Оксидативный гомеостаз в ткани яичника у пациенток с объемными образованиями яичников

Механизмы, лежащие в основе снижения фертильности при эндометриозе, на сегодняшний день изучены недостаточно. В ряде исследований показано, что снижение вероятности имплантации может быть связано с ухудшением качества ооцитов [1]. Кроме того, в ткани яичника, содержащего эндометриоидную кисту, спонтанная овуляция происходит только в ¹/₃ наблюдений [2]. При двусторонних эндометриоидных кистах ответ на стимуляцию овуляции и количество полученных ооцитов значительно ниже, чем в отсутствие эндометриоидных кист у пациенток той же возрастной группы [3].

Известно, что оксидативный стресс вызывает повреждение ткани яичника. В частности, показано, что в клетках гранулезы при эндометриозе отмечаются более высокие концентрации маркеров оксидативного повреждения ДНК по сравнению с клетками яичника пациенток с бесплодием без эндометриоза [4]. Тем не менее степень выраженности влияния оксидативного стресса на интактную кору яичника, содержащего эндометриоидную кисту, остается неизвестной.

Показано, что ткань яичника в непосредственной близости от стенки эндометриомы морфологически отличается от нормальной ткани яичника [5]. Кроме того, плотность фолликулов в коре яичника, содержащего эндометриоидную кисту, значительно ниже, чем в коре яичника, содержащего тератому или цистаденому [6]. Эти факты ставят под сомнение влияние только механического фактора на снижение овариального резерва. Известно, что в содержимом эндометриоидной кисты в высоких концентрациях присутствуют гемовые продукты превращения гемоглобина, способные катализировать реакции образования активных форм кислорода [7]. Кроме того, некоторые активные формы кислорода способны свободно проникать через клеточные мембраны [8]. Соответственно можно предположить, что именно оксидативный стресс является одним из ключевых повреждающих факторов, воздействующих на неизмененную кору яичника, содержащего эндометриоидную кисту, и именно оксидативное повреждение приводит к снижению качества ооцитов и наблюдаемым морфологическим изменениям.

Цель исследования — провести сравнительную оценку уровня оксидативного стресса в неизмененной ткани яичника при различных объемных образованиях яичников.

Исследование проведено на базе ГБУЗ «Центр планирования семьи и репродукции Департамента здравоохранения города Москвы» и Медицинского научно-образовательного центра Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Сформированы две группы пациенток: в основной группе 31 пациентка с эндометриоидными кистами (у 11 пациенток диагностированы двусторонние эндометриоидные кисты, у 20 — односторонние); в группе сравнения 16 пациенток с доброкачественными односторонними образованиями яичников (серозными и муцинозными цистаденомами, зрелыми тератомами). Характер всех образований подтвержден гистологически. Критериями исключения являлись возраст >40 лет, злокачественные новообразования, острые воспалительные и системные заболевания.

Средний возраст пациенток группы с эндометриоидными кистами составил 31,6±3,9 года, группы сравнения — 32,3±4,7 года. Средний диаметр объемных образований яичников у пациенток основной группы составил 4,4±2,0 см, у пациенток группы сравнения — 4,5±1,6 см. При этом интраоперационно обнаружено, что у 7 пациенток основной группы диаметр эндометриом составил <3 см, у 24 пациенток обнаружены эндометриомы диаметром >3 см. Диаметр объемных образований интраоперационно составил <3 см у 5 пациенток группы сравнения и >3 см — у 11 пациенток. Число пациенток с «гигантскими» образованиями яичника (диаметром >8 см) в обеих группах сопоставимо: 3 пациентки основной группы и 2 — группы сравнения. Объемные образования у всех пациенток, включенных в исследование, локализовались в толще ткани яичника.

Акушерский анамнез включенных в исследование пациенток не отягощен. У 21 пациентки основной группы беременностей не было, у 5 диагностировано сопутствующее бесплодие. Беременности в анамнезе отмечены у 10 пациенток основной группы, как минимум 1 роды — у 8. Не было беременностей у 8 пациенток группы сравнения, у 3 выявлено сопутствующее бесплодие. У 8 пациенток с доброкачественными объемными образованиями яичников в анамнезе были беременности, у 6 — самопроизвольные или оперативные роды. Соматический и гинекологический анамнез в двух группах статистически значимо не различался.

