Введение

Эстетические операции направлены на улучшение качества жизни пациентов. Послеоперационные рубцы — неизбежное следствие хирургических вмешательств. Формирование патологических (гипертрофических, келоидных) рубцов минимизирует удовлетворенность пациентов результатами операции, значительно ухудшая качество их жизни.

В настоящее время существует много способов профилактики формирования гипертрофических и келоидных рубцов, но ни один из них не оказывается универсальным. Сведения, представленные в ряде публикаций, позволяют предположить, что ботулотоксин типа A положительно влияет на заживление ран, предупреждая развитие гипертрофических и келоидных рубцов [1—3].

По мнению L.M. Kasyanju Carrero и соавт. (2018), Wang Y.-X. и соавт. (2023), одним из механизмов позитивного действия ботулотоксина типа A оказывается иммобилизация краев раны в местах хирургического вмешательства за счет блокирования высвобождения из аксонов нейромедиатора ацетилхолина, что исключает сокращение мышц. Данная гипотеза подтверждена в ряде публикаций, в которых также отмечается эффективность и безопасность применения ботулотоксина типа A для профилактики и лечения гипертрофических и келоидных рубцов [4—6].

За прошедшие 10 лет разные авторы все больше внимания уделяют оценке результатов применения ботулотоксина типа A для предупреждения патологического рубцевания [1—6]. При проведении экспериментальных исследований накоплены данные об основных патофизиологических механизмах, приводящих к формированию гипертрофических и келоидных рубцов [7, 8]. В частности, ряд специалистов отводят важную роль в формировании рубца фибробластам и миофибробластам. Травматизация покровных тканей способствует активации кератиноцитов, их миграции в раневое ложе и эпителизации. В свою очередь, дифференцировка фибробластов в миофибробласты обеспечивает контракцию раны, синтез компонентов межклеточного вещества рубца. Образование гипертрофических и келоидных рубцов связывают со снижением способности миофибробластов к апоптозу. В эксперименте in vitro ботулотоксин типа A снижал действие фактора роста соединительной ткани (CTGF) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ингибировал функцию фибробластов [7, 9]. N. Zhou и соавт. (2020), Z. Yang и соавт. (2022), L. Pan и соавт. (2022) приводят экспериментальные данные о положительных эффектах применения ботулотоксина типа A для профилактики гипертрофических и келоидных рубцов [10—12]. Однако этих сведений недостаточно, чтобы подтвердить данную гипотезу, что обусловливает необходимость проведения специального исследования.

Цель исследования — оценить результаты применения ботулотоксина типа A в эксперименте для предупреждения гипертрофических и келоидных рубцов.

Материал и методы

Для экспериментального исследования отобраны 3 кролика породы советская шиншилла в возрасте от 1,5 мес до 2 мес, не перекрещивающиеся по родословным линиям. Работа выполнялась в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях [13]. Кролики содержались в виварии кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии имени профессора Ф.И. Валькера ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России.

Хирургические вмешательства проводили под общей анестезией с искусственной вентиляцией легких. По линиям предварительно нанесенной разметки в области каждой из ушных раковин было иссечено по 5 участков кожи эллипсовидной формы длиной 1,5 см и шириной 0,5 см. Раны ушиты обвивным швом нитью Prolene 5-0 (Ethicon, США). Сверху для предупреждения инфицирования нанесен медицинский клей БФ-6 (ООО «Тульская фармацевтическая фабрика», Россия) (рис. 1).

Рис. 1. Этапы операции.

а — измерение длины предполагаемой раны; б — иссечение кожи по линии предварительной разметки; в — ушитая рана.

Раны зажили первичным натяжением, швы сняты на 7-е сутки. Таким образом, в исследовании проанализированы данные о 30 раневых дефектах кожи ушных раковин кроликов (15 дефектов — экспериментальная группа, 15 дефектов — контрольная группа).

