Результаты исследования ассоциации полиморфного локуса rs11212617 гена ATM с ответом на терапию метформином у больных сахарным диабетом 2-го типа

В настоящее время препаратом первой линии в лечении сахарного диабета 2-го типа (СД2) является метформин (МФ) [1, 2]. Известно, что у разных пациентов с СД2, эффективность терапии МФ может варьировать. Эта изменчивость может быть обусловлена психологическими, социальными факторами, нарушением всасывания препарата из желудочно-кишечного тракта, изменением метаболизма, распределения и экскреции, которые зависят от функции почек, активности ферментных систем, взаимодействия с другими лекарственными средствами, приводящими к изменению фармакокинетики и фармакодинамики М.Ф. Несмотря на клиническое применение МФ на протяжении более 50 лет, механизмы, лежащие в основе его терапевтических эффектов, изучены не полностью. После поступления в клетку МФ накапливается в митохондриальном матриксе. Ключевой мишенью МФ является комплекс I дыхательной цепи митохондрий, в результате ингибирования которого снижается продукция АТФ и повышается уровень АМФ и АДФ. Этот сдвиг энергетического метаболизма клетки детектируется главным энергетическим сенсором клеток АМФ-активируемой протеинкиназой (АМРК). МФ усиливает процессы фосфорилирования, что приводит к увеличению клеточной АМРК с последующим ингибированием протеинкиназы mTOR (мишень рапамицина у млекопитающих), влияющей на метаболизм и сигналинг ростовых факторов, процессы дифференцировки, старения, апоптоза и аутофагии [3, 4]. Активация АМPК снижает активность ферментов клеточного цикла, глюконеогенез и гликогенолиз, стимулирует анаэробный гликолиз, окисление жирных кислот в печени и кетогенез, подавляет липогенез, синтез холестерина и триглицеридов, подавляет липолиз и липогенез в адипоцитах, стимулирует окисление жирных кислот и захват глюкозы в скелетных мышцах через повышение биосинтеза переносчиков глюкозы GLUT-1 и GLUT-4, модулирует секрецию инсулина бета-клетками [5]. Предполагается, что снижение экспрессии и активности АМPК ассоциировано с ожирением, метаболическим синдромом, нарушением углеводного обмена, раком, ишемией миокарда [2, 5]. В последние годы активно изучаются генетические аспекты, влияющие на эффективность терапии М.Ф. Наибольший интерес представляет изучение влияния МФ на АМРК, которая является продуктом экспрессии гена атаксии-телеангиэктазии ATM[6]. По данным литературы [7], редкий аллель С полиморфного локуса rs11212617 гена ATM связан с хорошим ответом на МФ.

Цель — изучить ассоциацию полиморфного локуса rs11212617 гена ATM с ответом на терапию МФ у больных СД2 в Новосибирской области и провести метаанализ ранее опубликованных данных.

Материал и методы

Проведено одномоментное поперечное обследование 2000 больных СД2 (450 мужчин и 1550 женщин) на базе передвижного диабетологического центра (Диамобиль) в районах Новосибирской области.

Из 2000 обследованных была сформирована группа из 460 человек (97 мужчин и 363 женщины), получавших терапию МФ как в монотерапии, так и в сочетании с препаратами сульфонилмочевины (СМ). Критериями исключения являлись: СД1, другие типы сахарного диабета, инсулинотерапия при СД2, наличие онкологических заболеваний, сердечной недостаточности 3—4-й степени функционального класса NYHA, печеночная недостаточность (более 7 баллов по Чайлд—Пью), снижение СКФ менее 45 мл/мин ×1,73 м², лечение кортикостероидами или эстрогенами, алкоголизм, наркомания, деменция или серьезные психические расстройства.

В исследование включались только пациенты, подписавшие информированное согласие (с 2012 по 2015 г.).

