Эффективный молекулярный метод оценки тяжести дисфункции эндометрия при бесплодии и невынашивании беременности

В настоящее время хронический эндометрит (ХЭ) как результат репродуктивных проблем остается актуальной темой гинекологии [1, 2]. Максимальная частота его приходится на возрастную группу 26—35 лет, т. е. на пациенток в возрастном интервале, наиболее важном в реализации репродуктивной функции. У женщин с бесплодием ХЭ встречается в 12—68% случаев, достигая максимума при наличии трубно-перитонеального фактора бесплодия. Наибольшие показатели распространенности ХЭ — более 70% отмечены у больных с привычным невынашиванием беременности [3, 4].

Хронический эндометрит — клинико-морфологический синдром, при котором в результате персистирующего повреждения эндометрия инфекционным агентом возникают множественные вторичные морфофункциональные изменения, нарушающие циклическую трансформацию и рецептивность слизистой оболочки тела матки [5, 6]. Очень часто ХЭ проявляется полипами и гиперплазией эндометрия [7, 8].

Ангиогенез и сосудистая трансформация являются важными процессами нормального развития и отторжения эндометрия в менструальном цикле женщины [9]. Они также играют важную роль в развитии и тяжести Х.Э. Одной из ключевых молекул ангиогенеза и выживаемости эндотелия является васкулоэндотелиальный фактор роста (VEGF) [10]. Ингибирование его функции может привести к бесплодию из-за блокировки функции желтого тела.

Плацентарный фактор роста (PIGF) принадлежит семейству VEGF, продуцируется в основном плацентой и является сильным ангиогенным фактором. Тромбоцитарный фактор роста (PDGF) является митогеном и хемотаксическим фактором для мезенхимальных клеток, таких как фибробласты, гладкомышечные клетки сосудов. PDGF воздействует на клетки сосудов и соединительной ткани. Инактивация его сигнальных путей приводит к дефекту развития кровеносных сосудов, очень важных в циклической трансформации эндометрия. Данный фактор роста увеличивает скорость репарационных процессов, регулирует процессы заживления ран. При воспалении в клетках, находящихся в месте повреждения, происходит увеличение уровня экспрессии рецептора PDGF.

Факторы роста могут определяться в плазме и сыворотке крови пациентов, но их уровень в сыворотке значительно выше.

Цель исследования — обосновать диагностическое и прогностическое значение содержания PIGF, PDGF-BB и VEGF-A в сыворотке крови у женщин с различными проявлениями ХЭ при бесплодии и невынашивании беременности.

1. Изучить клинико-анамнестические особенности у женщин с ХЭ, страдающих бесплодием и невынашиванием беременности.

2. Охарактеризовать параметры эндометрия по данным ультразвукового, морфологического и иммуногистохимического методов исследования.

3. Провести анализ уровня VEGF-А, PIGF, PDGF-ВВ в сыворотке крови у женщин с различными проявлениями ХЭ, страдающих бесплодием и невынашиванием беременности.

4. Оценить прогностическую и диагностическую ценность VEGF-А, PIGF, PDGF-ВВ при полипах, типичной гиперплазии эндометрия, умеренном и выраженном ХЭ.

Для реализации поставленных задач проведено комплексное обследование 352 женщин, обратившихся за помощью на специализированный прием по проблемам репродуктивного здоровья в ГУЗ «Ульяновская областная клиническая больница», ООО МЦ «Allegris» и ООО МК «Мой доктор».

Все пациентки были разделены на три группы: 1-ю группу составили 112 женщин с привычной потерей беременности с морфологически и иммуногистохимически подтвержденным ХЭ; 2-ю группу — 144 бесплодные пациентки с ХЭ; 3-ю группу (контрольная) — 96 женщин с мужским фактором бесплодия, структура эндометрия у которых не была изменена.

Всем женщинам проведено общеклиническое исследование: сбор анамнеза, общий и гинекологический осмотр.

Ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза выполнялось на аппаратах Voluson E6 и Voluson E8 («General Electric», США) с использованием мультичастотного трансвагинального датчика с частотой 8 МГц. Проводили динамическое УЗИ во II фазу менструального цикла на 15—22-й день. УЗИ начинали с проведения трансабдоминального сканирования (с наполненным мочевым пузырем) с целью исключения объемной патологии полости малого таза, оценивали ее форму, структуру миометрия, исключали наличие миоматозных узлов и аденомиоза.

Особое внимание уделяли оценке срединного маточного М-эха: его толщине, эхоструктуре и наличию включений. Нормальными параметрами М-эха считались: однородная структура, отсутствие гипо- или гиперэхогенных включений, соответствие его структуры дню менструального цикла, толщина М-эха во II фазу не менее 8 мм.

При ультразвуковой диагностике ХЭ использовали критерии, разработанные В.Н. Демидовым в 1993 г.: повышение эхогенности эндометрия в пролиферативную фазу, неравномерное расширение полости матки за счет нарушения проницаемости сосудов, неровный контур эндометрия, неоднородная эхоструктура эндометрия, неровность линии смыкания эндометрия передней и задней стенок матки, газообразные пузырьки в полости матки, гиперэхогенные включения в проекции базального слоя, диффузно-очаговые и кистозные изменения в субэндометриальной зоне миометрия, расширение вен миометрия более 3 мм и параметрия более 5 мм [11].

Исследование качества эндометрия и содержимого полости матки проводилось путем пайпель- и аспирационной биопсии эндометрия мануальным вакуумным аспиратором Ipas MVA Plus с последующими гистологическим, иммуногистохимическим, бактериологическим исследованиями. Биопсия проводилась по стандартной методике на 7—11-й день менструального цикла. Материал, полученный двумя вышеназванными способами из полости матки, фиксировался в 10% растворе забуференного нейтрального формалина в двух пробирках и направлялся в лабораторию патоморфологической диагностики для проведения гистологического и иммуногистохимического исследований. После стандартной гистологической проводки на полуавтоматическом микротоме получали срезы толщиной 5—7 мкм. Полученные срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Микроскопические препараты исследовали методом обзорной микроскопии, которая осуществлялась на световых микроскопах Carl Zeiss (Германия).

Также проводилось иммуногистохимическое исследование ткани эндометрия с помощью метода пероксидазной техники на парафиновых срезах толщиной 3—4 мкм. Срезы депарафинировали и проводили по спиртам нисходящей концентрации. Десмакировку осуществляли в растворе цитратного буфера 0,01 М рН 6,0 для белка Ki-67 и белка c-erb-B2/HER2/neu и в растворе ЭДТА 0,001 М рН 9,0 для рецепторов эстрогенов и прогестерона на водяной бане в течение 20 мин.

Использовали систему детекции UltraVision Quanto («DAKO», Дания) и моноклональные мышиные антитела фирмы «DAKO»: к рецепторам эстрогена (клон 1D5), прогестерона (клон PgR 636), белку Ki-67 (клон MIB-1); поликлональные кроличьи антитела Her2 в разведении 1:700; к рецепторам лимфоцитов — CD 3 (клон SP 7); CD 4 (клон 4B12); CD 8 (клон), CD 138 (клон); к эпидермальному фактору роста — EGFR (клон) и к андрогеновым рецепторам (клон).

Для определения уровня экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов использовалась полуколичественная система Allred Scoring Guidline оценки процента окрашенных клеток (proportion score, PS) и интенсивности окраски клеток (intensity score, IS), которые затем суммировались: TS (total score) = PS + IS. Процент окрашенных клеток оценивался в баллах: 0 баллов — 0% клеток, 1 балл — 0,1—1% клеток, 2 балла — 2—10% клеток, 3 балла —11—33% клеток, 4 балла — 34—66% клеток, 5 баллов — 67—100% клеток. Интенсивность окрашивания оценивалась в баллах: 0 — отсутствие окрашивания, 1 — слабое окрашивание, 2 — умеренное, 3 — выраженное окрашивание. Таким образом, результат Allred Score колебался от 0 до 8 баллов.

