Начиная с самых первых попыток успешного культивирования invitro [1] доля эмбрионов человека, достигающих стадии бластоцисты, остается весьма низкой. Оптимальные условия и состав среды культивирования являются критическими факторами для развития эмбрионов in vitro [2—4]. На сегодняшний день исследования действия, оказываемого средой культивирования на эмбрионы человека, сосредоточились на сравнении эффективности использования различных коммерческих сред [5—8]. В настоящей работе из имеющегося разнообразия коммерческих сред выбраны широко применяемые среды Quinn’s Advantage и Global.

Цель настоящего исследования — сравнить эффективность программ ВРТ, в которых переносили размороженные эмбрионы, полученные при проведении эмбриологического этапа с использованием сред Quinn’s Advantage (SAGE In Vitro Fertilization, Inc) и Global (LifeGlobal).

В настоящем ретроспективном нерандомизированном исследовании оценивались следующие параметры: частота образования бластоцист, частота наступления беременности, частота имплантации эмбрионов, частота беременностей с диагностируемым сердцебиением, количество выкидышей.

В исследование включены пациентки, соответствующие следующим критериям: возраст от 20 до 39 лет включительно, отсутствие генетических факторов бесплодия в анамнезе, отсутствие тяжелых форм патозооспермии у партнера, индукция суперовуляции по короткому протоколу с использованием антагонистов (ант)ГнРГ, наличие после завершения эмбриологического этапа криоконсервированных эмбрионов хорошего и отличного качества на стадии бластоцисты.

При получении ооцитов пациентки были разделены на группы. В 1-й группе (200 человек) для проведения эмбриологического этапа была использована линейка сред Quinn’s Advantage (SAGE In Vitro Fertilization, Inc) (общее количество ооцитов МII — 2597), а в другой группе (225 человек) эмбриологический этап проводился в средах Global (LifeGlobal) (общее количество ооцитов МII — 3155).

В ретроспективном исследовании был осуществлен отбор всех пациентов, у которых проводились циклы с использованием ICSI или IMSI Hoffman modulation и перенос криоконсервированных/размороженных бластоцист, и удовлетворяющих критериям выбора пациентов для включения в исследование. Среды Quinn’s Advantage использовались в 206 циклах, среды Global — в 225 циклах.

Овариальная стимуляция

Индукцию суперовуляции в обеих группах проводили по короткому протоколу с использованием антГнРГ со 2—3-го дня менструального цикла с использованием рекомбинантных и/или мочевых гонадотропинов в суточной дозе 150—300 М.Е. Овуляцию инициировали введением хорионического гонадотропина человека (чХГ) в дозе 10 000 МЕ за 34—36 ч до пункции ооцитов.

Получение ооцитов

Аспирацию фолликулов выполняли под внутривенным наркозом. Ооциты, окруженные слоем клеток кумулюса, получали в результате трансвагинальной пункции фолликулов под ультразвуковым контролем спустя 34—36 ч после введения овуляторной дозы чХГ. Ооцит-кумулюсные комплексы изолировали в среду, содержащую или HEPES-буфер (Quinn’sAdvantagemediumwithHEPES (SAGEInVitroFertilization, Inc) — группа Quinn’s Advantage, или Globalcollect (LifeGlobal) — группа Global. После окончания процедуры аспирации фолликулов ооцит-кумулюсные комплексы переносили в лунки, содержащие 500 мкл среды (Quinn’sAdvantageFertilization (HTF)Medium + 10% (v/v) QuinnsAdvantageSerumProteinSubstitute — группа Quinn’sAdvantage и GlobalforFertilization + 10% (v/v) LifeGlobalProteinSupplement — группа Global) под слоем минерального масла (ParaffinOilforTissueCulture (SAGEInVitroFertilization) — группа Quinn’sAdvantage и LiteOil (LifeGlobal) — группа Global и инкубировали при 37 °C в СО₂-инкубаторе (6,1% СО₂ — для сред Quinn’sAdvantage; 7,3% СО₂ — для сред Global) до процедуры денудации.

Подготовка спермы

Подвижные сперматозоиды отбирали путем осаждения в двухступенчатом градиенте плотности в среде PureCeption (SAGE In Vitro Fertilization, Inc) — группа Quinn’s Advantage и ALLGrad (LifeGlobal) — группа Global, затем отмывали и осаждали в средах Quinn’s sperm washing medium with HEPES (SAGE In Vitro Fertilization, Inc) и ALLGrad Wash (LifeGlobal) соответственно, после чего использовали метод «swim-up».

