Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Дубинская Е.Д.

кафедра акушерства, гинекологии и репродуктивной медицины ФПК Российского университета дружбы народов, Москва

Гаспаров А.С.

кафедра акушерства, гинекологии и репродуктивной медицины ФПК Российского университета дружбы народов, Москва

Федорова Т.А.

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова, Москва

Лаптева Н.В.

Кафедра акушерства, гинекологии и репродуктивной медицины ФПО Российского университета дружбы народов, Москва, Российская Федерация

Значение полиморфизма гена N-ацетилтрансферазы-2 у пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза

Авторы:

Дубинская Е.Д., Гаспаров А.С., Федорова Т.А., Лаптева Н.В.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы репродукции. 2014;(1): 41‑46

Прочитано: 1636 раз


Как цитировать:

Дубинская Е.Д., Гаспаров А.С., Федорова Т.А., Лаптева Н.В. Значение полиморфизма гена N-ацетилтрансферазы-2 у пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза. Проблемы репродукции. 2014;(1):41‑46.
Dubinskaia ED, Gasparov AS, Fedorova TA, Lapteva NV. The significance of gene polymorphism n-acetyltransferase-2 in patients with infertility and peritoneal endometriosis. Russian Journal of Human Reproduction. 2014;(1):41‑46. (In Russ.)

Бесплодие является глобальной проблемой в настоящее время и, по данным ВОЗ, занимает 5-е место среди серьезных заболеваний у населения в возрасте до 60 лет после алкоголизма, депрессии, травм и нарушения зрения. Холодный климат в большей части Российской Федерации, ранний половой дебют, высокая частота инфекций, передаваемых половым путем, низкая частота использования контрацептивных препаратов и, как следствие, самый высокий уровень абортов в Европе резко снижают репродуктивный потенциал в России до критических цифр. Частота гинекологической заболеваемости в настоящее время, к сожалению, не имеет тенденции к снижению, а частота бесплодных браков в России составляет более 15%. По данным ВОЗ от 2011 г., суммарный показатель фертильности в последние годы приближается к критическому показателю 1,3 (Мировая статистика здравоохранения, ВОЗ, 2011).

Несмотря на то что в 30-40% случаев эндометриоз сочетается с бесплодием, до настоящего времени все еще нет четкого представления о патогенезе и механизмах влияния этого заболевания на фертильность. В последние годы роль воспаления, ангио­генеза и оксидативного стресса при эндометриозе фундаментально изучается отечественными исследователями [1].

Известно, что степень выраженности эндометриоза влияет на рост фолликулов и ооцитов, качество эмбрионов и наступление беременности при ВРТ [2]. При наличии эндометриоза III-IV стадии по классификации American Fertility Society значительно снижает овариальный резерв [3]. В зарубежных исследованиях подтверждены факты наличия полиморфизма генов при эндометриозе [4], поликистозе яичников, миоме матки, раке яичников и раке шейки матки, преждевременном истощении яичников, привычном невынашивании и преэклампсии [5, 6]. Существенным фактом, показывающим специ­фический полиморфизм при эндометриозе с позиций доказательной медицины, являются нарушения в системе генов второй фазы детоксикации [7].

По данным литературы [8], наличие определенных генов системы N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2) ассоциировано с распространенными стадиями эндометриоза и экстрагенитальным эндометриозом. Однако исследований, посвященных изучению взаимосвязи наличия полиморфных генов NAT2 при эндометриозе и бесплодии, не представлено. Цель настоящего исследования - улучшение диагностики причин бесплодия при перитонеальной форме эндометриоза.

Материал и методы

В исследование включены 90 пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза, верифицированного при лапароскопии. Лапароскопия проводилась на клинической базе кафедры акушерства, гинекологии и репродуктивной медицины ФПК МР РУДН, в отделении реконструктивно-пластической и экстренной гинекологии Городской клинической больницы №79 (Москва).

Критерии включения в исследование:

- пациентки с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза, верифицированного при лапароскопии;

- возраст 20-43 года.

Критерии исключения:

- пациентки с миомой матки, опухолями яичников;

- больные с пороками развития женских половых органов;

- мужской фактор бесплодия.

В ходе исследования все пациентки были разделены на две группы в зависимости от эффективности лечения: 1-я группа - 34 (37,8%) пациентки, забеременевшие самостоятельно в течение 2-24 мес после оперативного вмешательства; 2-я группа - 56 (62,2%) пациенток, незабеременевших в течение того же периода. После оценки отдаленных результатов лечения (наступление маточной беременности в течение 1-2 лет) был проведен сравнительный анализ результатов исследования полиморфизма гена NAT2 у забеременевших и незабеременевших женщин.

