Экспрессия белков, контролирующих апоптоз, у больных раком предстательной железы

Проблема рака предстательной железы (РПЖ) на сегодняшний день особо актуальна вследствие неуклонного роста заболеваемости и смертности, а также в связи с трудностями ранней диагностики. РПЖ является одним из самых распространенных злокачественных новообразований у мужчин [1—4]. Основная масса пациентов, которые попадают в клинику, имеют запущенные стадии РПЖ, что не позволяет полностью избавить их от этого заболевания. Болезнь практически не возникает раньше 40 лет и становится все более частым явлением с каждым последующим десятилетием жизни [5, 6].

Гетерогенная природа РПЖ делает его трудным для оценки объема поражения. Высокодифференцированный рак, диагностируемый в конце жизни, может не повлиять на качество и продолжительность жизни. Развитие низкодифференцированных опухолей в более молодом возрасте может привести к смерти в течение нескольких лет. В идеале, скрининг РПЖ должен выявлять не столько пациентов с РПЖ, сколько больных с агрессивной разновидностью этого заболевания. Надежды сократить число смертей от РПЖ основаны на двух тактиках — ранней диагностике и эффективном лечении болезни в ее начальной стадии [7, 8].

В настоящее время главным скрининговым методом для диагностики РПЖ является определение в сыворотке крови уровня простатспецифического антигена (ПСА) [9, 10]. В клинической практике широко используется определение концентрации свободного и общего ПСА в крови и их соотношения. Считается, что увеличение концентрации общего ПСА в крови более 4 нг/мл (а у пациентов моложе 60 лет более 3 нг/мл) является неблагоприятным фактором [7].

Однако ПСА является белком, вырабатываемым в нормальной предстательной железе, поэтому он не является специфичным по отношению к заболеванию. Иными словами, повышение уровня ПСА может быть обусловлено рядом причин, среди которых наиболее значимыми являются: РПЖ, доброкачественная гиперплазия предстательной железы, наличие воспаления или инфекции в предстательной железе, ишемия или инфаркт предстательной железы [11]. Таким образом, повышение уровня ПСА в крови не всегда свидетельствует о наличии злокачественного процесса и определение ПСА не имеет достаточной специфичности и чувствительности для предсказания клинической и патологической стадии процесса [7, 11].

Прогностические модели, основанные на предварительном определении ПСА, не доказали свою эффективность для прогнозирования долгосрочного выживания, как оценка по шкале Глисона [12—15].

Неспособность дискриминировать агрессивные разновидности РПЖ от его индолентных, потенциально безопасных форм является главной проблемой простатологии. Поиск дополнительных критериев, отражающих агрессивность опухоли, ее биологические особенности по-прежнему актуален. В настоящее время поиск факторов прогноза сосредоточен на клеточном и субклеточном (молекулярном) уровне. Возможно, стремительный прогресс молекулярных методов анализа биологического материала поможет улучшить чувствительность и специфичность выявления прогностически неблагоприятных вариантов новообразований предстательной железы [16—18].

В последние годы сложилось стойкое мнение о том, что некоторые биологические характеристики опухоли, например экспрессия некоторых онкогенов и антионкогенов и кодируемых ими белков, несут в себе наравне с классическими клиническими и морфологическими признаками важную дополнительную прогностическую информацию об агрессивности опухолевого процесса. Ряд авторов [19—23] для оценки злокачественного потенциала новообразований подчеркивают значимость исследования экспрессии маркеров апоптоза, таких как bcl-2, bax, p53, Fas (CD95) и др. Из этого числа исследуют отдельные показатели, некоторые их сочетания или весь комплекс. Так, равновесие между антиапоптотическим белком bcl-2 и проапоптотическим белком bax (индуктором апоптоза) определяет «судьбу» клетки. Особое место принадлежит белку p53, изменения в котором, как предполагают, запускает развитие опухоли. A. Stapleton и соавт. [24] показали, что в дополнение к общеклиническим данным (размер опухоли, клиническая стадия, концентрация ПСА в сыворотке крови) независимое прогностическое значение при РПЖ имеет не величина митотического индекса, а показатель апоптического индекса и экспрессия в ткани опухоли мутантной формы белка p53. В многомерном анализе, проведенном M. Kuczyk и соавт. [20], гиперэкспрессия р53 была определена как прогностический параметр для безрецидивной выживаемости (p=0,005). Для подтверждения независимого прогностического потенциала р53 у больных с локализованным РПЖ рекомендуются дальнейшие исследования. D. Scherr и соавт. [21] оценили значение двух ключевых регуляторов апоптоза, bcl-2 и р53, по иммуногистохимической реакции биоптатов от 54 пациентов, при локализованном РПЖ. Авторы обнаружили, что биопсия с положительными bcl-2 и р53 была связана с высокими баллами по шкале Глисона. Определение экспрессии bcl-2 и р53 может быть полезным для прогнозирования устойчивости опухоли к лечению.