Всем 460 больным провели полное клиническое обследование, определяли уровень гликированного гемоглобина (HbA_1c) иммуно-турбодиметрическим методом на анализаторе BIO-RAD D10 (США). Выделение ДНК и генотипирование полиморфного локуса rs11212617 гена ATM проводили в лаборатории Фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов. ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 65 мМ Tris-HCl (рН 8,9), 24 мМ сульфата аммония; 3,5 мМ MgCl₂; 0,05% Tween-20; 300 нМ каждого праймера; по 100 нМ TaqMan-зондов, конъюгированных с FAM или R6G; 200 мкМ dNTP, 20–100 нг ДНК и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы. Амплификация проводилась с помощью амплификатора CFX384 («Bio-Rad», США) в следующих условиях: начальная денатурация 3’ при 96 °C; затем 50 циклов, включающих денатурацию при 96 °C — 8 с, отжиг праймеров и последующую элонгацию при Тотж = 60 °C в течение 40 с (каждый шаг сопровождался регистрацией флюоресцентного сигнала в диапазонах, соответствующих интервалам флюоресценции флюорофоров FAM и R6G). Для определения генотипа полиморфного локуса rs11212617 использовали следующие олигонуклеотиды: прямой праймер 5’-GATCTACATATACCAATTACAAAGG-3’, обратный праймер 5’-GGATAA CATATAGTTGGGTCTTG-3’, зонд на аллель “A” 5’-FAM-CAGAGAATGTCAGAGCGG-BHQ-3’, зонд на аллель “C” 5’-R6G-CAGAGACTGTCAGA GCGG-BHQ-3’.

Оценку ассоциации полиморфного локуса rs11212617 гена ATM с ответом на терапию МФ у больных СД2 в Новосибирской области проводили по уровню HbA_1c. Пациенты, имевшие целевые параметры HbA_1c, в соответствии с алгоритмами оказания специализированной медицинской помощи больным CД (2015) составили группу с хорошим ответом на М.Ф. Пациенты, не достигшие целевых значений HbA_1c, составили группу с плохим ответом на МФ.

В зависимости от уровня HbA_1c пациенты были распределены на группы: больные, имеющие целевой HbA_1c на фоне терапии МФ (группа с хорошим ответом на МФ как в монотерапии, так и в комбинации с препаратами СМ), и группа пациентов, не достигших целевого уровня HbA_1cна максимальной дозе МФ.

Протокол исследования одобрен комитетом по этике Новосибирского государственного медицинского университета (протокол № 52 от 19.03.13). Перед включением в исследование все пациенты подписывали информированное согласие.

Использовали стандартный описательный и сравнительный анализ. При нормальном распределении данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения (SD), при асимметричном — в виде медианы (Ме) с 25-м и 75-м процентилями [25; 75]. Для сравнения частоты аллелей между группами использовали критерий χ². Для оценки межгрупповых различий проводился дисперсионный анализ (ANOVA) или ранговый анализ Краскела—Уоллиса в зависимости от типа распределения данных. Критический уровень значимости принимали равным 0,05. Соответствие равновесию Харди—Вайнберга оценивали с помощью точного теста Фишера. Для статистической обработки использованы пакет статистики Genetics программного обеспечения R-project (www.r-project.org) и программа Statistica 6.0. Метаанализ, оценка эффекта «архивного ящика» (publicationbias) и построение графиков «forestplot» и «funnelplot» были выполнены с помощью пакетов meta и rmeta программного приложения R-project (www.r-project.org). Поиск исследований проводили в базе данных PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) с использованием терминов «rs11212617», «T2DM» и «diabetesmellitus» в различных комбинациях среди опубликованных до 12 мая 2016 г. включительно. Критерии включения: 1) дизайн исследования «случай—контроль», 2) оценка ассоциации rs11212617 с достижением целевого уровня HbA_1с <7%, 3) изложение результатов на английском языке, 4) наличие всей информации, необходимой для вычисления OR. В метаанализ помимо наших результатов были включены результаты двух исследований Y. Zhou [8, 11] и N. vanLeeuwen [9]. Результаты исследования Y. Zhou (2014, RS11212617 isassociatedwithmetformintreatmentresponseintype 2 diabetesinShanghailocalChinesepopulation.), полученные на китайской популяции, нами не включены, так как статьи нет в доступе, а резюме не содержит необходимой информации. Всего в метаанализ включены 5494 пациента с СД2, принимающих МФ.

Результаты

Средний возраст обследованных составил 58,8±8,6 года, длительность СД2 — 6,2±5,7 года, уровень HbA_1c 8,4±1,9%, ИМТ 34,8±6,7 кг/м². В зависимости от уровня HbA_1c пациенты были распределены на группы: группа (n=209) с целевым уровнем HbA_1cна фоне терапии МФ (группа с хорошим ответом на МФ), из них монотерапия МФ была у 110 человек, комбинацию МФ с СМ получали 99 больных; и группа пациентов (n=251), не достигших целевого уровня HbA_1c на максимальной дозе МФ (группа с плохим ответом на МФ), из них монотерапия МФ была у 58 человек, комбинацию МФ с СМ получали 193 человека.

