Мониторинг пролиферативных процессов в эпителии шейки матки в протоколах стимуляции суперовуляции у женщин с цервикальной интраэпителиальной неоплазией

В последние годы тема преодоления бесплодия становится все более актуальной, а методы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) — все более широко распространенными и доступными [1]. Проводятся многочисленные исследования, посвященные как поиску путей повышения эффективности программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), так и безопасности их применения у различных категорий пациентов.

В этой связи представляют интерес работы о возможном влиянии вируса папилломы человека (ВПЧ) как одной из самых распространенных инфекций в мире на эффективность программ ЭКО. При анализе ранее проведенных исследований выяснилось, что часть авторов отрицают влияние инфекции ВПЧ на частоту наступления беременности и спонтанные аборты после проведения ЭКО, тогда как другие работы демонстрируют статистически значимое снижение эффективности программ ЭКО у ВПЧ-инфицированных пациентов [2].

ВПЧ — в настоящее время одна из самых распространенных в мире инфекций. Более 75% сексуально активных женщин инфицируются ВПЧ хотя бы раз в жизни [3]. В мире частота встречаемости ВПЧ высокого онкогенного риска у женщин в возрасте 25—34 лет составляет 10,9%, в возрасте 35—44 лет — 5,7% [4]. Общеизвестна в настоящее время и ключевая роль инфекции ВПЧ в развитии рака шейки матки [4, 5].

Очевидно, что при высокой распространенности ВПЧ в популяции далеко не у всех инфицированных высокоонкогенными типами развивается рак шейки матки. Течение инфекции ВПЧ зависит от состояния иммунной системы и может быть транзиторным, латентным или персистирующим. В 70—80% наблюдений течение инфекции ВПЧ является транзиторным, и в этом случае может наблюдаться спонтанная элиминация ВПЧ. Латентное течение характеризуется отсутствием клинических и морфологических изменений при обнаружении ДНК ВПЧ. К факторам, способствующим персистенции ВПЧ, относятся хронические генитальные инфекции, раннее начало половой жизни, большое число половых партнеров, курение, гормональный фон, иммуносупрессия [3, 6, 7].

В России за период с 2004 по 2014 г. заболеваемость раком шейки матки выросла на 24%, прирост смертности составил за этот период 2%. [8]. В последние годы в России обнаружилась тенденция к росту заболеваемости раком шейки матки у пациенток репродуктивного возраста: за 15 лет у женщин этого возраста заболеваемость раком шейки матки увеличилась более чем в 2 раза. Рак шейки матки занимает второе место (после рака молочной железы) среди причин смерти больных в возрасте 15—40 лет [8, 9].

Гистологический метод считается «золотым стандартом» диагностики патологии шейки матки. Метод традиционно является завершающим этапом комплексного обследования, и именно он позволяет врачу поставить клинический диагноз дисплазии или рака шейки матки [3].

Известно, что около 50% случаев дисплазии легкой степени имеет способность к спонтанной регрессии [10] и далеко не всегда при обнаружении этой патологии требуются неотложные лечебные мероприятия. Более того, в настоящее время при соблюдении ряда условий предпочтительна наблюдательная тактика [11]. Многие исследователи озадачены поиском предикторов прогрессирования цервикальных интраэпителиальных неоплазий от более легких степеней к тяжелым и к раку шейки матки [12—18].

У ВПЧ-инфицированных женщин с цервикальной интраэпителиальной неоплазией легкой степени (CIN1) выбор наблюдательной тактики ведения перед программами ЭКО, которая уменьшает риск невынашивания и преждевременных родов в случае наступления беременности, был бы оправдан в случае отсутствия прогрессирования диспластического процесса при стимуляции суперовуляции (ССО). Результаты ранее опубликованных единичных исследований по изучению влияния ССО на развитие злокачественных пролиферативных процессов репродуктивных органов неоднозначны. Авторы экспериментальных исследований высказывали суждения об эстроген-индуцированном многоступенчатом канцерогенезе влагалища и шейки матки у трансгенных мышей, в основе которого лежит синергическая активация пролиферации за счет нарушения регуляции клеточного цикла вирусных онкопротеинов ВПЧ и передачи сигналов эстрогеновых рецепторов на фоне измененных паракринных стромально-эпителиальных взаимодействий [19]. Однако более поздние клинические исследования свидетельствуют об отсутствии достоверных данных о стимулирующем влиянии гиперэстрогении на злокачественные пролиферативные процессы в эпителии шейки матки. Так, при ретроспективном сравнительном анализе результатов обследования пациенток с раком репродуктивных органов, в том числе шейки матки, которым в анамнезе проведена ССО, авторы не выявили статистически значимого сокращения времени наступления рецидива по сравнению с пациентками, которым не была проведена контролируемая стимуляция овуляции [20].

