных сперматозоидов сопровождалось повышением доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК. Вероятно, хромосомные аберрации, присутствие дополнительного генетического материала в головке сперматозоида могут нарушать структурную организацию, что приводит к изменению пропорций головки [23]. Так, изменение регулярной формы головки сперматозоида связывают с нарушением его хромосомных территорий [24]. Отмечено, что увеличение количества сперматозоидов с макроцефалией сопровождается повышением доли ди-, три- и тетраплоидных гамет, а сперматозоиды с микроцефалией нередко вообще не содержали генетического материала [25]. Вероятно, нарушение не только количества, но и качества генетического материала, а именно появление разрывов в ДНК, может влиять на морфологию сперматозоидов.

Следует отметить, что окислительный стресс вызывает не только повреждение ДНК сперматозоидов, но и перекисное окисление липидов их мембраны, что приводит к замедлению движения и может оказывать влияние на процесс оплодотворения. Основная часть жирных кислот (ЖК), составляющих плазматическую мембрану сперматозоида, является полиненасыщенными, что играет важную роль в обеспечении текучести мембраны во время акросомной реакции и слиянии с плазматической мембраной ооцита. Двойные связи полиненасыщенных ЖК являются основной мишенью для атаки свободными радикалами, по ним легче происходит отщепление водорода, что запускает дальнейший каскад перекисного окисления липидов. Повреждение мембраны сперматозоида АФК в районе акросомы может сказываться на акросомной реакции [26, 27]. В нашем исследовании снижение подвижности сперматозоидов статистически значимо связано с повышением доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК. Следует полагать, что нарушение подвижности и фрагментация ДНК сперматозоидов может быть следствием одного процесса, а именно оксислительного стресса. Как потенциальное решение некоторые исследователи предлагают использование антиоксидантов. Однако отсутствие данных об их усвояемости в организме, а также их участии в таком сложном многофакторном процессе, как поддержание окислительно-восстановительного баланса, не позволяет рекомендовать их в качестве универсального средства для восстановления мужской фертильности [9]. Ежегодно публикуется ряд работ об эффекте различных антиоксидантов на фрагментацию ДНК сперматозоидов, однако необходимы дополнительные исследования.

В настоящее время наблюдается возрастающая потребность в тестах, объективно отражающих функциональность сперматозоидов. Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов является научно обоснованным обследованием, признанным ВОЗ [1] и включенным в международное руководство [28]. Очевидно, что для нормального оплодотворения и эмбрионального развития необходим сперматозоид с целостной ДНК [3]. Показано, что у мужчин с бесплодием доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК выше, чем у фертильных мужчин [29]. Помимо этого, высокая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК ассоциирована с более низкой частотой наступления беременности при естественном зачатии, с повышением частоты неудач и замерших беременностей при экстракорпоральном оплодотворении [27, 30]. Однако на данный момент нет единого мнения о том, где провести границу по результатам оценки фрагментации ДНК сперматозоидов между фертильными и бесплодными мужчинами [1]. Важно, что для различных методов детекции фрагментации ДНК сперматозоидов рассматриваются разные пороговые значения. Так, в случае оценки фрагментации ДНК сперматозоидов методом SCSA порог 30% является консенсусным значением. В то же время для метода TUNEL патологический порог неясен и колеблется между 10% и 36% [2]. Остается открытым вопрос, какое референсное значение актуально для популяции мужчин из бесплодных супружеских пар, вступающих в протокол ВРТ.

Заключение

Впервые в России мы предприняли попытку установить пороговые значения по доле сперматозоидов с фрагментированной ДНК, оцененной с помощью метода TUNEL, у пациентов, обратившихся в клинику экстракорпорального оплодотворения ФГБНУ «НИИ АГИР им. Д.О. Отта» Минобрнауки России. Нами предложено референсное значение 15%. Действительно, основные параметры спермиологического анализа, такие как морфология и подвижность сперматозоидов, а также объем эякулята статистически значимо различались у мужчин с долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК выше предложенной нормы. Анализ результатов спермограмм у обследуемых лиц с долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК выше и ниже порогового значения показал, что у пациентов с астенозооспермией и астенотератозооспермией отмечается повышенная фрагментация ДНК сперматозоидов. В целом сочетанная патология у пациентов с фрагментацией ДНК сперматозоидов выше нормальных значений наблюдается несколько чаще, чем у лиц с нормой. Согласно полученным данным, пациентам с астенозооспермией и с астенотератозооспермией по результатам спермограммы, а также пациентам старшего репродуктивного возраста можно рекомендовать в качестве дополнительного исследования оценку уровня фрагментации ДНК сперматозоидов в эякуляте.

В перспективе планируется анализ частоты наступления клинической беременности с учетом полученного порогового значения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Гзгзян А.М.

Сбор и обработка материала — Сагурова Я.М., Лесик Е.А.

Статистическая обработка данных — Ищук М.А

Написание текста — Ищук М.А., Комарова Е.М.

Редактирование — Тапильская Н.И., Комарова Е.М.

Финансирование. Исследование выполнено в рамках поискового научного исследования FGWN-2024-0020 (номер государственной регистрации 1024062500021-3-3.2.2).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.