При анализе клинических данных пациенты группы с плохим ответом на МФ по сравнению с группой с хорошим ответом на МФ были моложе (57,5±8,1 года против 60,4±8,9 года; р<0,05), имели большую длительность заболевания (7,2±6,0 года против 5,1±5,1 года; р<0,05), более высокий уровень HbA₁_c (9,8±1,6% против 6,7±0,4%; р<0,05), более молодой возраст начала заболевания (50,2±8,6 года против 55,4±9,6 года; р<0,05) и статистически значимо не различались по ИМТ, степени инсулинорезистентности, скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и уровню трансаминаз (табл. 1).

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика обследованных больных

Распределение генотипов полиморфного локуса rs11212617 гена ATM статистически не отклонялось от равновесия Харди—Вайнберга (p=0,21). Частота редкого аллеля С полиморфного локуса rs11212617 гена ATM у обследованных больных составила 0,41; в подгруппе больных с плохим ответом на монотерапию МФ достигала 0,46, при хорошем ответе — 0,39 (р>0,05); при комбинированной терапии МФ и СМ и в общей группе больных с плохим ответом на МФ частота аллеля С была одинакова — 0,4 и 0,41 соответственно и не отличалась от таковой в группе с хорошим ответом (рис. 1).

Рис. 1. Частота редкого аллеля С полиморфного локуса rs11212617 гена АТМ в группах с различным ответом на терапию метформином.

Логистический регрессионный анализ зависимости достижения целевого HbA_1с <7% при терапии МФ от генотипов полиморфного локуса rs11212617 гена ATM не выявил статистически значимой ассоциации генотипа полиморфного локуса rs11212617 с типом ответа как в общей группе пациентов (OR=0,94; 95% CI 0,73—1,23; p=0,67), так и в подгруппах пациентов с монотерапией МФ (OR=0,90; 95% CI 0,65—1,25; p=0,54) и комбинированной терапией (OR=1,02; 95% CI 0,72—1,43; p=0,92) (табл. 2).

Таблица 2. Логистический регрессионный анализ зависимости достижения целевого уровня HbA1с <7% при терапии метформином от генотипов полиморфного локуса rs11212617 гена ATM Использована аддитивная модель наследования для вычисления OR для аллеля С в каждой когорте. В регрессию были дополнительно включены следующие параметры: пол пациента, возраст на момент обследования, ежедневная доза МФ и уровень креатинина.

Нами был проведен метаанализ результатов нашего исследования с ранее опубликованными. Всего в метаанализ включены 5494 пациента с СД2, принимающих МФ (табл. 3).

Таблица 3. Метаанализ исследований зависимости достижения целевого HbA1с <7% при терапии МФ от генотипов полиморфного локуса rs11212617 гена ATM

По результатам метаанализа, редкий аллель С является фактором хорошего ответа на терапию МФ (суммарный OR=1,27; 95% CI 1,10—1,46; p=0,0008; уровень гетерогенности p=0,02, модель случайных эффектов). Нами не обнаружено предвзятости в публикации результатов другими исследователями в соответствии с корреляционным анализом (Begg’s correlation analysis: z=–0,45 и p=0,65) и регрессионным тестом (Egger’s test: t=–0,47; p=0,66). Дополнительно был проведен метаанализ в каждой из подгрупп: монотерапия МФ и комбинированная терапия. Однако, если для подгруппы с монотерапией МФ были получены схожие результаты [суммарный OR=1,26, 95% CI 1,12—1,42; p=0,0001, уровень гетерогенности p=0,15, модель фиксированных эффектов, Begg’s correlation analysis (z=1,32 и р=0,19), Egger’s test (t=0,79; p=0,48)], то для группы с комбинированной терапией влияние полиморфного локуса на достижение целевого уровня HbA₁_cне выявлено: суммарный OR=1,13; 95% CI 0,98—1,29; p=0,09, уровень гетерогенности p=0,75, модель фиксированных эффектов, Begg’s correlation analysis (z=–0,56 и p=0,57), Egger’s test (t=–0,37; p=0,73). Результаты метаанализа и анализа предвзятости в публикациях графически изображены на рис. 2.

Рис. 2. Графическое изображение результатов метаанализа и анализа предвзятости в публикациях. а — «forest plot» для ассоциации rs11212617 с достижением целевого уровня HbA1c<7% в общей группе; b — «forest plot» для ассоциации rs11212617 с достижением целевого уровня HbA1c <7% в группе c монотерапией метформином, c — «forest plot» для ассоциации rs11212617 с достижением целевого уровня HbA1c <7% в группе с комбинированной терапией, d — «funnel plot» для исследований ассоциации rs11212617 с достижением целевого уровня HbA1c <7% в общей группе, e — «funnel plot» для исследований ассоциации rs11212617 с достижением целевого уровня HbA1c <7% в группе с монотерапией, f — «funnel plot» для исследований ассоциации rs11212617 с достижением целевого уровня HbA1c <7% в группе с комбинированной терапией.