Лапароскопия проводилась в стандартных условиях с использованием оборудования фирмы «Karl Storz» по традиционной методике. Оперативные вмешательства осуществлялись под эндотрахеальным наркозом. Все пациентки прошли стандартное предоперационное обследование. Противопоказаний к оперативному лечению выявлено не было. Во время оперативного вмешательства проводилось иссечение или коагуляция очагов эндометриоза с использованием различных видов энергий (биполярная, аргоноплазменная, лазерная).

Генетическое исследование наличия полиморфизма генов NAT2 проводилось в лаборатории на базе ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Информированное согласие на использование крови для проведения исследований было получено у всех пациенток. Материалом для этого исследования служили образцы ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови пациенток. В качестве консерванта использовали 1 мл 0,5M ЭДТА, рН 8,0.

На первом этапе выполнялось выделение ДНК с помощью набора реактивов для выделения DLAtom DNA Prep100 по протоколу производителя. В пробирку объемом 1,5 мл вносили 200 мкл крови, добавляли 800 мкл лизирующего реагента и перемешивали содержимое пробирки, переворачивая (5-10 раз). Термостатировали пробирку со смесью 5-7 мин при 65 °C в течение 5 мин. Затем центрифугировали пробирку со смесью 10 с при 5000 g, после чего прозрачный супернатант переносили в чистую пробирку. В эту пробирку добавляли 30-40 мкл суспензии сорбента NucleoS. Пробирку помещали на ротатор и перемешивали 10 мин (10-20 об/мин) и снова центрифугировали 10 с при 5000 g. Не задевая осадок, удаляли супернатант. К осадку добавляли 400 мкл лизирующего реагента, тщательно перемешивали на вортексе до полного гомогенного состояния. Добавляли в пробирку 1 мл солевого буфера и далее содержимое пробирки переворачивали 5-10 раз. Центрифугировали в течение 10 с при 5000 g. Удаляли супернатант, не задевая осадок. Добавляли в пробирку 1 мл солевого буфера, перемешивали содержимое пробирки и еще раз центрифугировали в течение 10 с при 5000 g, после чего осторожно удаляли супернатант. Весь этот процесс повторялся 12 раз. На следующем этапе осадок высушивали при 65 °C в течение 4-5 мин. В эту же пробирку добавляли 100-200 мкл бидистиллированной воды или Extra Gene, суспендировали содержимое пробирки на вортексе 5-10 с до получения гомогенной суспензии, после чего термостатировали 4-5 мин при 65 °C. Еще раз суспендировали и центрифугировали 2 мин при 10 000 g. Супернатант с ДНК переносили в чистую пробирку и хранили при –20 °C. Далее проводили амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 25 мкл реакционной смеси.

Концентрация MgCl2 в 1х реакционном буфере и температура отжига подбирались индивидуально. ПЦР проводили на программируемом термоциклере МС2 производства фирмы «ДНК-технология» со следующими параметрами:

- первоначальная денатурация 95 °C - 5 мин;

28- 30 циклов 94 °С - 45 с,

t, °C - 45 c,

72 °C - 45 с,

финальная достройка 72 °С - 7 мин.

t, °C - температура отжига конкретных праймеров.

Последовательности праймеров, использованных в работе, выбирались на основе нуклеотидных последовательностей анализируемых фрагментов ДНК, имеющихся в базе данных GeneBank.

На втором этапе ДНК-диагностики после ПЦР проводился рестрикционный анализ. Рестрикция осуществлялась в отдельном помещении, где не проводилась ПЦР и выделение ДНК. В качестве материала для рестрикции использовался амплифицированный фрагмент ДНК и специфичный фермент - рестриктаза.

После центрифугирования на микроцентрифуге Vortex в течение 3-10 с 5-10 мкл амплификата отдельными наконечниками переносили из-под минерального масла в новые, заранее подписанные пробирки. Результаты амплификации оценивали с помощью вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромида этидия и регистрацией в УФ-излучении (длина волны 312 нм).

Для анализа электрофоретической подвижности амплификационных фрагментов использовали 7% гель с соотношением акриламид:бисакриламид 29:1. В качестве катализаторов полимеризации геля использовали персульфат аммония и TEMED. Электрофорез проводили в 1х буфере TBE (89 мM трис-борат, 89 мM борная кислота, 2 мM ЭДТА) при напряженности электрического поля 16 В/см при комнатной температуре.

Для визуального контроля образцы перед нанесением на гель смешивали с красителем (0,5% бромфеноловый синий и 0,5% ксилолцианол) в соотношении 5:1.

