Значение полиморфизма гена N-ацетилтрансферазы-2 у пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза

Бесплодие является глобальной проблемой в настоящее время и, по данным ВОЗ, занимает 5-е место среди серьезных заболеваний у населения в возрасте до 60 лет после алкоголизма, депрессии, травм и нарушения зрения. Холодный климат в большей части Российской Федерации, ранний половой дебют, высокая частота инфекций, передаваемых половым путем, низкая частота использования контрацептивных препаратов и, как следствие, самый высокий уровень абортов в Европе резко снижают репродуктивный потенциал в России до критических цифр. Частота гинекологической заболеваемости в настоящее время, к сожалению, не имеет тенденции к снижению, а частота бесплодных браков в России составляет более 15%. По данным ВОЗ от 2011 г., суммарный показатель фертильности в последние годы приближается к критическому показателю 1,3 (Мировая статистика здравоохранения, ВОЗ, 2011).

Несмотря на то что в 30-40% случаев эндометриоз сочетается с бесплодием, до настоящего времени все еще нет четкого представления о патогенезе и механизмах влияния этого заболевания на фертильность. В последние годы роль воспаления, ангио­генеза и оксидативного стресса при эндометриозе фундаментально изучается отечественными исследователями [1].

Известно, что степень выраженности эндометриоза влияет на рост фолликулов и ооцитов, качество эмбрионов и наступление беременности при ВРТ [2]. При наличии эндометриоза III-IV стадии по классификации American Fertility Society значительно снижает овариальный резерв [3]. В зарубежных исследованиях подтверждены факты наличия полиморфизма генов при эндометриозе [4], поликистозе яичников, миоме матки, раке яичников и раке шейки матки, преждевременном истощении яичников, привычном невынашивании и преэклампсии [5, 6]. Существенным фактом, показывающим специ­фический полиморфизм при эндометриозе с позиций доказательной медицины, являются нарушения в системе генов второй фазы детоксикации [7].

По данным литературы [8], наличие определенных генов системы N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2) ассоциировано с распространенными стадиями эндометриоза и экстрагенитальным эндометриозом. Однако исследований, посвященных изучению взаимосвязи наличия полиморфных генов NAT2 при эндометриозе и бесплодии, не представлено. Цель настоящего исследования - улучшение диагностики причин бесплодия при перитонеальной форме эндометриоза.

В исследование включены 90 пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза, верифицированного при лапароскопии. Лапароскопия проводилась на клинической базе кафедры акушерства, гинекологии и репродуктивной медицины ФПК МР РУДН, в отделении реконструктивно-пластической и экстренной гинекологии Городской клинической больницы №79 (Москва).

Критерии включения в исследование:

- пациентки с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза, верифицированного при лапароскопии;

- возраст 20-43 года.

Критерии исключения:

- пациентки с миомой матки, опухолями яичников;

- больные с пороками развития женских половых органов;

- мужской фактор бесплодия.

В ходе исследования все пациентки были разделены на две группы в зависимости от эффективности лечения: 1-я группа - 34 (37,8%) пациентки, забеременевшие самостоятельно в течение 2-24 мес после оперативного вмешательства; 2-я группа - 56 (62,2%) пациенток, незабеременевших в течение того же периода. После оценки отдаленных результатов лечения (наступление маточной беременности в течение 1-2 лет) был проведен сравнительный анализ результатов исследования полиморфизма гена NAT2 у забеременевших и незабеременевших женщин.

Лапароскопия проводилась в стандартных условиях с использованием оборудования фирмы «Karl Storz» по традиционной методике. Оперативные вмешательства осуществлялись под эндотрахеальным наркозом. Все пациентки прошли стандартное предоперационное обследование. Противопоказаний к оперативному лечению выявлено не было. Во время оперативного вмешательства проводилось иссечение или коагуляция очагов эндометриоза с использованием различных видов энергий (биполярная, аргоноплазменная, лазерная).

Генетическое исследование наличия полиморфизма генов NAT2 проводилось в лаборатории на базе ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Информированное согласие на использование крови для проведения исследований было получено у всех пациенток. Материалом для этого исследования служили образцы ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови пациенток. В качестве консерванта использовали 1 мл 0,5M ЭДТА, рН 8,0.