Нежелательных явлений в ходе проведенного исследования зарегистрировано не было.

Обсуждение

Первое фармакогенетическое полногеномное ассоциативное исследование МФ было проведено в Шотландии у 1024 больных СД2, участвующих в исследовании GoDARTS (Genetics of Diabetes Audit and Research Tayside) [8]. Эффективность терапии МФ оценивали по уровню HbA_1c в течение первых 18 мес от начала терапии. Целевым уровнем являлся HbA_1c <7%, что считалось показателем эффективности сахароснижающей терапии. При статистическом анализе учитывали исходный уровень HbA_1c, его динамику в процессе терапии МФ и клиренс креатинина. Исследователи выявили 14 полиморфизмов в участке, содержащем ген АТМ. Было установлено, что носители минорного аллеля С полиморфного локуса rs11212617 гена АТМ достигали целевого уровня HbA_1c чаще (OR=1,64; 95% CI 1,37—1,99; р=1,9×10^–7). Для репликации первоначального результата полногеномного исследования авторы генотипировали этот полиморфный локус в двух независимых группах 1783 шотландских пациентов с СД2 (другая часть исследования GoDARTS) и 1113 пациентов из исследования UKPDS (UK Prospective Diabetes Study). В обеих популяциях также была установлена значимая ассоциация с ответом на терапию М.Ф. Совокупный эффект по достижению цели сахароснижающей терапии МФ был статистически значим на полногеномном уровне (ОR=1,35; 95% CI 1,22—1,49], р=2,9×10^–7). Позднее той же группой исследователей были определены генотипы полиморфного локуса rs11212617 еще у трех когорт: DCS, Rotterdam Study и CARDS [8, 9]. Последующий метаанализ в 5 исследованных когортах (первая была исключена во избежание смещения результатов) включал 4443 пациентов с СД2 и также подтверждал связь редкого аллеля С с достижением целевого уровня HbA_1c (ОR=1,25; 95% CI 1,13—1,38; р=7,8×10^–6). Примечательно, что ассоциация аллеля С при делении на группы монотерапии МФ и комбинированной терапии сохраняется только в группе с монотерапией. N. Van Leeuwen и соавт. [10] предположили, что некоторые эффекты терапии МФ (в частности, опосредованные AMPK, могут частично нивелироваться при приеме препаратов С.М. Возможно, данный участок гена контролирует клеточный цикл, а изменения в нем могут приводить к уменьшению фосфорилирования и активации АМРК и соответственно к различному сахароснижающему эффекту МФ.

Другие исследователи, которые изучали влияние полиморфного локуса rs11212617 гена АТМ на вероятность развития СД2 у лиц с избыточной массой тела и нарушением толерантности к глюкозе (НТГ) в программе профилактики диабета (Diabetes Prevention Program, DPP), с участием представителей пяти американских этнических групп (n=988), предположили, что время перехода НТГ в СД2 у лиц, принимающих МФ и различных по генотипу полиморфного локуса rs11212617, может отличаться. Однако никакой существенной разницы обнаружено не было. J. Florez и соавт. [11] полагают, что эффект полиморфного локуса при терапии МФ заметен только при высоких HbA_1c, что возможно только у лиц с уже диагностированным СД2. У участников их исследования СД2 развивался впоследствии, и уровни HbA_1c были невысоки.

Недавно S. Vilvanathan и соавт. [12] у жителей Южной Индии (118 пациентов с СД2 и 112 здоровых лиц) оценивали связь полиморфного локуса rs11212617 с развитием СД2. Однако влияние данного полиморфного локуса на предрасположенность к СД2 отсутствовало: OR=1,09; 95% CI 0,75—1,60.

Заключение

Выполненное исследование не выявило ассоциации полиморфного локуса rs11212617 гена ATM с ответом на терапию препаратами МФ у больных СД2 в Новосибирской области. Однако результаты метаанализа собственных данных с ранее опубликованными подтверждают ассоциацию аллеля С с достижением целевого уровня HbA_1с (суммарный OR=1,27; 95% CI 1,10—1,46; p=0,0008). Таким образом, полиморфный локус rs11212617 гена АТМ может влиять на эффективность терапии МФ у пациентов с СД2.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ 13−04−00520.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта (двойственности) интересов при написании данной статьи.