Введение
Эстетические операции направлены на улучшение качества жизни пациентов. Послеоперационные рубцы — неизбежное следствие хирургических вмешательств. Формирование патологических (гипертрофических, келоидных) рубцов минимизирует удовлетворенность пациентов результатами операции, значительно ухудшая качество их жизни.
В настоящее время существует много способов профилактики формирования гипертрофических и келоидных рубцов, но ни один из них не оказывается универсальным. Сведения, представленные в ряде публикаций, позволяют предположить, что ботулотоксин типа A положительно влияет на заживление ран, предупреждая развитие гипертрофических и келоидных рубцов [1—3].
По мнению L.M. Kasyanju Carrero и соавт. (2018), Wang Y.-X. и соавт. (2023), одним из механизмов позитивного действия ботулотоксина типа A оказывается иммобилизация краев раны в местах хирургического вмешательства за счет блокирования высвобождения из аксонов нейромедиатора ацетилхолина, что исключает сокращение мышц. Данная гипотеза подтверждена в ряде публикаций, в которых также отмечается эффективность и безопасность применения ботулотоксина типа A для профилактики и лечения гипертрофических и келоидных рубцов [4—6].
За прошедшие 10 лет разные авторы все больше внимания уделяют оценке результатов применения ботулотоксина типа A для предупреждения патологического рубцевания [1—6]. При проведении экспериментальных исследований накоплены данные об основных патофизиологических механизмах, приводящих к формированию гипертрофических и келоидных рубцов [7, 8]. В частности, ряд специалистов отводят важную роль в формировании рубца фибробластам и миофибробластам. Травматизация покровных тканей способствует активации кератиноцитов, их миграции в раневое ложе и эпителизации. В свою очередь, дифференцировка фибробластов в миофибробласты обеспечивает контракцию раны, синтез компонентов межклеточного вещества рубца. Образование гипертрофических и келоидных рубцов связывают со снижением способности миофибробластов к апоптозу. В эксперименте in vitro ботулотоксин типа A снижал действие фактора роста соединительной ткани (CTGF) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ингибировал функцию фибробластов [7, 9]. N. Zhou и соавт. (2020), Z. Yang и соавт. (2022), L. Pan и соавт. (2022) приводят экспериментальные данные о положительных эффектах применения ботулотоксина типа A для профилактики гипертрофических и келоидных рубцов [10—12]. Однако этих сведений недостаточно, чтобы подтвердить данную гипотезу, что обусловливает необходимость проведения специального исследования.
Цель исследования — оценить результаты применения ботулотоксина типа A в эксперименте для предупреждения гипертрофических и келоидных рубцов.
Материал и методы
Для экспериментального исследования отобраны 3 кролика породы советская шиншилла в возрасте от 1,5 мес до 2 мес, не перекрещивающиеся по родословным линиям. Работа выполнялась в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях [13]. Кролики содержались в виварии кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии имени профессора Ф.И. Валькера ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России.
Хирургические вмешательства проводили под общей анестезией с искусственной вентиляцией легких. По линиям предварительно нанесенной разметки в области каждой из ушных раковин было иссечено по 5 участков кожи эллипсовидной формы длиной 1,5 см и шириной 0,5 см. Раны ушиты обвивным швом нитью Prolene 5-0 (Ethicon, США). Сверху для предупреждения инфицирования нанесен медицинский клей БФ-6 (ООО «Тульская фармацевтическая фабрика», Россия) (рис. 1).
Рис. 1. Этапы операции.
а — измерение длины предполагаемой раны; б — иссечение кожи по линии предварительной разметки; в — ушитая рана.
Раны зажили первичным натяжением, швы сняты на 7-е сутки. Таким образом, в исследовании проанализированы данные о 30 раневых дефектах кожи ушных раковин кроликов (15 дефектов — экспериментальная группа, 15 дефектов — контрольная группа).
Учитывая, что ботулотоксин типа A не оказывает системного влияния на организм в терапевтических дозах, левое ухо кроликов рассматривали в качестве экспериментального, а правое — в качестве контрольного [14, 15]. На 7-е сутки после операции в область рубцов в экспериментальной группе вводили ботулинический токсин типа A (АО «НПО «Микроген», Россия) из расчета 2 единицы ботулинического токсина типа A в стандартном разведении (100 единиц на 2 мл NaCl 0,9%) в один рубец. На 14-е, 28-е и 42-е сутки из каждого рубца в области ушных раковин в контрольной и экспериментальной группах осуществляли взятие панч-биопсии (3 мм). Полученный материал для морфологического исследования был фиксирован в 10% забуференном растворе формалина (ООО «БиоВитрум», Россия).
