Дифференциальная диагностика узловых образований щитовидной железы (ЩЖ) остается сложной проблемой и в настоящее время. Наиболее актуальным вопросом является диагностика рака щитовидной железы (РЩЖ), так как узловые образования ЩЖ встречаются у 13—67% взрослых по данным УЗИ, а распространенность рака среди них составляет 5—10% [1]. Стандартным методом дооперационной диагностики РЩЖ является ТАБ с цитологическим исследованием пунктата. Однако данный метод имеет ряд ограничений, в частности, в группу изменений, подозрительных на злокачественные, относят фолликулярную неоплазию. Подобные заключения цитологического исследования обусловливают необходимость хирургических вмешательств с диагностической целью. При этом лишь в 15—20% изменений, подозрительных на злокачественные, подтверждается злокачественный процесс [2, 3]. В настоящее время окончательный диагноз может быть установлен только в результате гистологического исследования.

Таким образом, поиск новых методов дооперационной диагностики высокодифференцированного РЩЖ является актуальной проблемой.

Одним из перспективных направлений медицины и биологии является поиск онкомаркеров, которые могут быть использованы для диагностики РЩЖ. Один из изучаемых онкомаркеров — галектин-3 — белок из семейства лектинов, который является маркером неопластических процессов. Этот белок принимает участие в межклеточных, клеточно-матриксных взаимоотношениях, играет роль в опухолевой прогрессии и апоптозе, стимулирует ангиогенез и метастазирование, оказывает иммуносупрессивное действие [4, 5]. В ряде работ было показано, что галектин-3 может играть роль маркера злокачественного роста опухолей ЩЖ [6]. В частности, большое количество исследований посвящено изучению возможности использования галектина-3 в качестве онкомаркера папиллярного РЩЖ. В отношении возможности использования экспрессии данного белка в диагностике фолликулярного РЩЖ приводятся противоречивые данные. Так, в части работ указывается на невозможность использования экспрессии галектина-3 в диагностике фолликулярного РЩЖ [7, 8]. Другие исследователи приводят данные об использовании экспрессии галектина-3 в дифференциальной диагностике фолликулярного РЩЖ и фолликулярной аденомы ЩЖ на дооперационном этапе [9—11]. Таким образом, целью настоящего исследования явилось изучение возможности использования определения экспрессии галектина-3 методом ПФЦ в дооперационной диагностике высокодифференцированного РЩЖ.

В ходе выполнения данного проекта нами были обследованы 66 пациентов с узловыми образованиями ЩЖ, поступивших в клинику общей хирургии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова в 2008—2009 гг. Все пациенты были обследованы по стандартному алгоритму: клинические и лабораторно-инструментальные методы включали определение уровня тиреотропного гормона, УЗИ и ТАБ под контролем УЗИ. Соотношение заболевших мужчин и женщин было 1:6. Средний возраст составил 46,9±12 лет. Всем пациентам была проведена пункционная биопсия под контролем УЗИ. На основании данных цитологического исследования пунктата из образований ЩЖ были выделены 3 группы: 1-ю составили 29 пациентов, у которых при цитологическом исследовании были выявлены признаки папиллярного рака. Во 2-ю группу вошел 31 больной, у которого невозможно было подтвердить или исключить наличие рака ЩЖ по заключению ТАБ. В 3-ю группу были объединены 6 пациентов, у которых по результатам цитологического исследования имелись доброкачественные образования, включающие коллоидные узлы ЩЖ. Сравнительная характеристика исследуемых групп представлена в табл. 1.

Все пациенты были оперированы. Показаниями к операции были в 1-й группе — признаки злокачественного роста, во 2-й группе — невозможность исключить РЩЖ, по данным ТАБ, в 3-й группе — выявление функциональной автономии ЩЖ или наличие узла большого размера, вызывающего компрессионный синдром. Окончательный диагноз у оперированных пациентов ставили на основании планового гистологического заключения. Помимо цитологического исследования, всем пациентам было выполнено определение экспрессии белка галектина-3 методом ПФЦ. В качестве материала для исследования были использованы аспирационные биоптаты узловых образований ЩЖ. Образцы полученных методом ТАБ узловых образований ЩЖ помещали в раствор антикоагулянта и исследовали в течение 24 ч. В качестве антикоагулянта использовали гепарин 50 ЕД на 1 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Часть образцов замораживали при температуре –15— –18 °С более 24 ч, перед замораживанием аспираты помещали в фосфатно-буферный раствор, содержащий антикоагулянт (АДЦ) и раствор ДМАЦ для фиксации и пермеабилизации клеток. При необходимости образцы освобождали от эритроцитов стандартным методом лизиcа (IO Test Lysing Solution, Beckman Coulter) и фильтровали для получения однородной клеточной суспензии.