На первом этапе выполнялось выделение ДНК с помощью набора реактивов для выделения DLAtom DNA Prep100 по протоколу производителя. В пробирку объемом 1,5 мл вносили 200 мкл крови, добавляли 800 мкл лизирующего реагента и перемешивали содержимое пробирки, переворачивая (5-10 раз). Термостатировали пробирку со смесью 5-7 мин при 65 °C в течение 5 мин. Затем центрифугировали пробирку со смесью 10 с при 5000 g, после чего прозрачный супернатант переносили в чистую пробирку. В эту пробирку добавляли 30-40 мкл суспензии сорбента NucleoS. Пробирку помещали на ротатор и перемешивали 10 мин (10-20 об/мин) и снова центрифугировали 10 с при 5000 g. Не задевая осадок, удаляли супернатант. К осадку добавляли 400 мкл лизирующего реагента, тщательно перемешивали на вортексе до полного гомогенного состояния. Добавляли в пробирку 1 мл солевого буфера и далее содержимое пробирки переворачивали 5-10 раз. Центрифугировали в течение 10 с при 5000 g. Удаляли супернатант, не задевая осадок. Добавляли в пробирку 1 мл солевого буфера, перемешивали содержимое пробирки и еще раз центрифугировали в течение 10 с при 5000 g, после чего осторожно удаляли супернатант. Весь этот процесс повторялся 12 раз. На следующем этапе осадок высушивали при 65 °C в течение 4-5 мин. В эту же пробирку добавляли 100-200 мкл бидистиллированной воды или Extra Gene, суспендировали содержимое пробирки на вортексе 5-10 с до получения гомогенной суспензии, после чего термостатировали 4-5 мин при 65 °C. Еще раз суспендировали и центрифугировали 2 мин при 10 000 g. Супернатант с ДНК переносили в чистую пробирку и хранили при –20 °C. Далее проводили амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 25 мкл реакционной смеси.

Концентрация MgCl2 в 1х реакционном буфере и температура отжига подбирались индивидуально. ПЦР проводили на программируемом термоциклере МС2 производства фирмы «ДНК-технология» со следующими параметрами:

- первоначальная денатурация 95 °C - 5 мин;

28- 30 циклов 94 °С - 45 с,

t, °C - 45 c,

72 °C - 45 с,

финальная достройка 72 °С - 7 мин.

t, °C - температура отжига конкретных праймеров.

Последовательности праймеров, использованных в работе, выбирались на основе нуклеотидных последовательностей анализируемых фрагментов ДНК, имеющихся в базе данных GeneBank.

На втором этапе ДНК-диагностики после ПЦР проводился рестрикционный анализ. Рестрикция осуществлялась в отдельном помещении, где не проводилась ПЦР и выделение ДНК. В качестве материала для рестрикции использовался амплифицированный фрагмент ДНК и специфичный фермент - рестриктаза.

После центрифугирования на микроцентрифуге Vortex в течение 3-10 с 5-10 мкл амплификата отдельными наконечниками переносили из-под минерального масла в новые, заранее подписанные пробирки. Результаты амплификации оценивали с помощью вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромида этидия и регистрацией в УФ-излучении (длина волны 312 нм).

Для анализа электрофоретической подвижности амплификационных фрагментов использовали 7% гель с соотношением акриламид:бисакриламид 29:1. В качестве катализаторов полимеризации геля использовали персульфат аммония и TEMED. Электрофорез проводили в 1х буфере TBE (89 мM трис-борат, 89 мM борная кислота, 2 мM ЭДТА) при напряженности электрического поля 16 В/см при комнатной температуре.

Для визуального контроля образцы перед нанесением на гель смешивали с красителем (0,5% бромфеноловый синий и 0,5% ксилолцианол) в соотношении 5:1.