Оплодотворение

Для оплодотворения полученных ооцитов применяли процедуру ICSI или IMSI Hoffman modulation [9, 10]. Клетки кумулюса удаляли мягким пипетированием (Flexipet (Cook) спустя 3—4 ч после забора ооцитов, используя раствор гиалуронидазы в HEPES-HTF (SAGE In Vitro Fertilization, Inc) в группе Quinn’s Advantage и Hyaluronidase (LifeGlobal) в группе Global. Процедура ICSI/IMSI Hoffman modulation была выполнена через 1—2 ч после денудации, на инвертированном микроскопе Leitz Fluovert FU («Wild Leitz GmbH», Германия) с использованием системы Хоффмановского модуляционного контраста и оборудованном комплектом микроманипуляторов Narishige («Narishige», Токио, Япония).

Культивирование эмбрионов

Инъецированные ооциты отмывали и помещали в лунку, содержащую 500 мклсреды (Quinn’s Advantage Fertilization (HTF) Medium + 10% (v/v) Quinns Advantage Serum Protein Substitute — группа Quinn’s Advantage и Global for Fertilization + 10% (v/v) LifeGlobal Protein Supplement — группа Global) подслоемминеральногомасла. Передоценкойрезультатовоплодотворения (18 чкультивированияпосле ICSI/IMSI Hoffman modulation) зиготыиндивидуальнопереносилив 30-мклкапливкультуральныхчашкахПетрисосредой Quinn’s Advantage Cleavage Medium + 10% (v/v) Quinns Advantage Serum Protein Substitute (группа Quinn’s Advantage) или Global + 10% (v/v) LifeGlobal Protein Supplement (группа Global) подслоемминеральногомасла. Культивирование осуществляли при 37 °C в СО₂-инкубаторе (6,1% СО₂ — для сред Quinn’sAdvantage; 7,3% СО₂ — для сред Global). Через 72 ч после оплодотворения эмбрионы перемещали в капли со свежей средой Quinn’sAdvantageBlastocystMedium + 10% (v/v) QuinnsAdvantageSerumProteinSubstitute (группа Quinn’sAdvantage) или Global + 10% (v/v) LifeGlobalProteinSupplement (группа Global) под слоем минерального масла.

Оценка качества эмбрионов

Зиготы и эмбрионы индивидуально оценивали под микроскопом: через ~18, ~45, ~72 и ~96 ч после оплодотворения на предмет их развития и качества. На 5—6-е сутки развития проводилась оценка качества сформировавшихся бластоцист. Для переноса эмбрионов (ПЭ) и криоконсервации использовали расширенные бластоцисты качества АА, АВ, ВА и ВВ по D. Gardner [11].

Криоконсервирование и размораживание эмбрионов

Криоконсервирование эмбрионов в обеих опытных группах проводили с использованием набора для витрификации VitrificationKit (101) («Cryotech», Япония), согласно протоколу производителя. Размораживание осуществляли в наборе WarmingKit (102) («Cryotech», Япония), согласно протоколу производителя.

Перенос эмбрионов и оценка беременности

Разморозка криоконсервированных эмбрионов проводилась непосредственно в день П.Э. Среднее количество эмбрионов на перенос составило 1,1. Беременность считали достигнутой, если уровень β-чХГ в сыворотке крови был >10 МЕ/мл через 10 дней после ПЭ и увеличивался в 4 раза на 14-й день после П.Э. Клиническую беременность определяли по наличию плодного яйца в полости матки, копчико-теменному размеру плода 2—4 мм и регистрации сердцебиения при ультразвуковом исследовании на 5-й неделе после ПЭ.

Статистический анализ

Результаты исследований выражены как средние значения показателей ± SD. Статистическая обработка выполнялась с использованием критерия Стьюдента и χ².

В исследовании участвовали 425 пациенток в возрасте от 20 до 39 лет включительно, которым провели 431 цикл индукции суперовуляции с последующей пункцией ооцитов.