Для окрашивания образцов использовали следующие методы.

1. Непрямой метод иммунофлюоресценции с неконъюгированными мышиными моноклональными антителами (МКА) к галектину-3 человека (BD Вiosсiences), флюоресцеинконъюгированными (флюоресцеинизотиоционат) козьими антимышиными антителами (BD Biosciences) и прямыми конъюгатами МКА к антигену CD45 (Beckman Coulter).

После размораживания, окраски первичными и вторичными антителами клетки трехкратно отмывали в фосфатно-буферном растворе. Титр неконъюгированных МКА 1:25, конъюгированных 1:100.

2. Прямые конъюганты МКА к галектину-3 человека (Set, BD Bioscience).

В качестве отрицательного контроля для непрямого метода использовали образцы, не окрашенные первичными МКА. Для прямого метода использовали изотипический контроль (Set, BD Bioscience).Анализ готовых проб проводили на проточном цитометре EPICS XL/MCL (Beckman Coulter) с использованием программы System II.

Каждое клеточное событие оценивали по четырем параметрам: прямое светорассеяние — FS (forward side scatter), боковое светорассеяние SS (90° light/side scatter) и два детектора флюоресцентного сигнала. Первый FL-1 — детектор, выявляющий красители зеленого спектра (в данном случае флюоресцеинизотиоционат, обозначаемый как FITC), FL-2 — детектор, выявляющий красители красного спектра (в нашем исследовании фикоэрритрин, обозначаемый как РЕ).

Результаты выявления экспрессии галектина-3 в материале аспирационных биоптатов и сопоставление с диагнозами, сделанными по морфологическим критериям на послеоперационном материале, были оценены по следующим критериям [12]:

— прогностическая ценность положительного теста;

— чувствительность теста;

— прогностическая ценность отрицательного теста;

— специфичность теста;

— диагностическая точность метода.

При статистической обработке данных использовали критерий χ² Пирсона для сравнения качественных показателей. Для описания выборок рассчитывали среднее и его стандартное отклонение. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Во всех случаях было выполнено гистологическое исследование операционного материала, по результатам которого проведен сравнительный анализ данных цитологического и гистологического исследований.

В группе больных, у которых по данным цитологического исследования аспирата узла ЩЖ выявлены признаки папиллярного РЩЖ, диагноз высокодифференцированного РЩЖ подтвердился в 93,1% случаев (у 26 пациентов поставлен диагноз папиллярного РЩЖ, а у одного диагностирован фолликулярный РЩЖ). У 2 больных после операции диагностированы доброкачественные заболевания ЩЖ — коллоидный зоб и фолликулярная аденома ЩЖ.

Среди 31 пациента с дооперационным диагнозом «фолликулярная опухоль» у 29 (93,5%) при гистологическом исследовании диагностированы доброкачественные образования ЩЖ — фолликулярная аденома у 24 пациентов, коллоидный зоб у 4 больных и в одном случае онкоцитарная аденома. Лишь у 2 (6,5%) пациентов выявлен высокодифференцированный РЩЖ (в одном случае папиллярный, в другом — фолликулярный).

В группе больных с цитологическим диагнозом узловой коллоидный зоб при гистологическом исследовании диагноз подтвердился в 100% случаев (табл. 2).

Нами проведена оценка чувствительности, специфичности и точности метода ТАБ с цитологическим исследованием, а также прогностическая ценность положительного и отрицательного теста у 66 пациентов. Результаты представлены в табл. 3.