В этой связи особое значение имеет уточнение безопасности проведения программ ЭКО у пациенток с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями шейки матки. Возникает вопрос: насколько гиперэстрогения, достигаемая при ССО [21—23], способна потенцировать прогрессирование имеющейся у пациентки цервикальной интраэпителиальной неоплазии и требуется ли особый подход к тактике ведения пациенток с CIN1, которые готовятся вступить в программу ЭКО? Имеющиеся к настоящему времени научные данные пока не позволяют ответить на этот вопрос однозначно.

Наиболее перспективным в этом направлении является совместное иммуногистохимическое определение уровня экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki67 и онкобелка р.16 [24].

Цель исследования — изучить пролиферативную активность эпителия шейки матки у пациенток с CIN1 в ответ на ССО препаратами гонадотропинов в программах ЭКО.

В группу для изучения влияния ССО на активность пролиферативных процессов в эпителии шейки матки с CIN1 отобраны пациентки, у которых в результате проведения программы ЭКО беременность не наступила. Это связано с невозможностью проведения повторной биопсии шейки матки у пациенток с наступившей беременностью (как по причине относительных противопоказаний к процедуре биопсии, связанных с наличием беременности, так и с учетом того, что беременность могла оказать влияние на активность пролиферативных процессов эпителия шейки матки и сделать результаты исследования недостоверными).

Проведено проспективное сравнительное продольное исследование 40 женщин, инфицированных ВПЧ, с легкой степенью дисплазии CIN1 по гистологической классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (2014) [25] (основная группа); группу сравнения составили 38 женщин, не инфицированных ВПЧ, без явлений цервикальной дисплазии.

Критерии исключения:

— возраст младше 18 лет и старше 45 лет;

— отказ от подписания информированного добровольного согласия на обследование и лечение;

— наличие противопоказаний к проведению ЭКО [26];

— гистологически подтвержденная CIN2, CIN3;

— применение вакцины против ВПЧ в анамнезе;

— наличие ВИЧ-инфекции.

Группы исследования не различались по возрасту, структуре факторов бесплодия (p>0,05); всем пациенткам проведен «короткий» протокол ССО с применением рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека — фоллитропина альфа (ГОНАЛ-ф) и менотропинов (мерионал) в средней суммарной дозе гонадотропинов 1900,0 (1462,5—2312,5) ЕД.

Забор материала для гистологического исследования производили дважды у каждой пациентки в условиях манипуляционной с помощью электрохирургического высокочастотного аппарата ЭХВЧ-80М-ФОТЕК (ООО «ФОТЕК», Россия) под контролем кольпоскопии. При первичном (перед проведением программы ЭКО) заборе материала проводили прицельную мультифокальную биопсию аномальных участков на поверхности шейки матки (при зоне трансформации I типа — измененных участков экзоцервикса, при зоне трансформации II и III типов — измененных участков экзоцервикса в сочетании с эксцизионной биопсией). Процедура проведена в режиме «резание» с использованием монополярных электродов-петель ЕМ-156 диаметром 5 мм и ЕМ-211 (LEETZ) диаметром 15 мм. При повторном заборе материала (после проведения программы ЭКО) аномальный участок удаляли полностью (преследуя и диагностическую, и лечебную цель). Все срезы окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином. Микропрепараты изучали с помощью светового микроскопа Primo Star (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). На этапе микроскопирования оценку степени дисплазии проводили в соответствии с гистологической классификацией ВОЗ (2014), предложенной R.M. Richart, которая выделяет 3 степени развития дисплазии шейки матки: цервикальную интраэпителиальную неоплазию I, II и III степени (CIN1, CIN2, CIN3). Анализируя биоптаты до и после процедуры ЭКО, отмечали изменения в эпителии слизистой оболочки, собственной пластинки слизистой оболочки.

