Морфологическая оценка ооцитов человека в клинической практике экстракорпорального оплодотворения (обзор литературы)

Эффективность программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) во многом зависит от проводимой стимуляции функции яичников, которая является ключевым этапом, во многом определяющим успех лечения бесплодия. Правильный выбор препаратов для стимуляции яичников в программах ЭКО является актуальной задачей современной репродуктивной медицины. На сегодняшний день в мире существуют протоколы лечения с различными дозами гонадотропинов, применяемые для улучшения ответа яичников и повышения частоты наступления беременности у пациенток различных групп [1, 2]. В соответствии с доминирующей в настоящее время «концепцией индивидуализации» программ ЭКО проведение контролируемой стимуляции яичников (КСЯ) подразумевает выбор такого протокола, типа гонадотропина и дозы, которые обеспечат максимальную эффективность и безопасность лечения [3, 4]. Оптимальным ответом яичников на стимуляцию является такой, который подразумевает получение 8—10 ооцитов. Это количество сопряжено с хорошим качеством ооцитов и эмбрионов, с отсутствием такого опасного осложнения, как синдром гиперстимуляции яичников [5, 6]. Также на сегодняшний день является важным вопрос о качестве ооцитов и эмбрионов, получаемых в результате стимуляции функции яичников. Исследование факторов, влияющих на качество ооцитов и эмбрионов, и, следовательно, на исход программ ВРТ у пациенток, может повысить уровень успешности лечения бесплодия.

Цель настоящего обзора — проанализировать результаты имеющихся публикаций, посвященных прогностической ценности морфологических особенностей ооцитов в метафазе (МII) человека. Оценка ооцитов, полученных в ходе проведения IVM (in vitro maturation), и/или криоконсервированных ооцитов в данном обзоре не проводилась вследствие различных методов, используемых для этих процессов.

Основная роль изучения качества полученных ооцитов принадлежит морфологической оценке, являющейся ключевым элементом лабораторной работы, проводимой в каждой лаборатории вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), с использованием инвертированного микроскопа по международно-признанным критериям оценки гамет и эмбрионов. Однако некоторые из используемых параметров представляют сомнительную ценность при проведении качественной оценки гамет и эмбрионов [7]. Внедрение time-lapse технологий для анализа развития эмбрионов может дать более детальную информацию о цитоморфологических особенностях эмбриона и позволит получить более точную прогностическую оценку [8, 9], но данная технология из-за высокой стоимости оборудования все еще не распространена в клинической практике. В повседневной работе каждой лаборатории ВРТ, в особенности в случае проведения ИКСИ, качественная оценка ооцитов оказывается довольно поверхностной и часто ограничивается лишь регистрацией наличия грубых нарушений морфологии, что дает недостаточную информацию о стадии зрелости ооцита, а также о наличии дегенеративных признаков в цитоплазме. Впоследствии все ооциты, достигшие стадии MII, подвергаются оплодотворению, и с этого момента потенциал развития полученного эмбриона оценивается исключительно на основе морфологии собственно эмбриона, независимо от качества ооцита, из которого он был получен.

Традиционно в лаборатории ВРТ большое внимание уделяется цитоморфологической оценке сперматозоидов и эмбрионов. Следует признать, что морфологическая оценка ооцитов осуществляется условно, так как нет общепринятых понятных критериев для проведения оценки ооцитов. Несмотря на то что именно качество ооцитов является ключевым ограничивающим фактором в женской фертильности, который играет решающую роль в оплодотворении и развитии [10, 11].

Применение стимуляции яичников при лечении методами ВРТ еще больше усложняет ситуацию. В отличие от процесса в живом организме, где созревание ооцитов — результат длительного и многофакторного процесса отбора доминирующего фолликула [12], стимуляция яичников подавляет этот процесс и позволяет получить зрелые ооциты и из фолликулов, которые в естественном цикле были бы «обречены на провал» [13]. Качество ооцитов определяется не только ядерным и митохондриальным геномами, а также микроокружением, обеспечиваемым яичником и преовуляторным фолликулом, которые могут менять транскрипции и трансляции и, как следствие, цитоплазматическую зрелость ооцита [11]. Из-за сложной картины весьма маловероятно, что единственный фактор или механизм может адекватно показать компетентность развития ооцитов [7].