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы SPSS (версия 10.0.7) и Statistica (версия 6.0) for Windows. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

Возраст обследованных женщин варьировал от 23 до 39 лет (средний возраст 30,2±0,4 года). Все пациентки обратились в клинику с жалобами на бесплодие, из них 59 (65,5%) больных - с первичным бесплодием, 31 (34,5%) - с вторичным. Средняя длительность бесплодия у пациенток с первичным бесплодием составила 3,6±0,7 года, с вторичным - 3,2±1,3 года и достоверно не различалась в обеих группах. Анализ репродуктивного анамнеза показал, что в 1-ю группу были включены 9 (26,5%) пациенток с первичным бесплодием и 25 (73,5%) с вторичным, во 2-ю группу - соответственно 34 (64,3%) и 22 (35,7%).

Частота исходов беременности до наступления вторичного бесплодия у пациенток обеих групп была представлена следующим образом: роды - 4 (8,5%) пациентки, медицинские аборты - 11 (23,4%), самопроизвольные выкидыши - 16 (34,0%), медицинский аборт и самопроизвольный выкидыш - 7 (14,9%), роды и самопроизвольный выкидыш - 7 (14,9%), роды и самопроизвольный выкидыш и медицинский аборт - 2 (4,3%).

Анализ гинекологического статуса показал, что при бимануальном обследовании у пациенток обеих групп размеры матки соответствовали нормальным, патологических изменений со стороны придатков матки не выявлено. При пальпации области крестцово-маточных связок и заднего свода влагалища у пациенток обнаружено их укорочение и уплотнение, а также выраженная болезненность при исследовании.

Все обследованные больные были правильного телосложения, физическое развитие соответствовало возрастной норме.

Как в 1-й, так и во 2-й группе у пациенток преобладали заболевания органов пищеварения (хронический гастрит, язвенная болезнь желудка или двенадцатиперстной кишки) в половине случаев. В 3 раза чаще у пациенток 2-й группы в анамнезе были указания на болезни органов дыхания, а также у этих пациенток отмечалось увеличение частоты гнойничковых поражений кожи и нейродермитов (в 2 раза по отношению к группе забеременевших женщин). Возможно, это связано с эндогенной интоксикацией, изменениями антиоксидантного статуса и в иммунной системе вследствие нарушения метаболизма ксенобиотиков [9, 10].

Семейный анамнез отягощен у 12 (35,3%) больных 1-й группы и 41 (73,2%) 2-й группы. Из них в 1-й группе: по онкологическим заболеваниям - у 2 (16,7%), по заболеваниям органов дыхания - у 3 (25,0%), по заболеваниям сердечно-сосудистой системы - у 6 (50,0%), по сахарному диабету - у 1 (8,3%), во 2-й группе - соответственно у 9 (21,9%), 21 (51,2%), 9 (21,9%), 3 (7,3%).

Таким образом, у пациенток 2-й группы в 1,5 раза чаще в анамнезе регистрировались онкологические заболевания и в 2 раза - заболевания органов дыхательной системы у ближайших родственников первой и второй линии родства, в 2 раза реже относительно 1-й группы встречались заболевания сердечно-сосудистой системы.

У 49 (87,5%) пациенток 2-й группы отмечен отягощенный аллергический анамнез: у 19 (38,7%) - на лекарственные препараты; у 16 (32,7%) - на бытовую химию; у 14 (28,6%) - на продукты питания. У пациенток 1-й группы аллергоанамнез также был отягощен в 11,8% случаев (4 пациентки).

Семейный гинекологический анамнез отягощен у 18 (52,9%) пациенток 1-й группы и у 43 (76,8%) 2-й группы. В том числе: у 10 (55,6%) и 29 (67,4%) пациенток - эндометриоз (аденомиоз, перитонеальный эндометриоз или эндометриоидные кисты яичников), у 6 (33,3%) и 9 (20,9%) - миома матки, у 2 (11,1%) и 5 (11,6%) - патология эндометрия. Таким образом, семейный гинекологический анамнез у забеременевших пациенток 1-й группы достоверно не отличался от такового у пациенток 2-й группы.

Достоверных различий по стадиям эндометриоза в обеих группах выявлено не было. В группе забеременевших I-II стадия эндометриоза встречалась у 52% обследованных, III-IV - у 48%; в группе незабеременевших - у 45 и 55% соответственно. Частота и распространенность спаечного процесса в малом тазу также не различались в обеих группах.