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы SPSS (версия 10.0.7) и Statistica (версия 6.0) for Windows. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Клиническая характеристика больных

Возраст обследованных женщин варьировал от 23 до 39 лет (средний возраст 30,2±0,4 года). Все пациентки обратились в клинику с жалобами на бесплодие, из них 59 (65,5%) больных - с первичным бесплодием, 31 (34,5%) - с вторичным. Средняя длительность бесплодия у пациенток с первичным бесплодием составила 3,6±0,7 года, с вторичным - 3,2±1,3 года и достоверно не различалась в обеих группах. Анализ репродуктивного анамнеза показал, что в 1-ю группу были включены 9 (26,5%) пациенток с первичным бесплодием и 25 (73,5%) с вторичным, во 2-ю группу - соответственно 34 (64,3%) и 22 (35,7%).

Частота исходов беременности до наступления вторичного бесплодия у пациенток обеих групп была представлена следующим образом: роды - 4 (8,5%) пациентки, медицинские аборты - 11 (23,4%), самопроизвольные выкидыши - 16 (34,0%), медицинский аборт и самопроизвольный выкидыш - 7 (14,9%), роды и самопроизвольный выкидыш - 7 (14,9%), роды и самопроизвольный выкидыш и медицинский аборт - 2 (4,3%).

Анализ гинекологического статуса показал, что при бимануальном обследовании у пациенток обеих групп размеры матки соответствовали нормальным, патологических изменений со стороны придатков матки не выявлено. При пальпации области крестцово-маточных связок и заднего свода влагалища у пациенток обнаружено их укорочение и уплотнение, а также выраженная болезненность при исследовании.

Все обследованные больные были правильного телосложения, физическое развитие соответствовало возрастной норме.

Как в 1-й, так и во 2-й группе у пациенток преобладали заболевания органов пищеварения (хронический гастрит, язвенная болезнь желудка или двенадцатиперстной кишки) в половине случаев. В 3 раза чаще у пациенток 2-й группы в анамнезе были указания на болезни органов дыхания, а также у этих пациенток отмечалось увеличение частоты гнойничковых поражений кожи и нейродермитов (в 2 раза по отношению к группе забеременевших женщин). Возможно, это связано с эндогенной интоксикацией, изменениями антиоксидантного статуса и в иммунной системе вследствие нарушения метаболизма ксенобиотиков [9, 10].

Семейный анамнез отягощен у 12 (35,3%) больных 1-й группы и 41 (73,2%) 2-й группы. Из них в 1-й группе: по онкологическим заболеваниям - у 2 (16,7%), по заболеваниям органов дыхания - у 3 (25,0%), по заболеваниям сердечно-сосудистой системы - у 6 (50,0%), по сахарному диабету - у 1 (8,3%), во 2-й группе - соответственно у 9 (21,9%), 21 (51,2%), 9 (21,9%), 3 (7,3%).

Таким образом, у пациенток 2-й группы в 1,5 раза чаще в анамнезе регистрировались онкологические заболевания и в 2 раза - заболевания органов дыхательной системы у ближайших родственников первой и второй линии родства, в 2 раза реже относительно 1-й группы встречались заболевания сердечно-сосудистой системы.

У 49 (87,5%) пациенток 2-й группы отмечен отягощенный аллергический анамнез: у 19 (38,7%) - на лекарственные препараты; у 16 (32,7%) - на бытовую химию; у 14 (28,6%) - на продукты питания. У пациенток 1-й группы аллергоанамнез также был отягощен в 11,8% случаев (4 пациентки).

Семейный гинекологический анамнез отягощен у 18 (52,9%) пациенток 1-й группы и у 43 (76,8%) 2-й группы. В том числе: у 10 (55,6%) и 29 (67,4%) пациенток - эндометриоз (аденомиоз, перитонеальный эндометриоз или эндометриоидные кисты яичников), у 6 (33,3%) и 9 (20,9%) - миома матки, у 2 (11,1%) и 5 (11,6%) - патология эндометрия. Таким образом, семейный гинекологический анамнез у забеременевших пациенток 1-й группы достоверно не отличался от такового у пациенток 2-й группы.

Достоверных различий по стадиям эндометриоза в обеих группах выявлено не было. В группе забеременевших I-II стадия эндометриоза встречалась у 52% обследованных, III-IV - у 48%; в группе незабеременевших - у 45 и 55% соответственно. Частота и распространенность спаечного процесса в малом тазу также не различались в обеих группах.

Особенности полиморфизма генов системы NAT2

У 75,6% пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза, включенных в настоящее исследование, выявлены мутации в аллельных вариантах гена NAT2, что превышает среднестатистические показатели по генам с.341Т>C, c.481C>T, c.590G>A и c.803A>G в популяции. Мутации в аллельном варианте с.857G>A не выявлено (табл. 1).

Сравнение частоты встречаемости мутаций в аллелях с.341Т>C, c.481C>T, c.590G>A и c.803A>G в зависимости от стадии эндометриоза достоверных различий не выявило (табл. 2).