Учитывая, что ботулотоксин типа A не оказывает системного влияния на организм в терапевтических дозах, левое ухо кроликов рассматривали в качестве экспериментального, а правое — в качестве контрольного [14, 15]. На 7-е сутки после операции в область рубцов в экспериментальной группе вводили ботулинический токсин типа A (АО «НПО «Микроген», Россия) из расчета 2 единицы ботулинического токсина типа A в стандартном разведении (100 единиц на 2 мл NaCl 0,9%) в один рубец. На 14-е, 28-е и 42-е сутки из каждого рубца в области ушных раковин в контрольной и экспериментальной группах осуществляли взятие панч-биопсии (3 мм). Полученный материал для морфологического исследования был фиксирован в 10% забуференном растворе формалина (ООО «БиоВитрум», Россия).

Подсчет фибробластов и миофибробластов проведен при гистологическом исследовании. Микропрепараты изготовлены следующим образом. Биоматериал дегидрирован на тканевом процессоре Leica ASP 300 (Leica Microsystems GmbH, Германия), ткани уплотнены с применением станции для заливки парафинов Leica EG1160 (Leica Microsystems GmbH, Германия), парафиновые блоки секционированы на микротоме Leica SM 2000R (Leica Microsystems GmbH, Германия). Срезы окрашены гематоксилином и эозином посредством автоматической системы окраски гистологических препаратов Leica ST 1050 (Leica Microsystems GmbH, Германия). Микроскопическое исследование проведено на оптическом бинокулярном микроскопе Leica DM1000 (Leica Microsystems GmbH, Германия) с увеличением ×400 с подсчетом количества фибробластов, миофибробластов в экспериментальной и контрольной группах (рис. 2). Полученные данные обобщены и систематизированы.

Рис. 2. Гистологические препараты.

а, б — ×400. Черным цветом маркированы фибробласты, красным — миофибробласты.

Статистическая обработка полученных данных осуществлена посредством программы Microsoft Excel 2019 (Microsoft, США) и программного пакета Statistica 12 (StatSoft, США). Для сравнения количества фибробластов, миофибробластов в экспериментальной и контрольной группах применяли критерий Манна—Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,005.

Результаты

В ходе выполнения работы оценивали вид рубцов в каждой из анализируемых временных контрольных точек: через 14 дней, 28 дней и 42 дня после введения ботулотоксина типа A. При визуальной оценке рубцов в контрольной группе в 4 из 15 случаев констатированы гипертрофические рубцы, в экспериментальной группе гипертрофических рубцов выявлено не было (рис. 3).

Рис. 3. Вид рубцов.

а — гипертрофические рубцы в контрольной группе; б — нормотрофические рубцы в экспериментальной группе.

При проведении морфологического исследования с подсчетом количества фибробластов в биоптатах, полученных в запланированные сроки, определены медианные значения анализируемого параметра. Установлено, что в экспериментальной группе через 42 дня после инъекции ботулотоксина типа A фибробластов было меньше, чем в контрольной группе (p=0,01). В остальных контрольных точках статистически значимые различия отсутствовали (табл. 1).

Таблица 1. Медианные значения количества фибробластов в группах исследования

Примечание. * — различия значимы (p<0,05).

При анализе данных о количестве миофибробластов, содержащихся в рубцовой ткани экспериментальных животных, полученной через 14 дней, 28 дней и 42 дня после выполнения инъекции ботулотоксина типа A, выявлено, что полученные значения в экспериментальной группе в 2 раза ниже, чем в контрольной группе (p=0,000003) (табл. 2).

Таблица 2. Медианные значения количества миофибробластов в группах исследования

Примечание. * — различия значимы (p<0,05).

В эксперименте продемонстрировано, что гипертрофические рубцы в контрольной группе сформировались в 4 случаях из 15. Выявлены значимые различия в морфологии рубцовой ткани. В частности, в рубцах в контрольной группе на 42-й день после операции количество фибробластов оказалось выше, чем в экспериментальной группе. Что касается миофибробластов в экспериментальной группе, то их количество на всех сроках наблюдения было ниже, чем в контрольной группе.

