Биохимические маркеры неразвивающейся беременности

Значимой проблемой в современном акушерстве остается невынашивание беременности, не только ведущее к снижению рождаемости, но и оказывающее отрицательное воздействие на репродуктивное здоровье женщины. Одним из вариантов потери плода является неразвивающаяся беременность (НБ). В структуре репродуктивных потерь частота этой патологии составляет 10-20%. Задержка погибшего эмбриона в матке, характеризующаяся скрытым клиническим течением, отрицательно сказывается на последующей репродуктивной функции женщины, угрожает не только ее здоровью, но и жизни за счет возможных гемостазиологических и инфекционных осложнений [1-3].

НБ является многофакторным заболеванием. У большинства пациенток имеет место сочетание одновременно нескольких причин (генетических, иммунных, эндокринных и др.).

НБ на раннем сроке может быть обусловлена генетической поломкой самого эмбриона, произошедшей на той или иной стадии его развития. Плод просто не жизнеспособен, поэтому и отторгается. Генетические аномалии встречаются приблизительно в 5-13% неблагоприятных исходов беременности [1, 4, 5]. Другой часто встречающейся, по мнению ряда авторов, причиной нарушения развития беременности и формирования эмбриона является дисбаланс в эпигенетической регуляции деятельности иммунокомпетентных клеток [6-8]. В основе эпигенетического действия на иммунокомпетентные клетки может быть ускоренное ацетилирование, фосфорилирование или замедленное метилирование гистоновых белков с последующим их отхождением от генов, отвечающих за синтез провоспалительных цитокинов, что приводит к стойкой экспрессии соответствующих генов [9-11]. Функциональная активация клеток иммунной системы, происходящая при развитии беременности, отражается на метаболизме, цитохимической активности ферментов и транскрипционной активности ядер клеток.

Цель настоящей работы - исследование фракций гистоновых белков и ферментов энергетического обмена - сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и α-глицерофосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ) в лимфоцитах периферической крови при физиологической и неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе плода.

Проведено проспективное когортное сравнительное исследование. Для реализации поставленной задачи были обследованы три группы пациенток (всего 80 человек). Основную группу (1-я) составили 30 женщин с физиологически протекающей беременностью в I триместре беременности; группу сравнения (2-я) - 30 женщин с неразвивающейся беременностью в те же сроки гестации (20 человек). В контрольнцую группу (3-я) вошли 20 здоровых небеременных женщин сопоставимого возраста.

Всем пациенткам были выполнены общие клинико-лабораторные исследования с целью исключения острых вирусных и бактериальных заболеваний, а также цитогенетическое исследование эмбриональных тканей, полученных из полости матки вакуум-аспирацией при неразвивающейся беременности. Клинический диагноз неразвивающейся беременности ставился в ходе динамического ультразвукового исследования при наличии в полости плодного мешка внутриутробно погибшего эмбриона. Гестационный возраст эмбрионов составил 4-11,5 (7,5±1,8) нед. Критерием исключения явилась тяжелая соматическая патология и хромосомный дисбаланс плода при неразвивающейся беременности. Исследования у беременных женщин были выполнены в сроке 8,3±0,8 нед в основной группе, 7,9±0,3 нед в группе сравнения. Группы не различались по частоте выявления неблагоприятных социально-бытовых факторов и экстрагенитальной патологии.

У всех обследованных лиц получено информированное согласие на проведение исследования.

Венозную кровь забирали из локтевой вены в вакуумную пробирку с гепаринатом лития. Лимфоциты из крови выделяли с помощью градиента фиколл-верографина. Концентрацию клеток определяли в камере Горяева и доводили до 6 млн/мл. Фракции гистоновых белков определяли кислотно-спиртовым методом Л.И. Маркушевой и соавт. [12].

Количество белка в каждой фракции гистонов определяли по оптической плотности, измеренной при 260 и 280 нм, и соответствующих расчетов с помощью встроенной программы DNA/Protein Analyse на спектрофотометре Spekol 1300 («Analytik JenaAG»).

Для оценки состояния клеточного энергетического обмена исследовали активность СДГ и α-ГФДГ в лимфоцитах периферической крови цитохимическим методом (тест-системы фирмы «Поликом», Москва). Подсчет гранул диформазана производили в 100 лимфоцитах по методике Нахласа и соавт. в модификации Р.П. Нарциссова [13], затем высчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК), отражающий соотношение популяций лимфоцитов с различной активностью фермента.