У 75,6% пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза, включенных в настоящее исследование, выявлены мутации в аллельных вариантах гена NAT2, что превышает среднестатистические показатели по генам с.341Т>C, c.481C>T, c.590G>A и c.803A>G в популяции. Мутации в аллельном варианте с.857G>A не выявлено (табл. 1).

Сравнение частоты встречаемости мутаций в аллелях с.341Т>C, c.481C>T, c.590G>A и c.803A>G в зависимости от стадии эндометриоза достоверных различий не выявило (табл. 2).

Анализ аллельного полиморфизма гена NAT2(табл. 5) показал, что в 1-й группе (забеременевшие) преобладают пациентки с гомозиготным вариантом по «диким» аллелям, т.е. не имеющие генных мутаций.

Частота гомозиготного варианта достоверно различалась только в аллельном варианте c.590G>A и составляла 12,5% в группе незабеременевших пациенток, тогда как у забеременевших этих мутаций выявлено не было (р<0,05).

По данным литературы [11, 12], у каждой четвертой женщины бесплодие сочетается с эндометриозом. Также отмечено, что у пациенток, получавших хирургическое лечение по поводу перитонеальной формы эндометриоза, наступление беременности происходит в 1,5 раза чаще, чем у пациенток после консервативного лечения [13]. В настоящем исследовании среди всех пациенток с перитонеальной формой эндометриоза и бесплодием у 68 (75,6%) был выявлен полиморфизм гена NAT2: у 15 (22,3%) - мутации в одном локусе; у 27 (39,7%) - в 2 локусах; у 26 (38,2%) - в 3 локусах и более. В доступной литературе исследования, посвященные изучению взаимо­связи количества мутаций в системе генов NAT2 и частоты наступления беременности при гинекологических заболеваниях, не представлены.

Показано, что аллельные варианты гена NAT2 характеризуются различной активностью фермента N-ацетилтрансферазы. В зависимости от этого носителей соответствующих аллельных вариантов разделяют на «быстрых», «промежуточных» и «медленных» ацетиляторов [14]. Мутации в исследуемых аллелях приводят к формированию «медленного фенотипа ацетилирования», что, согласно данным литературы [15], способствует снижению уровня фермента N-ацетилтрансферазы, замедляя превращение ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА. При подобных изменениях нарушается метаболизм ксенобиотиков, что повышает уровень эндогенной интоксикации. В литературе представлены данные о том, что изменения активности ферментов, метаболизирующих ксенобиотики, способствуют повышению риска онкологических заболеваний. Это связано с биоактивацией множества проканцерогенов и нарушением детоксикации внешних онкогенных веществ [16]. Примечательны также сведения о том, что при эндометриозе имеют место нарушения метаболизма эстрогенов в эндометрии вследствие дисбаланса I и II фаз детоксикации, приводящие к накоплению свободных радикалов и стимуляции пролиферации эктопического эндометрия [17]. Не исключено, что эти изменения, обусловленные генетическим полиморфизмом генов детоксикации, являются дополнительным маточным фактором бесплодия при эндометриозе. Взаимосвязь генетического полиморфизма и мужского бесплодия доказана, однако точные механизмы пока не изучены [18].

1. В результате исследования у 75,6% пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза выявлен аллельный полиморфизм гена NAT2, что почти в 1,5 раза выше среднестатистических показателей по России.

2. Достоверных различий у пациенток с полиморфизмом гена NAT2 в зависимости от стадии эндометриоза не выявлено, однако показана взаимо­связь частоты гомозиготных мутаций, количества комбинированных аллельных мутаций и стадии эндометриоза. При эндометриозе I-II стадии частота гетерозиготных мутаций в аллелях с.341Т>C, c.481C>T и c.803A>G достоверно выше, чем при его распространенных формах.

3. У забеременевших в результате лечения пациенток с перитонеальной формой эндометриоза частота встречаемости аллельного полиморфизма гена NAT2 (с.341Т>C, c.481C>T, c.590G>A и c.803A>G) в 3 раза ниже, чем у незабеременевших.

4. Особенности полиморфизма гена NAT2 («фенотипа ацетилирования») ассоциированы с эффективностью лечения бесплодия у пациенток с перитонеальной формой эндометриоза. Больные с гомозиготным вариантом по «дикому» аллелю могут быть отнесены к группе благоприятного прогноза.