Обсуждение

Гипертрофические и келоидные рубцы кожи — это распространенное патологическое состояние, обусловленное избыточным разрастанием дермального коллагена. Однако патогенетические механизмы их формирования в настоящее время представляются неоднозначными. Пациенты с гипертрофическими и келоидными рубцами помимо эстетической неудовлетворенности внешним видом часто сталкиваются с такими симптомами, как боль и зуд. Необходимо констатировать, что многочисленные методы лечения пациентов с рубцами кожи, в том числе хирургическое иссечение, инъекции глюкокортикостероидов и лучевая терапия, лазерная и прессотерапия, не всегда обеспечивают надежный удовлетворительный результат. В связи с этим необходим поиск новых методов лечения пациентов. Введение ботулотоксина типа A в гипертрофический или келоидный рубец в настоящее время представляется перспективным методом, однако детального понимания механизмов воздействия ботулотоксина типа A на рубцовую ткань пока нет.

E. Çalıskan и соавт. (2016) в экспериментальном исследовании на модели уха кролика сравнили влияние на гипертрофический рубец триамцинолона ацетонида, 5-фторурацила и ботулотоксина типа A относительно контрольной группы. Применение 5-фторурацила обусловило статистически значимое снижение количества фибробластов в рубцах. Разтличий коллагенового индекса в анализируемых группах не выявлено [16]. D.-Q. Liu и соавт. (2018) при сравнении эффективности влияния на гипертрофические рубцы уха кролика ботулотоксина типа A и триамцинолона ацетонида обнаружили, что индекс гипертрофии с учетом соотношения высоты рубца в сопоставлении с неизмененной кожей в случаях применения ботулотоксина типа A оказывается ниже, чем при использовании триамцинолона ацетонида и в контрольной группе [17].

Z. Youjin и соавт. (2019) сравнили результаты введения в рубцы ушных раковин кроликов ботулотоксина типа A и триамцинолона ацетонида с таковыми в контрольной группе и продемонстрировали, что гипертрофические рубцы в экспериментальных группах оказались значительно тоньше, чем в контрольной группе [18].

Одним из определяющих факторов, влияющих на формирование патологического рубца, является натяжение краев раны. Известно, что ботулотоксин блокирует высвобождение ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях и, как следствие, снижает способность мышц к сокращению. Z. Xiao и G. Qu (2012) сообщают, что при введении ботулотоксина в рубец в области уха кролика (отметим, что под кожей ушной раковины кролика находятся тончайшие мышечные волокна) натяжение тканей в непосредственной близости от формирующегося рубца уменьшается, фибробласты постепенно изменяют свое функциональное состояние, в результате чего замедляется их пролиферация, снижается синтез белков внеклеточного матрикса, в том числе коллагена [19]. L. Pan и соавт. (2022) приводит данные, что фибробласты под действием ботулотоксина типа A выделяют меньше некоторых биологически активных веществ, что препятствует их избыточной пролиферации, обеспечивая уменьшение синтеза белков внеклеточного матрикса [12].

N. Zhou и соавт. (2020) приводят сведения, что к 30-м суткам эксперимента высота рубцов в группе инъекций ботулотоксина типа A оказалась в 1,9 раза ниже, чем в контрольной группе. Также выявлена положительная корреляция между плотностью микрососудов и экспрессией VEGF. Этот факт с учетом трехкратного снижения уровня VEGF в рубцах после введения ботулотоксина типа A позволяет полагать, что одной из причин позитивного воздействия ботулотоксина типа A на формирующуюся рубцовую ткань оказывается снижение интенсивности ангиогенеза [10].

