Несмотря на впечатляющие успехи в области молекулярной биологии и физиологии репродукции млекопитающих, в частности человека, в настоящее время основополагающими в стратегии вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) при лечении абсолютного и других форм женского бесплодия, как нам представляется, являются два главных или наиважнейших положения.
К началу 70-х годов прошлого века, за несколько лет до появления на свет первого ребенка «из пробирки», у большинства исследователей, занимавшихся проблемой оплодотворения женских половых клеток вне организма, сложилось впечатление, что, чтобы получить жизнеспособные эмбрионы в результате оплодотворения in vitro женских половых клеток, процесс роста и созревания ооцитов завершить в самом организме женщины. К этому выводу в конце концов пришли Р. Эдвардс и П. Стептоу - родоначальники метода ЭКО. И первый в мире ребенок «из пробирки» в 1978 г. появился у женщины, у которой с помощью лапароскопии из яичников была извлечена одна яйцеклетка в середине естественного менструального цикла. Это был один из первых важных постулатов, которые в дальнейшем надолго определили стратегию врача при лечении женского бесплодия. Правда, в настоящее время уже освоен метод созревания незрелых ооцитов, находящихся на стадии зародышевого пузырька, но фактически завершивших свой рост в организме женщины. Однако известно, что ооциты, созревшие in vitro (IVM), характеризуются низкой частотой оплодотворения и дальнейшего развития [13, 18].
По мере накопления знаний о закономерностях фолликулогенеза, физиологии гаметогенеза и особенностях раннего эмбрионального развития у человека стало очевидно, что, если такой способ лечения безнадежного бесплодия - ЭКО в естественном менструальном цикле - дает возможность принципиально решить проблему, то частота положительных исходов при этом не превышает около 15%. Причем, ни усложнение состава культуральных сред, ни усовершенствование технического оснащения и обретение опыта культивирования половых клеток и эмбрионов человека вне организма, как правило, при этом не позволяют увеличить этот процент сегодня. Чем это обусловлено?
Еще в 70-х годах XX века в результате изучения частоты хромосомных нарушений у абортусов после спонтанного прерывания беременности на раннем ее сроке, а также на основании изучения природы так называемой инапарентной беременности были опубликованы данные о том, что у здоровых людей активного репродуктивного возраста из всех плановых зачатий лишь в 30% наступает реальная беременность. Часть ооцитов не оплодотворяется вовсе, основная же масса начавших свое развитие эмбрионов погибает в первые 2 нед после оплодотворения (см. таблицу).
В конце XX века - начале XXI века было показано [1, 15, 16], что это обусловлено, с одной стороны, высокой чувствительностью половых клеток к самым разнообразным неблагоприятным факторам внешней и внутренней среды, в результате чего на завершающих этапах их роста и созревания увеличивается вероятность неправильного расхождения хромосом при завершении мейоза и может происходить ряд морфофункциональных расстройств в формирующихся гаметах. С другой стороны, это связано с несинхронным ростом фолликулов, обусловливающим к моменту выброса триггирующего овуляцию лютеинизирующего гормона наличие в яичниках незрелых или перезревших яйцеклеток в фолликулах, способных к овуляции. При этом показано, что снижение качества ооцитов имеет отчетливую возрастную динамику. Но этот вопрос требует особого рассмотрения, хотя в основе этиологии угасания репродуктивной функции и различных нарушений ее у человека лежат, по существу, схожие механизмы, из которых важнейшими являются нарушения нейрогормональной регуляции фолликуло- и гаметогенеза.