Для цитогенетического исследования фрагменты плодного мешка тщательно отмывали от крови и децидуальной ткани в среде RPMI-1634 комнатной температуры. Отобранные отдельные ворсины хориона обрабатывали по стандартному протоколу ускоренного «прямого» метода приготовления препаратов хромосом из ворсин хориона. Приготовленные препараты окрашивали стандартным дифференциальным методом G-окраски с применением 0,25% раствора трипсина и раствора красителя Гимзы. Кариотипирование проводили на микроскопе LeicaDM4000B c программным обеспечением LeicaCW 4000 Karyo.

Статистический анализ полученных данных выполнен с помощью электронных таблиц Microsoft Office Excel и пакета прикладных программ Statistica for Windows 7.0. Количественные признаки тестированы на соответствие их нормальному распределению с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента. Различие средних значений считали достоверным при р<0,05.

Установлено, что у небеременных женщин в лимфоцитах периферической крови преобладают гистоновые белки, относящиеся к Н₁-фракции, - 58,85±6,02 мкг/мл. На долю Н_2А, Н₃, Н₄-фракций приходится 47,15±6,81 мкг/мл, на долю Н_2В -гистонов - 6,89±1,11 мкг/мл. Активность СЦК - 3,1±0,2 и 2,0±0,1 усл. ед. (реакция на СДГ и α-ГФДГ соответственно).

При физиологическом развитии беременности наблюдается достоверное (p<0,001) повышение общего содержания гистоновых белков до 186,46±13,1 мкг/мл (примерно в 1,7 раза больше, чем у небеременных), наибольший прирост (более чем в 2 раза) отмечается со стороны Н_2А, Н₃, Н₄ и Н_2В-фракций. Содержание Н₁-фракции увеличилось на 14,3%.

Известно, что содержание гистоновых белков Н_2А, Н₃, Н₄ и Н_2В в лимфоцитах крови в определенной степени коррелирует с синтезом лимфоцитами провоспалительных цитокинов. Гистоны ацетилируются гистоновой ацетилтрансферазой и отделяются от ДНК, что сопровождается экспрессией генов провоспалительных цитокинов. Повышенное количество гистонов этих фракций, связанных с ДНК, можно расценивать как «молчание» соответствующих генов, уменьшение активности лимфоцитов и развитие толерантности организма матери к тканям плода.

Активность ферментов цикла Кребса в лимфоцитах крови у беременных женщин основной группы достоверно меньше, чем в контрольной, СЦК СДГ - 2,5±0,2 усл.ед., α-ГФДГ - 1,6±0,1 усл.ед. (р<0,05).

При неразвивающейся беременности повышение общего содержания гистоновых белков менее выраженное (примерно в 1,2 раза). Содержание Н_2А, Н₃, Н₄-фракций увеличилось всего на 25% (в основной группе - более чем в 2 раза), однако значительно повысилось содержание белков Н_2В-фракции - в 3,5 раза выше, чем у небеременных, и на 40% выше, чем в 1-й группе. Уровень Н₁-гистонов остался без изменения в сравнении с контролем.

Показатели активности ферментов энергообмена составили: СЦК СДГ - 2,9±0,3 усл.ед. и α-ГФДГ - 1,8±0,1 усл.ед. Достоверное отличие (р<0,05) по сравнению с контролем наблюдалось только со стороны α-ГФДГ. СЦК СДГ был несколько выше, чем у беременных 2-й группы, однако достоверно не отличался ни от контроля, ни от такового у беременных 1-й группы.

Таким образом, установлено изменение содержания фракций гистоновых белков и активности митохондриальных дегидрогеназ при беременности. В норме общее содержание гистоновых белков, особенно Н_2А, Н₃, Н₄ и Н_2В-фракций повышается, активность митохондриальных ферментов - СДГ и α-ГФДГ снижается. У пациенток с НБ достоверное снижение активности по сравнению с контролем получено только в отношении α-ГФДГ, общее содержание гистоновых белков увеличилось, но меньше, чем в основной группе (кроме Н_2В-фракции). Различие показателей в группе пациенток с физиологической и неразвивающейся беременностью можно объяснить отсутствием наступления толерантности и невыживанием эмбриона.

Конфликт интересов отсутствует.