Ооциты, полученные в ходе проведения овариальной стимуляции, демонстрируют один или несколько морфологических критериев, описанных как идеальные [14—20]. Несколько других морфологически обнаруживаемых особенностей ооцитов на стадии MII указывают на высокий риск нарушений дальнейшего развития. Согласно данным рабочей группы по оценке эмбрионов, проходившей в Стамбуле [21], экстрацитоплазматические аномалии (морфология полярных телец, размер перивителлинового пространства, аномалии zona pellucida) являются фенотипическими вариациями, часто связанными с in vitro культивированием и/или возрастом ооцитов. С другой стороны, специфические отклонения в цитоплазматической структуре (интрацитоплазматические аномалии), такие как, например, агрегация эндоплазматического ретикулума (SER), характеризуют ооциты как некачественные, имеющие высокий риск последующих нарушений развития [22].

Морфология ооцитов также может отражать серьезные генетические аномалии: так, гигантские ооциты могут содержать дополнительный набор хромосом [7].

Наличие первого полярного тельца считается основным маркером зрелости ооцита. Однако в некоторых исследованиях с использованием поляризационной микроскопии было показано, что ооциты, имеющие полярное тельце, все еще оставались незрелыми [7, 23]. Дополнительная информация о стадии зрелости ядра ооцита может быть получена при использовании поляризационной микроскопии в сочетании с программным обеспечением для обработки изображений. Использование этого метода позволяет регистрировать состояние веретена MII у ооцитов с первым полярным тельцем. Так, было показано, что у 80% ооцитов, полученных спустя более 38 ч после введения хорионического гонадотропина человека (чХГ), обнаруживается веретено MII, т. е. наблюдается полная зрелость ооцита [24]. Кроме того, ооциты с хорошо различимым веретеном МII после оплодотворения развиваются в эмбрионы нормальной морфологии в достоверно большем числе случаев [25]. Следует отметить, что факторы внешней среды, такие как неоптимальные условия культивирования или колебания температуры во время манипуляций, могут приводить к разрушению веретена деления [24].

Ооциты с аномалией формы достаточно часто обнаруживаются в когорте ооцитов, полученных с помощью овариальной стимуляции. Однако, как было показано, такая морфология ооцитов не коррелирует ни с частотой оплодотворения, ни с качеством эмбрионов [26]. Только ооциты, имеющие выраженный дисморфизм, снижают имплантационный потенциал эмбриона [18].

Также современные методы поляризационной микроскопии позволяют количественно оценить толщину и структуру наружного, среднего и внутреннего слоев оболочки ооцита. Так, известно, что истонченная zona pellucida является следствием недостаточного уровня экспрессии белков зоны и может служить признаком снижения уровня жизнеспособности ооцита и его потенции к нормальному развитию [27].

Из экстрацитоплазматических аномалий ооцита также желательно учитывать состояние перивителлинового пространства. Некоторые авторы отмечают, что его увеличение, а также наличие грануляции в перивителлиновом пространстве соответствуют перезревшим ооцитам и отрицательно коррелируют с частотой оплодотворения и качеством эмбрионов [15, 20].

Описано несколько морфологических изменений цитоплазматической структуры ооцита, которые снижают вероятность нормального развития и имплантационный потенциал эмбриона: вязкость цитоплазмы и резистентность клеточной мембраны во время ИКСИ; наличие вакуолей и цитоплазматических включений; наличие кластеров шероховатого эндоплазматического ретикулума (ШЭР); рефракционные (преломляющие) тельца/липофильные тельца; избыточная грануляция ооцитов [29—32].

Вязкость и резистентность цитоплазмы коррелируют с несколькими клиническими параметрами — это частота оплодотворения, качество эмбрионов, частота формирования бластоцисты [11, 29].