Для предварительной оценки овариального резерва проводилось определение уровня антимюллерова гормона (АМГ) в крови. В качестве критерия удовлетворительного овариального резерва принята концентрация АМГ >1 нг/мл. Уровень АМГ сопоставим в обеих группах пациенток и составил 5,27 нг/мл у пациенток с эндометриомами яичников и 6,12 нг/мл у пациенток с неэндометриоидными образованиями. При этом предоперационное снижение овариального резерва отмечено примерно у 25% пациенток. В рамках предоперационного обследования у всех пациенток с объемными образованиями яичников определяли уровень онкомаркеров CA 125 и CA 19-9. У всех пациенток с доброкачественными неэндометриоидными образованиями яичников уровни онкомаркеров находились в пределах референсных значений (до 35 и 27 Ед/мл соответственно). У 9 пациенток с эндометриоидными кистами отмечено увеличение уровней CA 125 и CA 19-9 (максимальные значения составили 110 и 87 Ед/мл соответственно).

Все оперативные вмешательства выполнены лапароскопическим доступом на фоне пневмоперитонеума углекислым газом с давлением 15 мм рт.ст. Проводили энуклеацию образования яичника с максимальным сохранением интактной яичниковой ткани. Гемостаз выполняли при помощи биполярной коагуляции. При обнаружении поверхностных очагов эндометриоза проводили их электрокоагуляцию. Инфильтративные очаги эндометриоза иссекали. При наличии спаечного процесса одномоментно производили адгезиолизис.

После получения информированного согласия всем пациенткам выполнена биопсия ткани яичника в объеме, достаточном для формирования образца массой 15±3 мкг. Производился забор ткани, непосредственно прилежащей к объемному образованию. В основной группе исследовано 42 образца ткани яичника, в контрольной — 16. Хранение и транспортировка исследуемых образцов осуществлялись с помощью контейнеров с охлажденным раствором Кребса—Рингера. Исследование выполняли не позднее 3 ч от момента получения образца с применением хемилюминометра SmartLum-1200 («ДИСофт», Россия).

Для регистрации хемилюминесценции ткани яичника образец помещали в кювету хемилюминометра, в которую предварительно вносили 1880 мкл раствора Кребса—Рингера и 120 мкл раствора люцигенина в конечной концентрации 1 ммоль/л. В ходе эксперимента в кювете поддерживалась температура 37,0 °C. В качестве селективного хемилюминесцентного зонда на супероксидный анионрадикал применяли люцигенин (динитрат-10,10-диметил-9,9-биакридиния; «Sigma-Aldrich», США), в качестве источника восстановленных эквивалентов окислительных цепей — пиридиннуклеотид НАДН («Sigma-Aldrich», США). Фоновую хемилюминесценцию регистрировали в течение 10—15 мин, после чего добавляли стимул НАДН и регистрировали свечение в течение 20—25 мин. Из хемилюминограмм определяли интенсивность фоновой (I_a) и НАДН-стимулированной хемилюминесценции (I_НАДН) и рассчитывали коэффициент активации (КА), равный I_НАДН: I_а. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы MedCalc 11 («MedCalc Software», Бельгия) с использованием методов непараметрического анализа. Все данные представлены в виде медианы (межквартильного размаха). Для сравнения различий между исследуемыми группами использовали критерий Манна—Уитни. Для изучения связи двух непараметрических переменных рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена. В качестве критерия статистической значимости выбрано значение p<0,05.

При первичном анализе полученных данных выявлено, что уровни фоновой люцигенин-активированной хемилюминесценции ткани яичников пациенток основной группы (эндометриоидные кисты) и группы сравнения (доброкачественные неэндометриоидные образования яичника) статистически значимо не различались и составляли 0,14 (0,05—0,35) и 0,18 (0,08—0,38) соответственно.

При добавлении к образцу ткани раствора НАДН отмечена значительно более интенсивная хемилюминесценция в образцах ткани яичника с доброкачественными объемными образованиями по сравнению с образцами ткани яичника, содержащего эндометриому (рис. 1). I_НАДН составила 1,856 (1,121—2,975) в образцах пациенток основной группы и 3,8505 (1,54—8,031) в образцах пациенток группы сравнения (p=0,033).

Рис. 1. НАДН-стимулированная хемилюминесценция яичниковой ткани при эндометриоидных и неэндометриоидных образованиях яичника.