Следует отметить, что при эндометриозе I-II стадии частота встречаемости гетерозиготных мутаций в аллелях с.341Т>C, c.481C>T и c.803A>G достоверно выше, чем гомозиготных, тогда как при III-IV стадии она практически одинакова. При этом частота мутации по гомозиготному типу в аллельном варианте c.590G>A при III-IV стадии наоборот достоверно выше, чем по гетерозиготному. Оценка данных о гетеро- и гомозиготных мутациях в зависимости от стадии эндометриоза выявила достоверные различия (табл. 3).
При анализе сочетания мутантных аллелей обнаружено, что при III-IV стадии эндометриоза достоверно выше частота мутаций по 3 аллелям и более (табл. 4).

Анализ аллельного полиморфизма гена NAT2 (табл. 5) показал, что в 1-й группе (забеременевшие) преобладают пациентки с гомозиготным вариантом по «диким» аллелям, т.е. не имеющие генных мутаций.

В группе незабеременевших пациенток наличие гетерозиготного варианта аллелей с.341Т>C, c.481C>T, c.590G>A и c.803A>G составляет 73,2, 73,2, 5,4 и 62,5% соответственно (р<0,05).

Частота гомозиготного варианта достоверно различалась только в аллельном варианте c.590G>A и составляла 12,5% в группе незабеременевших пациенток, тогда как у забеременевших этих мутаций выявлено не было (р<0,05).

Обсуждение

По данным литературы [11, 12], у каждой четвертой женщины бесплодие сочетается с эндометриозом. Также отмечено, что у пациенток, получавших хирургическое лечение по поводу перитонеальной формы эндометриоза, наступление беременности происходит в 1,5 раза чаще, чем у пациенток после консервативного лечения [13]. В настоящем исследовании среди всех пациенток с перитонеальной формой эндометриоза и бесплодием у 68 (75,6%) был выявлен полиморфизм гена NAT2: у 15 (22,3%) - мутации в одном локусе; у 27 (39,7%) - в 2 локусах; у 26 (38,2%) - в 3 локусах и более. В доступной литературе исследования, посвященные изучению взаимо­связи количества мутаций в системе генов NAT2 и частоты наступления беременности при гинекологических заболеваниях, не представлены.

Показано, что аллельные варианты гена NAT2 характеризуются различной активностью фермента N-ацетилтрансферазы. В зависимости от этого носителей соответствующих аллельных вариантов разделяют на «быстрых», «промежуточных» и «медленных» ацетиляторов [14]. Мутации в исследуемых аллелях приводят к формированию «медленного фенотипа ацетилирования», что, согласно данным литературы [15], способствует снижению уровня фермента N-ацетилтрансферазы, замедляя превращение ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА. При подобных изменениях нарушается метаболизм ксенобиотиков, что повышает уровень эндогенной интоксикации. В литературе представлены данные о том, что изменения активности ферментов, метаболизирующих ксенобиотики, способствуют повышению риска онкологических заболеваний. Это связано с биоактивацией множества проканцерогенов и нарушением детоксикации внешних онкогенных веществ [16]. Примечательны также сведения о том, что при эндометриозе имеют место нарушения метаболизма эстрогенов в эндометрии вследствие дисбаланса I и II фаз детоксикации, приводящие к накоплению свободных радикалов и стимуляции пролиферации эктопического эндометрия [17]. Не исключено, что эти изменения, обусловленные генетическим полиморфизмом генов детоксикации, являются дополнительным маточным фактором бесплодия при эндометриозе. Взаимосвязь генетического полиморфизма и мужского бесплодия доказана, однако точные механизмы пока не изучены [18].

Выводы

1. В результате исследования у 75,6% пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза выявлен аллельный полиморфизм гена NAT2, что почти в 1,5 раза выше среднестатистических показателей по России.

2. Достоверных различий у пациенток с полиморфизмом гена NAT2 в зависимости от стадии эндометриоза не выявлено, однако показана взаимо­связь частоты гомозиготных мутаций, количества комбинированных аллельных мутаций и стадии эндометриоза. При эндометриозе I-II стадии частота гетерозиготных мутаций в аллелях с.341Т>C, c.481C>T и c.803A>G достоверно выше, чем при его распространенных формах.

3. У забеременевших в результате лечения пациенток с перитонеальной формой эндометриоза частота встречаемости аллельного полиморфизма гена NAT2 (с.341Т>C, c.481C>T, c.590G>A и c.803A>G) в 3 раза ниже, чем у незабеременевших.

4. Особенности полиморфизма гена NAT2 («фенотипа ацетилирования») ассоциированы с эффективностью лечения бесплодия у пациенток с перитонеальной формой эндометриоза. Больные с гомозиготным вариантом по «дикому» аллелю могут быть отнесены к группе благоприятного прогноза.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.