В результате организм сам вынужден выбраковывать до 70% гамет и более из процесса репродукции. Таким образом, получение абсолютно полноценной яйцеклетки у женщины в естественном цикле при проведении процедуры ВРТ представляется событием в какой-то степени случайным [10]. Это - второе обстоятельство, которое привело к осознанию того, что для того, чтобы повысить эффективность процедуры ЭКО, необходимо получить из яичников не одну, а несколько зрелых гамет, чтобы увеличить возможность выбора из них наиболее подходящих для оплодотворения in vitro. Действительно, введение в практику ВРТ методов гормональной стимуляции суперовуляции позволило существенным образом повысить эффективность процедуры ЭКО. В то же время репродуктологи столкнулись с обстоятельством, которое, как впоследствии оказалось, может негативно влиять на исход процедуры и значимость которого до настоящего времени четко не определена. Это - гетерогенность популяции ооцитов, полученных при извлечении их из яичников непосредственно перед овуляцией. С одной стороны, использование экзогенных гонадотропинов увеличило шанс на получение и отбор полноценных гамет, с другой - стало очевидным, что чем более выражена эта гетерогенность (по морфологическим признакам, по способности ооцитов к оплодотворению и способности оплодотворенных яйцеклеток к развитию эмбрионов до стадии бластоциста, наконец, по наличию в них явных или скрытых генетических нарушений), тем больше возникает сомнений в успехе операции. Это обстоятельство становится особенно очевидным при «бедном» ответе яичников на гормональную стимуляцию, когда резко снижаются возможность выбора качественных гамет и соответственно частота наступления беременности.
Давно в эксперименте было показано [3], что стимулировать овуляцию удается при введении гонадотропных гормонов на любой стадии эстрального (менструального) цикла. Максимальное количество гамет у грызунов удается получить при введении экзогенных гонадотропинов на стадиях диэструса и эструса, т.е. в период выбора доминантных фолликулов и рецептивной готовности их к овуляции. Однако количество формирующихся гамет при введении гонадотропинов на последующих стадиях цикла, с одной стороны, значительно снижается, с другой - среди овулировавших яйцеклеток увеличивается число «некачественных» гамет. Иными словами, у экспериментальных животных в зависимости от стадии эстрального цикла, на которой осуществлялось введение гонадотропинов, число гамет, не имеющих признаков морфологических и цитогенетических нарушений, существенно варьирует: оно колеблется от 45 (на стадии метэструса) до 70% (на стадии проэструса-эструса). Это обстоятельство, во-первых, отражает закономерности роста и элиминации фолликулов в течение репродуктивного цикла; во-вторых, свидетельствует о том, что при введении экзогенных гонадотропинов на любой стадии эстрального (и менструального) цикла в процесс овуляции могут быть вовлечены яйцеклетки из фолликулов, содержащих либо «поврежденные» (некачественные) ооциты, либо ооциты из фолликулов, находящихся на той или иной стадии атрезии.
Забегая вперед, следует отметить, что этот факт подтверждает молекулярно-генетическое изучение популяции преовуляторных ооцитов и эмбрионов ранних стадий развития, получаемых при проведении процедуры ЭКО. Недавно было обнаружено, что значительная часть из них несет различные генетические повреждения, которые могут явиться причиной нарушения развития плода, его гибели или какой-либо наследственной патологии. E. Vaneste и соавт. [27], например, показали, что на ранних стадиях эмбрионального развития человеческих зародышей лишь 9% эмбрионов имеют нормальный диплоидный набор хромосом во всех эмбрионах. По данным M. Wallace и соавт. [29], 84,9% перенесенных эмбрионов не формируют беременность. Даже, если принять во внимание, что на частоту наступления беременности большое влияние оказывают такие факторы, как сниженная рецептивность эндометрия, полипы в полости матки, лейомиомы, эндометриоз, гидросальпинкс, нарушение анатомической структуры матки и пр. [21], все перечисленные примеры патологии репродуктивной системы не умаляют значимости нарушений гаметогенеза, существенно влияющих на частоту успеха при использовании ВРТ для лечения женского бесплодия.
Таким образом, можно с большой долей уверенности предположить, что качественная гетерогенность популяции преовуляторных ооцитов, т.е. ооцитов, созревших в организме в процессе гаметогенеза, является облигатной его особенностью. Не исключено, что эта особенность присуща большинству видов млекопитающих и имеет филогенетическую природу.
До настоящего времени дискуссионными остаются вопросы, имеющие важное значение для клинической репродуктологии. Во-первых, в какой мере этиология и патогенез нарушений репродуктивной функции влияют на степень гетерогенности популяции ооцитов при ВРТ, и во-вторых, оказывает ли какое-либо неблагоприятное воздействие на них сама гормональная стимуляция?