При оценке диагностической значимости цитологического исследования аспирата, полученного при ТАБ, отмечено, что при высокой чувствительности метода (100% при доверительном интервале — ДИ от 90,4 до 100%) и прогностической значимости отрицательного результата теста (100% при ДИ от 53,5 до 100%) выявлена довольно низкая специфичность (16,2% при ДИ от 8,7 до 16,2%), которая привела к низкой диагностической точности (53%) (р<0,05). Коэффициент согласия Каппа был равен 0,15 (при ДИ от 0 до 0,15), что свидетельствует о слабой согласованности оценок цитологического исследования с заключением окончательного гистологического исследования. По нашим данным, метод цитологического исследования оказался недостаточно точным для исследуемой группы пациентов.

Результаты применения метода ПФЦ. В алгоритм дооперационной диагностики узловых образований ЩЖ, кроме цитологического исследования аспирата, полученного при ТАБ, был включен метод ПФЦ исследования экспрессии галектина-3. Гистограммы и диаграммы определения экспрессии галектина-3 представлены на рис. 1 и 2.

Результаты цитологического исследования аспирата, полученного при ТАБ, методом ПФЦ для определения экспрессии галектина-3 и гистологического исследования представлены в табл. 4.

Среди 29 пациентов с предоперационным диагнозом папиллярного рака экспрессия галектина-3 наблюдалась у 27, из которых по данным гистологического исследования у 25 (92,6%) подтвержден диагноз высокодифференцированного РЩЖ (у 24 папиллярный РЩЖ, у одного — фолликулярный РЩЖ). У 2 (7,4%) пациентов диагностированы доброкачественные заболевания ЩЖ — коллоидный зоб и фолликулярная аденома ЩЖ. В 2 (6,9%) случаях, когда экспрессия галектина-3 не определялась, по данным гистологического исследования образования ЩЖ был выявлен папиллярный РЩЖ.

В группе пациентов с цитологическим диагнозом фолликулярная опухоль экспрессия галектина-3 наблюдалась у 4 больных из 31. Этим пациентам в послеоперационном периоде по данным гистологического исследования были поставлены следующие диагнозы: у 2 больных высокодифференцированный РЩЖ (папиллярный и фолликулярный рак ЩЖ), у одного пациента — фолликулярная аденома ЩЖ, у одного больного — онкоцитарная аденома ЩЖ. У остальных 27 пациентов экспрессия галектина-3 не выявлялась, а по данным гистологического исследования определены доброкачественные образования ЩЖ.

Среди 6 пациентов с доброкачественными образованиями ЩЖ по данным ТАБ экспрессия галектина-3 не была выявлена ни у одного из больных (100%).

Таким образом, среди 29 пациентов с установленным по данным гистологического исследования диагнозом высокодифференцированного (папиллярного или фолликулярного) РЩЖ экспрессия галектина-3 наблюдалась у 27 (93,1%) и лишь у 2 (6,9%) отсутствовала. Среди 37 больных с доброкачественными образованиями ЩЖ по данным гистологического исследования экспрессия галектина-3 отсутствовала у 33 (89,2%), а была выявлена у 2 больных с фолликулярной аденомой ЩЖ, у одного пациента с коллоидным зобом и у одного больного с онкоцитарной аденомой ЩЖ.

Диагностическая значимость метода ПФЦ для определения экспрессии галектина-3 в аспирате, полученном при ТАБ из узловых образований ЩЖ, представлена в табл. 5.

Таким образом, чувствительность ПФЦ метода для определения экспрессии галектина-3 в аспирате из узла ЩЖ составила 93,1% (р<0,05), что сопоставимо с чувствительностью цитологического исследования (100%). Однако специфичность ПФЦ метода для определения экспрессии галектина-3 оказалась достоверно выше и составила 89,2%. Соответственно диагностическая точность ПФЦ метода определения экспрессии галектина-3 оказалась равной 90,9% (р<0,05), что достоверно выше точности цитологического исследования (53%). Учитывая высокий коэффициент согласия Каппа, равный 0,82 (при ДИ от 0,59 до 0,92), и р<0,05, можно констатировать статистическую достоверность полученных данных. Таким образом, определение экспрессии галектина-3 методом ПФЦ позволяет улучшить диагностику высокодифференцированного РЩЖ на дооперационном этапе.