В группах Quinn’sAdvantage и Global не отмечено существенного различия в доле оплодотворенных яйцеклеток. Развитие и качество эмбрионов на 2—3-йдень после оплодотворения также не различались (данные не представлены). Однако частота образования бластоцист достоверно различалась в обеих группах и составила 54,4±22,9% для группы Quinn’s Advantage и 62,9±21,5% — для группы Global. Также выявлено различие по времени образования бластоцист. Для группы Quinn’s Advantage 60,7% бластоцист (от общего количества бластоцист, развившихся за 6 дней культивирования) было получено на 5-й день и 39,3% — на 6-й день. Для группы Global данные показатели составили 73,5 и 26,5% соответственно. Таким образом, развитие эмбрионов в среде Global происходило с большей интенсивностью, чем в средах Quinn’s Advantage, и большее число эмбрионов достигало стадии бластоцисты к 5-му дню культивирования (табл. 1).

Данные относительно ПЭ и частоты наступления беременности представлены в табл. 2.

В то время как среднее количество эмбрионов на перенос в обеих группах было одинаковым (1,1), все остальные оцениваемые показатели были выше в группе Global, различия статистически достоверные. Доля П.Э., давших положительный тест на β-чХГ, в группе Global — 54,9% (151/275) была значительно выше (p<0,01) по сравнению с группой Quinn’s Advantage — 43,8% (116/265). Эти значения также отразились на частоте наступления клинической беременности, которая была значительно выше (p<0,05) в группе Global — 48,0% (132/275) по сравнению с группой Quinn’s Advantage — 39,2% (104/265). Кроме того, частота имплантации эмбрионов и доля прогрессирующей клинической беременности были выше для группы Global и составили 46,1 и 73,8% соответственно, а для группы Quinn’s Advantage — 37,1 и 66,7% соответственно.

В нашем исследовании были зафиксированы две эктопические беременности, обе в группе Quinn’s Advantage. Потеря плода до 12 нед была ниже в группе Global (25,8%) по сравнению с группой Quinn’s Advantage (27,9%), хотя разница оказалась статистически недостоверной. Показатели потерь плода с 12-й по 24-ю неделю гестации, а также доля преждевременных и своевременных родов в группах Global и Quinn’s Advantage статистически не различались (данные не представлены).

Преимплантационные эмбрионы человека могут развиваться в культуральных средах различного состава. K. Wiemer и соавт. [12, 13] показали, что модифицированная версия среды KSOM-АА способна обеспечить высокие нормы развития эмбрионов человека с 3-го дня культивирования и до стадии бластоцисты. Впоследствии среда была модифицирована для культивирования эмбрионов человека и поступила на рынок под маркой Global от компании «LifeGlobal». Положив в основу состав среды HTF [14], компания «SAGE In Vitro Fertilization, Inc» начала выпуск линейки сред Quinn’s Advantage для культивирования эмбрионов человека in vitro.

Значительные различия в составах сред приводят к различным результатам культивирования эмбрионов и различной частоте наступления беременности.

По данным M. Neal и соавт. [15], при культивировании эмбрионов человека с 1-го по 3-й день на средах Global и HTF развитие эмбрионов значительно различалось, особенно к 3-му дню развития, в пользу среды Global. Частота наступления беременности была выше в группе Global, чем в группе HTF. В работе М. Riqueros и соавт. [16] было показано увеличение доли замороженных эмбрионов и процента беременности для эмбрионов, культивируемых в среде Global, в сравнении со средой HTF.

При культивировании эмбрионов с 1-го по 3-й и с 3-го по 5—6-й дни в средах Global и Quinn’s Advantage было отмечено значительное достоверное увеличение доли развития эмбрионов до стадии бластоцисты в среде Global, однако увеличение частоты наступления беременности и частоты имплантации оказалось статистически недостоверным [17]. В исследованиях N. Basile и соавт. [18] для сред Quinn’s Advantage и Global не было обнаружено никаких различий в показателях дробления эмбрионов, образовании бластоцист и частоте наступления беременности.

Данные настоящего исследования согласуются и дополняют вышеприведенные результаты, полученные зарубежными коллегами.

При проведении эмбриологического этапа на средах Quinn’s Advantage (SAGE In Vitro Fertilization) и Global (LifeGlobal) с использованием для ПЭ криоконсервированных бластоцист выявлено повышение эффективности программ ЭКО при использовании среды Global (LifeGlobal) по сравнению со средами Quinn’s Advantage.

При финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14−50−00029 от 31.12.2014 г. «Научные основы создания национально банка-депозитария живых систем»)

Конфликт интересов отсутствует.