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе AxioLab («Carl Zeiss Jena», Германия) с использованием цифровой фотокамеры («Carl Zeiss Jena», Германия). Количественный анализ результатов иммуногистохимических реакций проводился под увеличением объектива ×20, ×40.

Образцы крови для определения уровня VEGF-А, PIGF, PDGF-ВВ в сыворотке были обработаны на базе научно-исследовательского медико-биологического центра (НИМБЦ) ИМЭиФК ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» (Ульяновск). Забор крови был проведен в утренние часы натощак с соблюдением установленных требований с использованием вакуумного метода. Сыворотку получали стандартным путем. До исследования ее хранили в морозильной камере при температуре –80 °С. Для определения уровня факторов роста методом иммуноферментного анализа были использованы коммерческие тест-системы: Bender MedSystem (Австрия), Affymetrix eBioscience (США) для VEGF-А, IBL (Германия) для PIGF, Bender MedSystem (Австрия) для PDGF-ВВ и автоматический иммуноферментный анализатор PLATE SCREEN («Hospiteх Diagnostics», Италия). Статистическая обработка результатов проводилась в среде Statistica 6.1 с применением непараметрического критерия Манна—Уитни.

У всех 352 женщин, включенных в исследование, выявлен женский тип телосложения с правильным развитием вторичных половых признаков. Возраст женщин варьировал от 23 до 39 лет (средний возраст 31,4±3,3 года).

Согласно полученным данным, женщины всех групп имели регулярный менструальный цикл. Средний возраст менархе не различался и составил 13,2±1,3 года в 1-й группе, 14,1±1,2 года во 2-й и 13,2±1,1 года в 3-й. Позднее менархе выявлено у 32 (22,2±7,8%) пациенток с бесплодием и у 12 (8,3±5,8%) женщин контрольной группы, раннее — у 12 (10,7±5,9%) женщин 1-й группы и 20 (13,9±5,8%) женщин 2-й. У остальных женщин особенностей становления менархе выявлено не было.

Продолжительность менструального цикла варьировала от 24 до 33 дней и составила в среднем 29,2±2,2 дня в 1-й группе, 28,4±2,8 дня во 2-й и 29,1±3,1 дня в 3-й. Средняя длительность кровотечения у женщин с привычной потерей беременности составила в среднем 4,3±2,9, 5,2±1,8 и 6,1±1,2 дня соответственно.

Длительность бесплодия во 2-й группе обследуемых колебалась от 2 до 14 лет и составила в среднем 10,6±2,2 года. Частота первичного бесплодия составила 77,8±7,0% (n=112), вторичного — 22,2±7,0% (n=32). Предшествующие беременности закончились абортами у 32 (22,2±7,0%) пациенток. C такой же частотой отмечались внематочные беременности. У 16 (11,1±5,3%) обследуемых выявлены неразвивающиеся беременности.

У пациенток 1-й группы общее число маточных беременностей было 240. В анамнезе аборты были у 32 (28,6±8,7%) женщин, выкидыши — у 48 (42,9±9,5%), неразвивающиеся беременности — у 80 (71,4±8,7%). Внематочных беременностей отмечено не было.

Исходы предыдущих беременностей в 3-й группе: аборты — у 8 (8,3±5,8%) женщин. У такого же количества женщин отмечались неразвивающиеся и внематочные беременности. Выкидыши выявлены у 16 (16,7±7,8%) пациенток.

Возраст начала половой жизни не различался во 2-й и 3-й группах и в среднем составил 18,2±0,4 года. В 1-й группе начало половой жизни было в 22,0±1,2 года (p<0,01). У женщин, страдающих невынашиванием, вредных привычек не отмечалось, как и у пациенток контрольной группы. Среди бесплодных пациенток 16 (11,1±5,3%) курили. Все женщины 1-й группы, 128 (88,9±5,3%) женщин 2-й и 80 (83,3±7,8%) 3-й были замужем (р>0,05).