На втором этапе сравнивали НАДН-стимулированную хемилюминесценцию между подгруппами пациенток с яичниковыми образованиями различного диаметра. При сравнении яичников с эндометриомами диаметром <3 и >3 см установлены статистически значимые различия КА, рассчитанного как отношение интенсивности I_НАДН к интенсивности фоновой хемилюминесценции (I₀). При эндометриомах меньшего диаметра (<3 см) увеличение интенсивности хемилюминесценции было более выраженным, чем при эндометриомах большего диаметра. КА составил 22,99 (17,45—39,09) и 8,08 (3,10—31,07) соответственно (p=0,04).

Для доброкачественных неэндометриоидных образований различного диаметра статистически значимых различий ни в интенсивности НАДН-стимулированной хемилюминесценции, ни в КА не было. I_НАДН составила 3,25 (1,46—6,62) по сравнению с 4,45 (1,54—8,23), КА — 23,41 (7,22—71,13) по сравнению с 19,25 (8,26—56,18) при образованиях диаметром <3 и >3 см соответственно.

При сравнении интенсивности НАДН-стимулированной хемилюминесценции в ткани яичников, содержащих эндометриомы диаметром >3 см и неэндометриоидные образования диаметром >3 см, показана менее интенсивная хемилюминесценция при эндометриомах: 1,79 (1,09—2,55) и 4,45 (1,54—8,23) соответственно (p=0,04).

Более того, менее интенсивная НАДН-стимулированная хемилюминесценция зарегистрирована также при эндометриомах размером <3 см по сравнению с крупными неэндометриоидными образованиями (>3 см): 1,52 (1,25—1,93) и 4,45 (1,54—8,23) соответственно (p=0,05). Выявлена средняя прямая корреляция (коэффициент корреляции Спирмена 0,59, p=0,03) между I_НАДН для яичниковой ткани и концентрацией АМГ (рис. 2).

Рис. 2. Корреляция НАДН-стимулированной хемилюминесценции и уровня антимюллерова гормона.

НАДН-стимулированная хемилюминесценция обусловлена работой НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы микросомальной дыхательной цепи митохондрий [9]. Цитохром b5-редуктаза в том числе участвует в регуляции внутриклеточного оксидативного гомеостаза [10], соответственно интенсивность НАДН-стимулированной хемилюминесценции можно считать косвенным показателем сохранности антиоксидантной системы клетки. В то же время снижение I_НАДН указывает на нарушение оксидативного гомеостаза, накопление продуктов оксидативного стресса и запуск цитохром-C-опосредованной гибели митохондрий [11].

Менее выраженный хемилюминесцентный ответ на НАДН-стимуляцию ткани яичника с эндометриомой по сравнению с яичниками с неэндометриоидными доброкачественными образованиями указывает на угнетение активности НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы и наличие оксидативного стресса.

В содержимом эндометриоидной кисты присутствуют различные факторы, опосредующие повреждение, в концентрациях, значительно больших, чем в других жидкостных доброкачественных образованиях. В частности, это протеолитические ферменты, молекулы воспаления и соединения, связанные с железом. Именно содержимое эндометриоидной кисты можно считать основным источником активных форм кислорода в микроокружении яичниковой ткани [12].

8-гидроксидезоксигуанозин является высокочувствительным индикатором повреждения ДНК в результате оксидативного стресса. В работе S. Matsuzaki и B. Schubert при иммуногистохимическом окрашивании на 8-гидроксидезоксигуанозин относительная площадь окрашивания поверхности ядра в образцах коркового слоя яичника была значительно выше при эндометриоидных кистах по сравнению с тератомами и серозными цистаденомами [13]. Концентрация 8-гидроксидезоксигуанозина была значительно выше также в эпителиальных и неэпителиальных клетках стенки эндометриомы по сравнению с тератомой и серозной цистаденомой, что указывает на более выраженное оксидативное повреждение. В содержимом эндометриомы также обнаружены специфические маркеры оксидативного повреждения [12]. Показано, что при эндометриомах яичника уровень АМГ в среднем ниже, чем при неэндометриоидных жидкостных яичниковых образованиях и в отсутствие образований яичников [5]. Отмечено снижение плотности фолликулов и значительное снижение частоты спонтанной овуляции на фоне эндометриоидных кист [3]. Наблюдаемые эффекты указывают на повреждение яичниковой ткани эндометриоидной кистой. Обнаружение маркеров оксидативного стресса непосредственно в эндометриоме, фолликулярной жидкости и клетках гранулезы у пациенток с эндометриозом [4, 14] подтверждает негативное влияние эндометриоидной кисты на ткань яичника [15—17].