Вакуоли часто наблюдаются в ооцитах, их размер, количество могут варьировать в течение всего преимплантационного периода развития эмбриона. Кроме того, вакуоли могут появляться в результате проведения ИКСИ при внесении в цитоплазму ооцита избыточного объема поливинилпирролидона или культуральной среды. Наличие небольших вакуолей в ооците (5—10 мкм в диаметре) не влияет на частоту оплодотворения и качество эмбрионов [7, 30, 31]. Однако, по данным ряда авторов [7, 32, 33], наличие нескольких вакуолей или одной вакуоли размером более 14 мкм в диаметре является негативным прогностическим признаком, так как частота оплодотворения таких ооцитов существенно снижается. Кроме того, по данным J. Otsuki и соавт. [32], при наличии в ооците вакуолей увеличивалась частота биохимической беременности с последующим снижением частоты клинической беременности.

Одной из наиболее значимых цитоплазматических аномалий зрелых ооцитов является агрегация ШЭР в цитоплазме. Кластеры ШЭР идентифицируются как полупрозрачные вакуолеподобные структуры в цитоплазме ооцита. Агрегация ШЭР происходит в результате процесса старения ооцита и ассоциируется с риском серьезных неонатальных последствий [18, 19]. Согласно рекомендациям рабочей группы по оценке эмбрионов, проходившей в Стамбуле в 2011 г. [21], ооциты, имеющие выраженную агрегацию ШЭР, не должны оплодотворяться из-за высокого риска осложнений беременности. Ооциты, в цитоплазме которых наблюдалась агрегация ШЭР, в последующем имели низкую частоту имплантации [33]. Этой же группой исследователей ранее было показано, что при высоких концентрациях эстрадиола в крови пациентки в день введения триггера овуляции (чХГ) наблюдаются ооциты с агрегацией ШЭР. Кроме того, концентрация эстрадиола на аспированный ооцит в день введения чХГ была выше в тех случаях, где в ооцитах наблюдалась агрегация ШЭР [34].

Рефракционные (преломляющие) тельца/липофильные тельца также являются морфологической аномалией, достаточно часто встречаются в цитоплазме ооцита. Ооциты с большими рефракционными тельцами (более 5 мкм в диаметре) имеют значительно низкую частоту оплодотворения [33].

Степень грануляции цитоплазмы также является важным прогностическим критерием при оценке качества ооцита. Так, по данным, опубликованным группой эмбриологов Европейской ассоциации репродукции и эмбриологии человека (ESHRE) [21], слегка гетерогенная цитоплазма полученных ооцитов представляет нормальную вариабельность. Ооциты с гетерогенной гранулярной цитоплазмой имеют лучшие показатели развития по сравнению с ооцитами, у которых грануляция в цитоплазме отсутствует. При оценке качества ооцитов важно отличать морфологические различия гранулированной цитоплазмы (равномерно распределенная грануляция или центрально локализованная) [21, 30]. В научной литературе [16, 20, 30, 31] встречаются различные термины, описывающие грануляцию цитоплазмы: «темная цитоплазма», «темная цитоплазма-гранулированная цитоплазма», «темная цитоплазма с проявлениями грануляции, «диффузная цитоплазматическая грануляция». Различная терминология может быть причиной дискуссий о влиянии данной аномалии на развитие эмбрионов [11]. С темной цитоплазмой некоторые авторы [14, 16, 18, 35] связывают низкое качество эмбрионов. Диффузная периферическая грануляция ассоциируется с неравномерным формированием пронуклеусов. Однако любой тип грануляции цитоплазмы ооцитов коррелирует с высокой частотой оплодотворения по сравнению с ооцитами, у которых грануляция цитоплазмы полностью отсутствует [20]. В отличие от агрегации ШЭР, центрально локализованную агрегацию цитоплазмы ооцита связывают с незрелостью цитоплазмы ооцита [32, 36]. С данным видом аномалии связывают низкую частоту имплантации, высокую частоту прерывания беременности и высокую частоту анеуплоидии [32].