Рассматривая анамнестические данные о перенесенных гинекологических заболеваниях, было установлено, что наиболее часто женщины с ХЭ указывали на инфекции, передаваемые половым путем (ИППП): в 1-й группе таких женщин было 64 (57,1±9,5%), во 2-й — 64 (44,4±8,4%). В контрольной группе на ИППП указали 16 (16,7±7,8%) женщин (р<0,01). Воспалительные заболевания женских половых органов (ВЗЖПО) в группе контроля отметили 24 (25,0±9%) пациентки, в группе женщин с бесплодием — 80 (55,6±8,4%), что достоверно чаще, чем в группе контроля (р<0,05), в группе пациенток с привычной потерей беременности — 32 (28,6±8,7%), что практически не имело различий с контрольной группой (р>0,05). Патология шейки матки более часто, чем у женщин с невынашиванием и бесплодием, выявлялась в группе контроля — у 56 (58,3±10,3%). Во 2-й группе заболевания шейки матки наблюдались у 64 (44,4±8,4%) пациенток, в 1-й — у 48 (42,9±9,5%). Отметим, что достоверных различий в частоте заболеваний шейки матки в группах выявлено не было.

В структуре экстрагенитальной патологии заболевания щитовидной железы достоверно чаще встречались у пациенток с невынашиванием беременности, чем в группе контроля, — у 64 (57,1±9,5%) и 16 (16,7±7,8%) соответственно (р<0,01). У пациенток с бесплодием данная патология была у 48 (33,3±8,0%), что достоверно не различалось с контрольной группой (р>0,05). Метаболический синдром регистрировался у 16 (14,3±6,7%) пациенток 1-й группы, у 16 (11,1±5,3%) 2-й и не выявлялся в группе контроля.

Обращает на себя внимание наличие большого числа аппендэктомий у бесплодных женщин — у 48 (33,3±8,0%). Такой же удельный вес вышеуказанных оперативных вмешательств был в группе контроля. У женщин с привычной потерей беременности аппендэктомии встречались лишь у 16 (14,3±6,7%) (р<0,05). Отсутствие экстрагенитальной патологии выявлялось в большем числе у женщин 1-й группы — у 32 (28,6±8,7%) и лишь у 16 (16,7±7,8%) в группе контроля (р>0,05). Во 2-й группе отсутствие экстрагенитальной патологии не наблюдалось.

У пациенток всех групп при УЗИ статистически значимых различий в размерах тела матки и объеме яичников выявлено не было. Обращает на себя внимание, что при обследовании у женщин 1-й и 2-й групп обнаружено изменение эхоструктуры эндометрия в 69% случаев, в то время как у всех 96 женщин 3-й группы изменений не отмечалось. В структуре ультразвуковых признаков ХЭ у пациенток 1-й и 2-й групп преобладали: неоднородная эхоструктура эндометрия, его неоднородный контур и повышение эхогенности (рис. 1). Реже наблюдали гиперэхогенные включения в базальном слое эндометрия, газообразные пузырьки в полости матки и ее расширение.

При бактериологическом исследовании аспиратов из полости матки роста микрофлоры не выявлено у 80 (83,3±7,8%) пациенток контрольной группы, 24 (66,6±8,0%) женщин с бесплодием и у 56 (50±9,6%) — с привычной потерей беременности (р>0,05). Во всех группах чаще выявлялся Enterococcusfaecalis. Все пациентки получили специфическую антибактериальную и антимикотическую терапию.