Иммуногистохимическое исследование индекса пролиферативной активности проведено с использованием мышиных моноклональных антител к Ki-67 (MIB-1) 7ml Leica Bond Ki67 (клон MM1) и очищенных мышиных антител к белку p16INK4a (клон G175-405) (Leica Biosystems Newcastle, Ltd., Великобритания). Для оценки уровня экспрессии маркера пролиферации Ki-67 в динамике (до и после ССО) уровень экспрессии оценивали в баллах: низкий уровень экспрессии (1 балл) соответствовал окрашенным клеткам, расположенным в базальном и парабазальном слоях эпителия; промежуточный (2 балла) характеризовался наличием окрашенных клеток в нижней и средней трети эпителия; при высоком уровне (3 балла) иммунореактивность Ki-67 определяли в клетках, занимающих более ²/₃ эпителия. При оценке уровня экспрессии ингибитора циклинзависимой киназы белка р16INK4a определена ядерная и цитоплазматическая экспрессия данных маркеров в поверхностном, промежуточном, парабазальном и базальном слоях эпителия; при этом выделена экспрессия по распространенности в эпителии (равномерная диффузная, неравномерная диффузная, диффузная экспрессия, представленная единичными клетками, очаговая экспрессия) и по интенсивности окраски (слабая, умеренная и интенсивная экспрессия).

Все исследования осуществляли с учетом этических принципов проведения научных исследований с участием человека, принятых Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (1964) с внесенными поправками на 52-й сессии Генеральной ассамблеи Всемирной медицинской ассоциации в Эдинбурге (Шотландия) в октябре 2000 г. Все пациентки подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании и изучение их биологического материала. Проведение исследования одобрено этическим комитетом ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России, протокол от 09.02.16.

При гистологическом исследовании материала инфицированных ВПЧ пациенток основной группы выяснено, что изменения в многослойном плоском эпителии шейки матки включали: пролиферацию базалоидных клеток, распространяющуюся на ¹/₃ толщины эпителиального пласта, умеренный клеточный полиморфизм, кариопикноз, мультинуклеацию.

При морфологическом исследовании выявлено, что области с дисплазией эпителия имели четкие границы. В биопсийном материале женщин основной группы при микроскопии как до, так и после ССО в парабазальном и промежуточном слоях обнаружены койлоциты, которые свидетельствуют о вирусном поражении эпителия и отражают репродукцию ВПЧ: повреждение ядерных мембран (ядра оттеснены к периферии и имеют гофрированный вид), разрушение цитоскелета (околоядерное просветление цитоплазмы) (рис. 1).

Рис. 1. Гистологический препарат экзоцервикса с CIN1 (LGSIL) пациентки В. (31 год) после процедуры стимуляции суперовуляции.

Окраска гематоксилином и эозином, ×20. В парабазальном и промежуточных слоях явление койлоцитоза — 1. Рис. 1—4: фотографии сделаны авторами.

При гистологическом исследовании у всех пациенток основной группы как до, так и после проведения ССО обнаружено значительное расширение парабазального и промежуточного слоев эпителия, что, вероятно, произошло за счет пролиферации пораженных ВПЧ клеток базального слоя и их быстрого созревания. Пролиферация клеток привела к формированию участков акантоза с формированием пальцевидных выпячиваний в нижележащую рыхлую соединительную ткань собственной пластинки слизистой оболочки. Подобные изменения наблюдались у всех 40 пациенток как до, так и после ССО (рис. 2); в группе сравнения данное явление отмечено лишь у 2 из 38 женщин (p=0,001).

Рис. 2. Гистологический препарат экзоцервикса с CIN1 (LGSIL) пациентки С. (35 лет) до процедуры стимуляции суперовуляции (а) и после процедуры стимуляции суперовуляции (б).

Окраска гематоксилином и эозином, ×4. Пунктирной линией отделены базальный и парабазальный слои цервикального эпителия. Зрелые клетки неповрежденного участка (черная стрелка), незрелые клетки участка с неоплазией (белая стрелка). Погружение эпителия в виде сосочка в собственную пластинку слизистой оболочки — акантоз.

В процессе ССО оценивали динамику воспалительных процессов эпителия шейки матки. Несмотря на то что все пациентки включены в протокол ССО без клинических признаков острого или обострения хронического воспалительного процесса эпителия шейки матки, при морфологическом исследовании в собственной пластинке отмечены признаки воспаления в виде полнокровия сосудов, отека стромы и мононуклеарной инфильтрации у всех пациенток основной группы 40 (100%) и у 12 (31,5%) пациенток группы сравнения (без ВПЧ-инфицирования) (p=0,023).