Наиболее диагностически сложной является группа пациентов с цитологическим диагнозом «фолликулярная опухоль», так как на дооперационном этапе невозможно установить точный диагноз и, соответственно, этих больных оперируют с диагностической целью. Мы оценили диагностическую значимость ПФЦ метода для определения экспрессии галектина-3 для группы пациентов с дооперационным диагнозом «фолликулярная опухоль».

Чувствительность ПФЦ метода для определения экспрессии галектина-3 в аспирате из узла ЩЖ для группы фолликулярных опухолей составила 100%, специфичность — 93,1%, диагностическая точность — 93,5%, прогностическая ценность положительного теста — 50%, а прогностическая ценность отрицательного теста — 100% (р<0,05). Мы сравнили традиционный метод цитологического исследования аспирата с определением экспрессии галектина-3 методом ПФЦ (табл. 6).

Согласно приведенным данным, сравниваемые методы обладают одинаково высокой чувствительностью, равной 100%. Однако цитологическое исследование не позволяет дифференцировать фолликулярную аденому и фолликулярный рак, а нередко в эту группу попадают пациенты с фолликулярным вариантом папиллярного рака, что сводит специфичность данного метода практически к нулю. Следовательно, большая часть хирургических вмешательств в этой группе пациентов выполняется с диагностической целью и, соответственно, их можно избежать. Мы выполнили попытку с помощью определения экспрессии галектина-3 методом ПФЦ улучшить диагностику высокодифференцированного рака на дооперационном этапе. Специфичность данного метода оказалась равной 93%, диагностическая точность 93,5% (р<0,05). Прогностическая ценность отрицательного теста достигла 100%, т.е. отсутствие экспрессии галектина-3 исключает наличие рака ЩЖ в этой группе пациентов. Соответственно можно предположить, что пациентам с цитологическим диагнозом «фолликулярная опухоль» в отсутствие экспрессии галектина-3 можно было не выполнять операции с диагностической целью.

Полученные в настоящей работе данные показывают, что чувствительность цитологического исследования и определения экспрессии галектина-3 методом ПФЦ достаточно высока и достоверно не отличается для обоих методов. Однако такой важный показатель, как специфичность метода в диагностике высокодифференцированного рака ЩЖ, оказался достоверно более высоким у метода ПФЦ для определения экспрессии галектина-3. Соответственно ТАБ с цитологическим исследованием аспирата имеет высокую чувствительность, но низкую специфичность в выявлении злокачественных опухолей, а именно фолликулярного рака. При этом определение экспрессии галектина-3 методом ПФЦ имеет высокую чувствительность и достоверно является более специфичным в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака ЩЖ. Особенно актуальным представляется использование данного метода в группе пациентов с цитологическим диагнозом «фолликулярная опухоль», у которых диагностическая значимость данного метода оказалась наиболее высокой и равнялась 93,5% (р<0,05).

Соответственно, используя в клинической практике более простой, экономически выгодный и чувствительный метод цитологического исследования в качестве скрининга, при выявлении подозрительных результатов (подозрительные на рак и неопределенные результаты) возможно использование более высокотехнологичного и специфичного метода ПФЦ исследования.

Таким образом, при подозрении на злокачественную опухоль по данным цитологического исследования для уточнения диагноза необходимо выполнить исследование биомаркеров рака ЩЖ методом ПФЦ. Сочетанное использование данных методик позволит улучшить диагностику высокодифференцированного рака ЩЖ на дооперационном этапе. Нам кажется перспективным использование в диагностической панели большего числа онкомаркеров, отвечающих за различные звенья канцерогенеза.

Таким образом, выбранный нами для исследования метод ПФЦ для определения экспрессии галектина-3 в пунктате из образования ЩЖ обладает высокой диагностической точностью и может быть использован в качестве дополнительного уточняющего метода в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака ЩЖ.

Проведенное исследование позволило сделать следующий вывод: выявление экспрессии белка галектина-3 методом ПФЦ может быть использовано в качестве дополнительного метода дооперационной диагностики высокодифференцированного рака ЩЖ.