Хотя в литературе существуют противоречивые данные о том, что гормональная стимуляция фолликулогенеза сопровождается увеличением числа «некачественных» ооцитов [6, 8, 24 и др.], ответить утвердительно на последний вопрос не представляется возможным, прежде всего потому, что при любой схеме гормональной стимуляции фолликулогенеза остается шанс получить качественные гаметы, гарантирующие наступление беременности после оплодотворения их in vitro. Причем количество таких гамет у женщин, участвующих в программах ВРТ, может варьировать в зависимости от патогенетических особенностей нарушения репродуктивной функции и эффективности корректирующей терапии этих нарушений [4, 5, 31]. E. Vaneste и соавт. [27] вообще считают, что культивирование эмбрионов и гормональная стимуляция суперовуляции на частоту хромосомных перестроек не влияют. Ситуация осложняется еще и тем, что механизмы неблагоприятного влияния (непосредственного или опосредованного) гонадотропинов и их аналогов, если они все-таки существуют, на процесс роста и созревания фолликулов и соответственно на качество формирующихся гамет нельзя считать досконально изученными.
Сегодня нет необходимости доказывать, что закономерности роста и созревания гамет в яичниках есть результат четкого взаимодействия центральных и периферических факторов регуляции функции репродуктивной системы, среди которых одной из ключевых является гипоталамо-гипофизарная система. Молекулярные основы сложного взаимодействия различных тканевых систем яичника на внутриорганном уровне и значение в этом взаимодействии центральных механизмов регуляции фолликуло- и гаметогенеза подробно изложены в обзоре К.Ю. Боярского [2].
Универсальность симптомов нарушения репродуктивной функции, как правило, проявляется прежде всего нарушением физиологических параметров менструального цикла, что само по себе является отражением изменения характера (динамики) роста фолликулов в яичниках. Широкое использование в клинической практике агонистов и антагонистов рилизинг-гормонов гипоталамуса, а также самих экзогенных гонадотропных гормонов в различных режимах их введения косвенно подтверждают полученные в эксперименте данные о том, что попытка модифицировать активность гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы на различных стадиях менструального цикла (например, использование агонистов и антагонистов ГнРГ в длинном и коротком протоколах стимуляции суперовуляции), влияя на динамику роста фолликулов, может сопровождаться увеличением степени гетерогенности популяции преовуляторых ооцитов, что может повлиять на характер их оплодотворяемости и, в конечном итоге, на частоту наступления беременности в процедурах ЭКО [17].
При всем многообразии патологических проявлений нарушения репродуктивной функции нарушение динамики роста фолликулов представляется одним из важнейших моментов, определяющих характер этих проявлений. Например, если снижение фертильности женщины при умеренной гиперпролактинемии при сохранении регулярного ритма менструаций, вероятнее всего, связано с метаболическими нарушениями в системе кумулюс-ооцитарного комплекса [11] и, похоже, в ряде случаев не влияет на динамику фолликулярного роста и не препятствует овуляции и формированию желтого тела, то, напротив, хорошо известно, что одним из ведущих патогномоничных признаков снижения фертильности женщин, страдающих воспалительными заболеваниями внутренних половых органов, является снижение чувствительности органов-мишеней (их рецептивности) к гонадотропным гормонам, что, как правило, обусловливает необходимость проведения более интенсивной стимуляции суперовуляции в процедурах ВРТ. При этом считается, что если при разнообразных формах нарушения репродуктивной функции скорость вступления фолликулов в первую фазу роста (гормоно-независимую) не претерпевает существенных изменений, то интенсивность роста и атрезии полостных фолликулов, как преполостных, так и полостных, заметно изменяется. Так, на фоне дефицита гонадотропной поддержки у женщин с хроническим воспалением придатков рост полостных фолликулов замедляется и сопровождается элиминацией их на более ранних стадиях развития. В то же время в силу особенностей гормональных нарушений у пациенток, у которых имеют место классические признаки синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) - андрогенемия, изменение соотношения ФСГ и ЛГ в сторону увеличения в крови уровня ЛГ, относительная гиперэстрогения, инсулинорезистентность, нарушение углеводного и жирового обмена, и т.