При иммуногистохимическом исследовании выявлены статистически значимо более высокие уровни экспрессии Ki-67 как до (14; 35%), так и после ССО (12; 30%) у пациенток основной группы (с CIN1) по сравнению с женщинами без дисплазии (2; 5,3%) (группа сравнения) (p=0,001). Согласно данным иммуногистохимического анализа, уровень экспрессии маркера пролиферации Ki-67 до и после проведения ССО у пациенток внутри основной группы статистически значимо не различался, не зафиксировано различий и внутри группы сравнения (см. таблицу, рис. 3).

Экспрессия маркера пролиферации Ki-67 до и после проведения стимуляции суперовуляции у пациенток исследуемых групп

Примечание. ССО — стимуляция суперовуляции; р_{1, 3}=0,001; р_{2, 4}=0,001.

Рис. 3. Иммуногистохимическое исследование препарата влагалищной части шейки матки с CIN1 (LGSIL) пациентки Л. (34 года).

Промежуточный индекс пролиферативной активности Ki-67. ×200.

Средний уровень экспрессии Ki-67 у женщин основной группы составил до ССО 1,65±0,85 балла, после ССО — 1,48±0,74 балла (p>0,05). У пациенток группы сравнения средний балл экспрессии Ki-67 составил 0,63±0,58 до ССО и 0,86±0,57 после ее проведения (p>0,05). Это означает, что ССО не оказала значимого влияния на выраженность экспрессии данного маркера пролиферации.

У 7 (17,5%) из 40 пациенток основной группы (с CIN1) до ССО образцы ткани имели высокий онкогенный потенциал, а именно экспрессию ингибитора циклинзависимой киназы р16INK4a в базальных слоях многослойного плоского эпителия (что, возможно, свидетельствует об интеграции ВПЧ в геном клеток эпителия) в сочетании с высоким уровнем экспрессии маркера пролиферации Ki-67. При этом после протокола ССО данные явления сохранились лишь в одном случае (рис. 4).

Рис. 4. Иммуногистохимическое исследование препарата влагалищной части шейки матки с CIN1 (LGSIL) пациентки Л. (25 лет).

Экспрессия р16INK4a во всех слоях многослойного плоского эпителия до (а) и после (в) стимуляции суперовуляции; экспрессия маркера пролиферации Ki-67 до (б) и после (г) стимуляции суперовуляции в программе экстракорпорального оплодотворения. ×200.

Вероятно, снижение уровня экспрессии маркеров пролиферации в некоторых случаях можно объяснить тем, что при прицельной биопсии до ССО в объем биоптата входили участки эпителия с наиболее грубыми кольпоскопическими изменениями, а соответственно, и с наиболее выраженными изменениями структуры эпителия. У одной пациентки после ССО экспрессия р16INK4a и Ki-67 сохранялась на высоком уровне.

Важно отметить, что появилось 3 случая, в которых активность экспрессии р16INK4a и Ki-67 изменилась с низкой или умеренной до высокой. Этих пациенток, очевидно, следует отнести к группе высокого риска прогрессирования дисплазии.

В целом при изучении динамики экспрессии ингибитора циклинзависимой киназы р.16 (р16INK4a) во всех слоях многослойного плоского эпителия и уровня экспрессии маркера пролиферации Ki-67 до и после проведения ССО в программе ЭКО у пациенток обеих групп исследования статистически значимой разницы не было (p>0,05) (см. таблицу).

По данным морфологического, в том числе иммуногистохимического, анализа эпителия шейки матки в процессе стимуляции суперовуляции у пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией легкой степени — носителей вируса папилломы человека в программе экстракорпорального оплодотворения не определяется прогрессирование диспластического процесса. Это подтверждает безопасность лечения бесплодия у женщин с интраэпителиальными поражениями шейки матки низкой степени методом экстракорпорального оплодотворения.

У женщин с цервикальной интраэпителиальной неоплазией легкой степени рекомендуется проводить оценку экспрессии иммуногистохимических маркеров пролиферации р16INK4a и Ki-67 перед стимуляцией суперовуляции с целью выявления пациенток высокой группы риска прогрессирования дисплазии и лечения дисплазии до программы экстракорпорального оплодотворения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.