Цель нашего исследования — определение взаимосвязи экспрессии маркеров апоптоза — белков p53, bcl-2, bax и CD95 и характера экспрессии этих белков в ткани опухоли предстательной железы у мужчин на разных стадиях онкогенеза.

Исследованы 44 образца ткани РПЖ мужчин в возрасте 61—86 лет. Изучаемый материал — гистологические образцы получали с помощью биопсии предстательной железы, после трансвезикальной простатэктомии или посредством трансуретральной резекции предстательной железы. В дальнейшем из этого материала готовили парафиновые срезы толщиной 3—5 мкм по стандартной методике, депарафинировали в ксилоле и регидратировали в батарее спиртов, которые использовали для определения экспрессии внутриклеточных биомаркеров p53, bcl-2, bax и поверхностного маркера CD95 иммуногистохимическими методами. Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартной методике. Для открытия антигенных детерминант обрабатывали срезы в цитратном буфере рН 6,0 в течение 30 мин при 95 °С на водяной бане. Для определения белка р53 были использованы тест-системы фирмы «Bender MedSystems» (Австрия). В качестве первичных антител к CD95 использовали мышиные антитела к CD95 человека («Биохиммак»), при оценке экспрессии bax использовали кроличьи поликлональные антитела к bax (разведение 1:500, «DAKO Corp.»), а при оценке экспрессии bcl-2 — моноклональные антитела к bсl-2 (разведение 1:80, «DAKO Corp.»). Инкубацию с первичными антителами проводили в течение ночи при 4 °С. Для визуализации реакции антиген—антитело использовали стрептавидин-биотиновую тест-систему LSAB+kit «DAKO Corp.», согласно инструкции. В качестве хромогена использовали ДАБ+ «DAKO Corp.».

Реакцию оценивали с применением светового микроскопа (×40) по следующим критериям. Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. В качестве негативного контроля использовали иммуногистохимическую реакцию без добавления первичных антител.

Для оценки гистологического материала использовали шкалу Глисона (1974) с определением градации гистологического типа опухоли: у 8 человек выявлена аденокарцинома с суммарной оценкой по Глисону менее 4 баллов, у 23 — суммарная оценка степени злокачественности составляла 5—7 баллов, у 13 — 8—10 баллов.

Экспрессия онкомаркеров (CD95, p53, bcl-2, bax) различалась по интенсивности и локализации окрашивания. За положительную реакцию принимали окрашивание с интенсивностью ++/+++ более чем в 10% опухолевых клеток. Окрашивание со слабой интенсивностью и с несоответствующей локализацией относили к отрицательной реакции.

В ходе исследований установили, что наблюдается низкая экспрессия CD95. Этот маркер отсутствует в 32 (72,7%) из 44 случаев, а обнаружен лишь в 12 (27,3%). Экспрессию bax наблюдали в 19 (43,2%) случаях, bcl-2 — в 30 (68,2%). Положительную экспрессию p53 наблюдали в 31 (70,5%) случае.