Традиционно КСЯ в программе ЭКО всегда приходилась на начало фолликулярной фазы менструального цикла. В настоящее время появляется все больше доказательств в пользу теории непрерывного (волнообразного) фолликулогенеза [37, 38]. Одним из них является стимуляция функции яичников в лютеиновую фазу менструального цикла [39—43].

Первоначально стимуляция функции яичников в лютеиновую фазу была предложена для получения зрелых яйцеклеток и эмбрионов с последующей их криоконсервацией при экстренном сохранении генетического материала у пациенток с онкологическими заболеваниями [39, 42].

В недавних исследованиях авторами [40, 43] было показано, что инициация стимуляции яичников как в поздней фолликулярной, так и лютеиновой фазах так же эффективна для сохранения фертильности, как и обычная стимуляция со стандартным стартом. Число полученных ооцитов, степень их зрелости и частота оплодотворения были идентичными во всех трех группах. Основным преимуществом «двойной стимуляции» является получение большего количества ооцитов и жизнеспособных эмбрионов, благодаря стимуляции яичников в один менструальный цикл, что крайне актуально в лечении пациенток со сниженными показателями овариального резерва.

Результаты исследований, проведенных у онкологических пациенток для сохранения генетического материала, свидетельствуют об удовлетворительном количестве и качестве получаемых ооцитов/эмбрионов [40, 42]; появились данные о высокой клинической эффективности программ ЭКО со стимуляцией, проведенной в лютеиновой фазе менструального цикла [43].

Так как отбор ооцитов перед оплодотворением может иметь важные преимущества в определенных ситуациях, необходимо в полной мере использовать интеллектуальный потенциал морфологической оценки. Из-за сложности механизмов, связанных с созреванием ооцитов, маловероятно, что один параметр (за исключением размера ооцита) может адекватно отображать качество ооцита. Чтобы получить информацию о потенциале ооцита, необходимо сочетать морфологическую оценку ооцита с другими методами исследования (электронная микроскопия, конфокальная микроскопия, time-lapse микроскопия, исследование на анеуплоидии и др.). Дальнейшее прогностическое значение может быть получено путем комбинированной морфологической оценки ооцитов, зигот и эмбрионов.

В связи с вышеперечисленным представляется актуальным, современным и перспективным исследование по изучению качества ооцитов и эмбрионов, получаемых при стимуляции яичников в различные фазы менструального цикла.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Кодылева Татьяна Александровна — эмбриолог 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Медицинский исследовательский научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: Москва, улица Академика Опарина, дом 4, 117997; телефон:8(925)373-8314, e-mail: t_kodyleva@oparina4.ru

Шафеи Рамин Ахмедович — к.б.н., вед.н.с. каф. эмбриологии биологического факультета ФГБОУВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Ленинские горы 1, строение 12, 119991; телефон: 8 (916)832-9162, e-mail: shafei@list.ru

Лапина Вера Сергеевна —врач-акушер-гинеколог 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Медицинский исследовательский научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: Москва улица Академика Опарина, дом 4, 117997; телефон: 8(909)920-2305, e-mail: vslapina89@gmail.com

Мишиева Нона Годовна — д.м.н., вед.с. 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Медицинский исследовательский научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» МинздраваРоссии; Москва, улицаАкадемикаОпарина, дом 4, 117997; телефон:8 (495) 438-2622, e-mail: nondoc555@mail.ru

Королькова Анна Игоревна— асп. 2 года обучения 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Медицинский исследовательский научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва улица Академика Опарина, дом 4, 117997; телефон: 8(915)322-0879, e-mail: zaikinaai@icloud.com

Семенова Мария Львовна — д.б.н., проф. каф. эмбриологии биологического факультета ФГБОУВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», Москва, Ленинские горы 1, строение 12, 119991; телефон: 8 (917) 522-89-82, e-mail: mlsemenova@gmail.com

Абубакиров Айдар Назимович — к.м.н., рук. 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Медицинский исследовательский научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: Москва, улица Академика Опарина, дом 4, 117997; телефон 8 (495)438-2622, e-mail: nondoc555@yahoo.com