В ходе данной работы отмечено, что при эндометриомах бо́льшего диаметра как хемилюминесцентный ответ ткани яичника, так и уровень АМГ снижаются сильнее, чем при эндометриомах меньшего диаметра. Кроме того, у ряда пациенток с эндометриомами наблюдалось снижение КА при условно нормальных концентрациях АМГ. Это может объясняться тем, что нарушение антиоксидантного гомеостаза, оксидативное повреждение и сопутствующие патофизиологические механизмы запускаются в ткани яичника с эндометриоидной кистой до появления первых клинико-лабораторных признаков снижения овариального резерва. Это отмечено, в частности, в работе Е.С. Филипповой [18]. В работе В.А. Стрыгиной показано, что существует обратная корреляция уровня АМГ как показателя овариального резерва и диаметра эндометриомы на дооперационном этапе: при эндометриомах <4,5 см концентрация АМГ в 1,4 раза превышала таковую при эндометриомах диаметром >4,5 см [19].

Зависимости хемилюминесцентного ответа от диаметра кисты для неэндометриоидных доброкачественных образований не было. В то же время хемилюминесцентный ответ ткани яичника даже при доброкачественных новообразованиях большого диаметра оказался значительно более интенсивным, чем при эндометриомах небольших размеров. Поэтому роль механического фактора (более выраженное растяжение яичниковой ткани образованием большего объема) в морфофункциональных изменениях в яичнике, содержащем эндометриому, представляется существенно менее важной, чем роль оксидативного повреждения. С ростом эндометриоидной кисты увеличиваются количество ее содержимого и площадь ее внутренней поверхности, через которую активные формы кислорода диффундируют из эндометриоидного содержимого в окружающие ткани. Диффузия активных форм кислорода может дополнительно облегчаться отсутствием у эндометриоидной кисты истинной капсулы. Повреждающий эффект более выражен в отдельных фолликулах, непосредственно прилегающих к эндометриоме, и менее выражен в более отдаленных от нее фолликулах [20]. В исследовании A. Takashima и соавт. при стимуляции овуляции в цикле экстракорпорального оплодотворения среднее количество антральных фолликулов, ооцитов и полученных эмбрионов было значительно ниже для яичника, содержащего эндометриому, чем для контралатерального интактного яичника [21]. Все это также указывает на важность токсического действия содержимого эндометриомы в патофизиологии повреждения яичниковой ткани.

В нескольких публикациях сообщалось, что антиоксидантные препараты снижают концентрацию маркеров оксидативного стресса и выраженность альгодисменореи при эндометриозе [22, 23], что можно считать косвенным подтверждением важной роли оксидативного стресса в патогенезе эндометриоза.

При эндометриоидных кистах отмечается выраженное нарушение оксидативного гомеостаза с признаками оксидативного повреждения в условно интактной ткани яичника, в котором локализуется объемное образование. Степень оксидативного повреждения ткани яичника имеет тенденцию к увеличению по мере роста эндометриоидной кисты. В ходе дальнейших исследований необходимо более подробно изучить соотношение выраженности оксидативного повреждения ткани яичника, содержащего эндометриоидную кисту, и различных показателей сохранности овариального резерва. Полученные данные позволят по-новому взглянуть на вопрос выбора тактики лечения пациенток с эндометриомами яичников как при нарушении фертильности, так и без такового.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Бугеренко К.А., Щербакова Л.Н., Проскурнина Е.В.

Сбор и обработка материала — Проскурнина Е.В., Нечаева С.Д., Бугеренко А.Е., Фотина Е.В.

Статистический анализ данных — Бугеренко К.А., Новицкая Н.А.

Написание текста — Бугеренко К.А., Бугеренко А.Е.

Редактирование — Панина О.Б., Щербакова Л.Н.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант №18-015-00234.

Благодарность. Авторы выражают благодарность заведующим и сотрудникам гинекологических отделений ГБЗУ «Центр планирования семьи и репродукции Департамента здравоохранения города Москвы» и Медицинского научно-образовательного центра Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Информация о соблюдении этических норм:

Исследование выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом МГУ им. М.В. Ломоносова. У всех пациенток получено информированное согласие.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.