д., - особенно ярко проявляется процесс персистенции полостных фолликулов на стадии крупных и средних полостных. Обнаружено, что указанные нарушения динамики фолликулогенеза сопровождаются изменением экспрессивной активности генома гранулезных клеток, а также изменением ряда биохимических параметров фолликулярной жидкости, играющих существенную роль в процессе роста и созревания гамет [28]. В частности, данные, полученные G. Boutzios и соавт. [9], свидетельствуют о том, что у женщин с СПКЯ одной из причин нарушения репродуктивной функции может являться так называемый «оксидативный стресс», обусловленный повышением в фолликулярной жидкости уровня оксидантов. У женщин старшего репродуктивного возраста, например, повышение их уровня в яичниках коррелирует с интенсивностью апоптоза в гранулезных клетках [19, 20, 22, 23], что в свою очередь обусловливает нарушение межклеточных взаимоотношений в ооцит-фолликулярном комплексе, которое может оказать существенное влияние на «качество» ооцитов и эмбрионов. Приведенные примеры позволяют предположить, что патогенетические особенности нарушения репродуктивной функции могут оказывать существенное влияние на степень гетерогенности популяции преовуляторных ооцитов, извлекаемых из яичников после гормональной стимуляции суперовуляции в процедурах ВРТ. В частности, об этом свидетельствуют данные, недавно полученные группой авторов [5], изучавших морфологические особенности гамет, частоту их оплодотворения и характер раннего эмбрионального развития у женщин с СПКЯ по сравнению с контрольной группой после гормональной стимуляции суперовуляции.
В настоящее время с развитием молекулярно-генетических возможностей для изучения гамет и эмбрионов удается не только охарактеризовать морфофункциональную и морфогенетическую неоднородность гамет, полученных для оплодотворения in vitro, но и провести анализ генома на самых ранних этапах развития зародыша, вплоть до микроделеций и точковых мутаций, включая полиморфизмы [8, 26, 30 и др.]. Казалось бы, в настоящее время с помощью методов чипирования, секвенирования генома и геномной гибридизации возникла возможность осуществлять строгий отбор для переноса «качественного» эмбриона в программах ВРТ [14]. Но решает ли это проблему выбора «качественных» гамет и эмбрионов с целью оздоровления человеческой популяции в целом?
Дело в том, что сегодня идет оживленная дискуссия относительно того, можно ли (следует ли) целиком полагаться при выборе наиболее подходящего для переноса зародыша на метод изучения эмбрионов путем полного скрининга его генома. Если подходить к этому предельно легитимно, репродуктологи и генетики должны предоставить возможность самим родителям не только знать о перспективах развития своих потомков, но и сделать свой выбор. С одной стороны, во многих случаях не всегда удается, однако, четко представить себе последствия геномных событий. Например, патогенетическое и предикативное значение полиморфизмов в настоящее время не имеет четкого определения. С другой стороны, имея в виду, что выбор полноценного эмбриона (не несущего каких-либо генетических изменений), как показывают цитогенетические и молекулярно-генетические исследования последних лет, весьма ограничен, возникают опасения, что, во-первых, родители рискуют остаться бездетными, а во-вторых, могут возникнуть некоторые этические проблемы у самих детей, появившихся на свет с помощью ВРТ [31]. Перед репродуктологами, таким образом, стоит дилемма, ограничиться ли в процессе выбора «качественного» эмбриона преимплантационной генетической диагностикой или в любом случае осуществлять полный геномный скрининг. Все вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что для проведения последнего, вероятно, необходимо определить показания. И, в частности, не может ли одним из этих показаний явиться степень гетерогенности популяции преовуляторных ооцитов, выраженная соотношением нормальных и «некачественных» ооцитов и эмбрионов (по различным морфологическим и физиологическим критериям) среди культивируемых зародышей 1-3-4-го дня развития. Чтобы в этом убедиться, необходимы дополнительные исследования.