Ряд исследователей задаются вопросом о молекулярных механизмах воздействия ботулотоксина типа A на рубец. В частности, X. Zhibo и Z. Miaobo (2008) in vitro установили, что ботулотоксин типа A способствует апоптозу и ингибирует пролиферацию фибробластов, полученных из гипертрофических рубцов. Также ботулотоксин типа A способен ингибировать экспрессию трансформирующего фактора роста (TGF)-β1 в фибробластах гипертрофических рубцов [20, 21]. M. Shah и соавт. (1994) отмечают, что избыточная продукция TGF-β1, обнаруженная в келоидных рубцах, обусловливает увеличение продолжительности фазы пролиферации и кратное повышение синтеза коллагена фибробластами [22]. В эксперименте на крысах доказано, что при введении ботулотоксина типа A к 14 дням после операции в формирующихся рубцах в 2 раза снижается количество воспалительных клеток (нейтрофилов, лимфоцитов). А к 4 нед после хирургического вмешательства инъекции ботулотоксина типа A обусловливают снижение уровня фибробластов и экспрессии TGF-β1 соответственно на 37,7% и 55% по сравнению с контрольной группой [23].

Во многих исследованиях in vitro уделяется особое внимание оценке влияния ботулотоксина типа A на фибробласты и формирование внеклеточного матрикса. Однако не все авторы анализировали влияние ботулотоксина типа A на миофибробласты на модели животных. Модель уха кролика хорошо отражает стадии формирования рубца. Развитие гипертрофии рубца в этих случаях происходит схоже с формированием рубца у человека. Кроме того, кролики обладают хорошим иммунитетом, что важно при заживлении ран.

При проведении данного исследования продемонстрировано влияние ботулотоксина типа A на пролиферацию фибробластов и миофибробластов в рубцах. Сведения, полученные при выполнении работы, позволяют полагать, что в группе применения ботулотоксина типа A наблюдалось отчетливое снижение количества фибробластов и миофибробластов по сравнению с контрольной группой, что частично объясняет, почему ботулотоксин типа A улучшает итоговый вид рубца и подавляет рост гипертрофических и келоидных рубцов.

В данной статье представлены результаты исследования, направленного на выяснение причин позитивного влияния ботулотоксина типа A на формирование рубцов кожи в эксперименте. Тем не менее это исследование не отвечает на все вопросы. В частности, в дальнейшем целесообразно оценить молекулярные механизмы действия ботулотоксина типа A на ингибирование пролиферации фибробластов и миофибробластов. Оценка способности фибробластов к секреции коллагена in vitro, а также генетическое исследование экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) коллагеновых волокон смогли бы прояснить некоторые молекулярные механизмы действия ботулотоксина типа A.

Заключение

При проведении исследования установлено, что инъекции ботулотоксина типа A через 7 дней после операции позволяют уменьшить вероятность формирования гипертрофических рубцов кожи. Одной из точек воздействия ботулотоксина типа A, вероятно, оказывается влияние на количество миофибробластов, содержащихся в рубцовой ткани в стадиях пролиферации и ремоделирования внеклеточного матрикса.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Кораблева Н.П., Романенков Н.С., Кремлёв Д.И.

Сбор и обработка материала — Косулин А.В., Кремлёв Д.И., Мирошниченко М.С., Арбеков П.В.

Статистическая обработка данных — Коваленко А.П., Романенков Н.С.

Написание текста — Кремлёв Д.И., Некрасов А.А.

Редактирование — Кораблева Н.П., Романенков Н.С.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of authors:

Concept and design of the study — Korableva N.P., Romanenkov N.S., Kremlev D.I.

Data collection and processing — Kosulin A.V., Kremlev D.I., Miroshnichenko M.S., Arbekov P.V.

Statistical processing of the data — Kovalenko A.P., Romanenkov N.S.

Text writing — Kremlev D.I., Nekrasov A.A.

Editing — Korableva N.P., Romanenkov N.S.

Funding. The study had no sponsorship.