В результате гистологического и иммуногистохимического исследований получены следующие данные. Выраженная хроническая воспалительная реакция эндометрия выявлялась чаще у женщин с невынашиванием беременности — у 16 (14,3±6,7%) в сравнении с бесплодными пациентками — у 16 (11,1±5,3%) (р>0,05). Умеренновыраженные проявления ХЭ встречались также чаще в 1-й группе — у 64 (57,1±9,5%) в сравнении с пациентками 2-й группы — у 80 (55,6±8,4%) (р>0,05) (рис. 2). Железистые полипы эндометрия выявлялись гораздо чаще у женщин с невынашиванием беременности — у 64 (57,1±9,5%), чем у пациенток с бесплодием, — у 32 (22,2±7,0%) (р>0,05). Сложная гиперплазия эндометрия без атипии желез встречалась чаще во 2-й группе — у 80 (55,6±8,4%) в сравнении с 1-й группой женщин — у 32 (28,6±8,7%) (р<0,05) (рис. 3). Гипопластический эндометрий встречался только у бесплодных женщин — у 32 (22,2±7,0%) (р<0,01), сложная гиперплазия эндометрия с дисплазией эпителия желез — только у пациенток с привычной потерей беременности — у 16 (14,3±6,7%) (р>0,05). Выраженное и умеренновыраженное хроническое воспаление часто сочеталось с полипами и гиперплазией эндометрия без атипии.

В зависимости от особенностей общей и тканевой реактивности, продолжительности заболевания, наличия обострений и степени их выраженности морфологическими критериями постановки диагноза «хронический эндометрит» явились:

— воспалительные инфильтраты, состоящие преимущественно из лимфоцитов, нейтрофильных лейкоцитов, расположенных чаще вокруг желез и кровеносных сосудов, реже диффузно;

— наличие плазматических клеток [12];

— альтерация стромы эндометрия, в том числе фиброз;

— склеротические изменения спиральных артерий [13];

— деформация желез;

— очаговая гиперплазия базального слоя [14, 15].

Нарушение рецепторного аппарата эндометрия выявлялось у всех 100% бесплодных женщин и у 92 (82,1±7,4%) пациенток с невынашиванием беременности (р<0,05). Нарушение экспрессии андрогеновых рецепторов в эндометрии наблюдалось только у обследуемых 2-й группы — у 32 (22,2±7,0%) (р<0,01). Отмечено наличие яркой экспрессии эпидермального фактора роста только у женщин с невынашиванием беременности — у 16 (14,3±6,7%) (р>0,05). Выраженная и умеренная экспрессия лимфоцитов встречалась у 80 (71,4±8,7%) женщин 1-й группы и у 96 (66,7±8,0%) — 2-й группы (р>0,05).

Плазматические клетки CD138 были выявлены у 63 (56,3±4,7) обследуемых с невынашиванием беременности и у 59 (41,0±4,1) — с бесплодием (р<0,05). Наличие только лимфогистиоцитарной инфильтрации в строме эндометрия без плазматических клеток нами было расценено как картина неполного ХЭ. В таких случаях мы проводили полную комплексную терапию всем женщинам.

При исследовании маркера пролиферативной активности Ki-67 выявлено усиление его экспрессии только у 16 (14,3±6,7%) пациенток с невынашиванием беременности (р>0,05).

Нами были проведены попытки выявления связи тяжести ХЭ с учетом изменения уровня VEGF-A, PIGF и PDGF в сыворотке крови у женщин с бесплодием и невынашиванием беременности. С этой целью мы разделили женщин 1-й и 2-й групп на следующие подгруппы: пациентки с гистологически подтвержденным только полипом эндометрия (n=24), только с гиперплазией эндометрия без атипии (n=20), только с умеренным (n=48) и выраженным (n=26) хроническим воспалением (см. таблицу).

При анализе уровня человеческого PIGF в сыворотке крови самое его высокое значение 1967±22,7 пг/мл было выявлено у пациенток с выраженным хроническим воспалением, самое низкое — 759,6±22,4 пг/мл при гиперплазии эндометрия без атипии. Последний показатель был практически равен группе контроля — 716,8±18,3 пг/мл.