При анализе экспрессии биомарекеров, контролирующих апоптоз, с учетом гистологической градации в зависимости от степени дифференцирования опухоли (злокачественности) установлена тенденция уменьшения экспрессии bax в зависимости от степени дифференцировки. У пациентов с суммой баллов по шкале Глисона 8—10 экспрессия bax была ниже по сравнению с пациентами, имеющими более дифференцированные формы опухоли. Так, у пациентов с суммой баллов по шкале Глисона 8—10 экспрессия отмечена в 2 (15,4%) из 13 случаев, что достоверно ниже по сравнению с экспрессией в опухолях с суммой баллов по Глисону 5—7 (в 10 (43,5%) из 23 случаев) и суммой баллов 2—4 (в 5 (62,5%) из 8 случаев). Высокая сумма Глисона отражает не только нарастание атипических свойств, но и степень распространенности опухолевого процесса вплоть до прорастания капсулы с инвазией в соседние органы и массивного метастазирования.

В зависимости от распространенности опухоли наблюдали достоверное различие в экспрессии CD95 и bax. Причем с увеличением распространенности заболевания экспрессия bax снижалась, а для экспрессии CD95 какой-либо закономерности распределения не наблюдали.

Отмечена общая тенденция к увеличению экспрессии p53 по мере нарастания степени злокачественности опухоли: в опухолях с суммой баллов по Глисону 2—4 в 5 (62,5%) из 8 случаев отмечалась выраженная положительная реакция, а с суммой баллов 8—10 — в 11 (84,6%) из 13 случаев.

Необходимо также отметить, что при определении концентрации свободного и общего ПСА в крови у 5 (11,4%) из 44 больных были получены значения, которые не превышали 4 нг/мл, хотя имелись другие клинические признаки ракового процесса. Вероятно, у таких больных в клетках опухоли нарушаются процессы синтеза ПСА, и в этих случаях диагноз ставится по клиническим данным и результатам биопсии предстательной железы. Среди этих больных РПЖ по результатам биопсии сумма баллов по Глисону составляла в среднем 6. Нами обнаружена положительная экспрессия p53 во всех 5 образцах ткани опухоли предстательной железы этих больных.

Нарушение экспрессии онкогенов оказывает существенное влияние на нормальное развитие организма и его гомеостаз, а также вовлечено в различные патологические процессы, включая рак. Поэтому в настоящее время все больше работ посвящено детальному изучению их функционирования и экспрессии соответствующих белков.

При иммуногистохимическом определении белков, контролирующих апоптоз, в ткани предстательной железы нами выявлена гетерогенность их экспрессии и тенденция к изменению экспрессии некоторых из них, в зависимости от степени выраженности диспластических изменений.

Белок bcl-2 подавляет апоптоз в клетках и его соотношение с проапоптотическим гомологом bax является важной определяющей клеточной чувствительности к индукции апоптоза [25]. По данным литературы [26], высокая экспрессия bcl-2 ассоциируется с низким уровнем апоптоза. Представленные данные свидетельствуют о высокой продукции ингибитора апоптоза bcl-2, интенсивности экспрессии p53 и сниженной экспрессии bax и CD95 в ткани опухоли предстательной железы, что позволяет предположить участие этих белков в клиническом течении и прогнозе РПЖ. Полученные нами результаты свидетельствуют, что экспрессия p53 нарастает в зависимости от степени злокачественности опухоли, а экспрессия bax, а также CD95 на клетках опухоли снижена. Низкий уровень экспрессии CD95 рассматривается как дополнительное звено механизма ухода опухолевых клеток из-под иммунного надзора, следствием чего является бесконтрольная пролиферация опухолевых клеток и проявление несостоятельности противоопухолевого иммунитета. По результатам исследования можно сделать вывод, что увеличение экспрессии p53, снижение экспрессии bax и CD95 являются показателями агрессивности опухолевого процесса. Опухолям предстательной железы с такими параметрами необходимо уделять более пристальное внимание. Комбинация с другими показателями, такими как определение ПСА в крови, шкала Глисона, данные пальцевого ректального исследования, улучшит прогностическую информацию и позволит наиболее точно установить клиническую стадию РПЖ.