Самые высокие показатели PDGF-BB 1731,8±22,8 пг/мл определились у женщин с умеренновыраженным хроническим воспалением, самые низкие — 1022,9±21,6 пг/мл при типичной гиперплазии эндометрия. Необходимо отметить, что все значения PDGF-BB укладывались в референсные значения, указанные на индикаторах. Это свидетельствует о его опосредованном участии в процессах хронического воспаления эндометрия, кроме того, он играет важную роль в процессах выживания и регенерации клеток.

Уровень VEGF-A был самым высоким 3421,3±24,1 пг/мл при умеренновыраженном хроническом воспалении, самым низким 215,2±33,1 пг/мл — при гиперплазии эндометрия без атипии.

Таким образом, как видно из результатов нашего исследования, наиболее тяжело протекает ХЭ с умеренной и высоковыраженной лимфогистиоцитарной инфильтрацией, которая чаще выявляется у женщин с невынашиванием беременности. У женщин с гиперплазией эндометрия патологический ангиогенез не выражен, что сопровождается вялотекущим воспалением в слизистой оболочке полости матки в основном у женщин с бесплодием.

Обращает на себя внимание группа контроля, в которой уровень PIGF и VEGF-A выходит за пределы референсных значений. Это, вероятно, связано с неблагоприятным репродуктивным анамнезом в 3-й группе, описанным нами ранее: в данной группе имели место аборты, выкидыши, неразвивающиеся и внематочные беременности. Еще раз подтверждается высокая чувствительность данных факторов роста к изменениям в эндометрии. Таким образом, определение в сыворотке крови уровня PIGF и VEGF-A является высокочувствительным методом исследования.

На рис. 4 наглядно представлена взаимосвязь уровня факторов роста в сыворотке крови. Самые большие изменения в гинекологическом, соматическом статусах, морфологии эндометрия, описанных нами выше, выявлялись у пациенток с невынашиванием беременности. Самые высокие показатели активности PIGF и VEGF-A наблюдались в этой же группе. Это свидетельствует о том, что PIGF увеличивает VEGF-ассоциированный ангиогенез. Таким образом, при бесплодии и невынашивании беременности уровень PIGF и VEGF-A повышается, что является маркером неудачной имплантации при ХЭ.

1. Наиболее значимые отклонения в соматическом, гинекологическом статусах, морфологические изменения отмечались в группе женщин с невынашиванием беременности.

2. При УЗИ изменение эхоструктуры эндометрия наблюдалось у 69% пациенток с бесплодием и привычной потерей беременности. Эхоструктура эндометрия у всех женщин контрольной группы не была изменена.

3. Самый высокий уровень PIGF (1967,3±22,7 пг/мл) выявлен у женщин с выраженным хроническим воспалением, самые низкие (716,8±18,3 пг/мл) его значения — в группе контроля. Максимальные показатели уровня PDGF-BB и VEGF-A в сыворотке крови наблюдались при умеренновыраженном ХЭ — 1731,8±22,8 и 3421,3±24,1 пг/мл соответственно. Минимальные изменения — при гиперплазии эндометрия без атипии (1022,9±21,6 и 215,2±33,1 пг/мл соответственно), но общие значения не выходили за пределы референсных значений.

4. Нами впервые установлено увеличение уровня PIGF и VEGF-A у женщин с умеренной и выраженной лимфогистиоцитарной инфильтрацией эндометрия при бесплодии и невынашивании беременности и относительное снижение уровня PDGF-BB.

В заключение необходимо отметить, что полученные нами данные, основанные на комплексной морфологической и иммуноферментной диагностике состояния имплантационного эндометрия, могут использоваться в клинической практике. Определение уровня PIGF и VEGF-A является одним из чувствительных методов оценки состояния эндометрия, а повышение их значений служит прогностическим маркером неудач имплантации при различных формах ХЭ.

Конфликт интересов отсутствует.