Подсчет фибробластов и миофибробластов проведен при гистологическом исследовании. Микропрепараты изготовлены следующим образом. Биоматериал дегидрирован на тканевом процессоре Leica ASP 300 (Leica Microsystems GmbH, Германия), ткани уплотнены с применением станции для заливки парафинов Leica EG1160 (Leica Microsystems GmbH, Германия), парафиновые блоки секционированы на микротоме Leica SM 2000R (Leica Microsystems GmbH, Германия). Срезы окрашены гематоксилином и эозином посредством автоматической системы окраски гистологических препаратов Leica ST 1050 (Leica Microsystems GmbH, Германия). Микроскопическое исследование проведено на оптическом бинокулярном микроскопе Leica DM1000 (Leica Microsystems GmbH, Германия) с увеличением ×400 с подсчетом количества фибробластов, миофибробластов в экспериментальной и контрольной группах (рис. 2). Полученные данные обобщены и систематизированы.
Рис. 2. Гистологические препараты.
а, б — ×400. Черным цветом маркированы фибробласты, красным — миофибробласты.
Статистическая обработка полученных данных осуществлена посредством программы Microsoft Excel 2019 (Microsoft, США) и программного пакета Statistica 12 (StatSoft, США). Для сравнения количества фибробластов, миофибробластов в экспериментальной и контрольной группах применяли критерий Манна—Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,005.
Результаты
В ходе выполнения работы оценивали вид рубцов в каждой из анализируемых временных контрольных точек: через 14 дней, 28 дней и 42 дня после введения ботулотоксина типа A. При визуальной оценке рубцов в контрольной группе в 4 из 15 случаев констатированы гипертрофические рубцы, в экспериментальной группе гипертрофических рубцов выявлено не было (рис. 3).
Рис. 3. Вид рубцов.
а — гипертрофические рубцы в контрольной группе; б — нормотрофические рубцы в экспериментальной группе.
При проведении морфологического исследования с подсчетом количества фибробластов в биоптатах, полученных в запланированные сроки, определены медианные значения анализируемого параметра. Установлено, что в экспериментальной группе через 42 дня после инъекции ботулотоксина типа A фибробластов было меньше, чем в контрольной группе (p=0,01). В остальных контрольных точках статистически значимые различия отсутствовали (табл. 1).
Таблица 1. Медианные значения количества фибробластов в группах исследования
Сроки наблюдения, сутки | Медиана количества фибробластов в группах | Значение p* | |
экспериментальная группа | контрольная группа | ||
14-е | 9,0 | 10,0 | 0,340087 |
28-е | 11,5 | 12,50 | 0,349615 |
42-е | 13,0 | 15,0 | 0,016835 |
Примечание. * — различия значимы (p<0,05).
При анализе данных о количестве миофибробластов, содержащихся в рубцовой ткани экспериментальных животных, полученной через 14 дней, 28 дней и 42 дня после выполнения инъекции ботулотоксина типа A, выявлено, что полученные значения в экспериментальной группе в 2 раза ниже, чем в контрольной группе (p=0,000003) (табл. 2).
Таблица 2. Медианные значения количества миофибробластов в группах исследования
Срок наблюдения, сутки | Медиана количества миофибробластов в группах | Значение p* | |
экспериментальная группа | контрольная группа | ||
14-е | 7,0 | 14,0 | 0,000003 |
28-е | 9,0 | 18,0 | 0,000003 |
42-е | 11,0 | 22,0 | 0,000003 |
Примечание. * — различия значимы (p<0,05).
В эксперименте продемонстрировано, что гипертрофические рубцы в контрольной группе сформировались в 4 случаях из 15. Выявлены значимые различия в морфологии рубцовой ткани. В частности, в рубцах в контрольной группе на 42-й день после операции количество фибробластов оказалось выше, чем в экспериментальной группе. Что касается миофибробластов в экспериментальной группе, то их количество на всех сроках наблюдения было ниже, чем в контрольной группе.
Обсуждение
Гипертрофические и келоидные рубцы кожи — это распространенное патологическое состояние, обусловленное избыточным разрастанием дермального коллагена. Однако патогенетические механизмы их формирования в настоящее время представляются неоднозначными. Пациенты с гипертрофическими и келоидными рубцами помимо эстетической неудовлетворенности внешним видом часто сталкиваются с такими симптомами, как боль и зуд. Необходимо констатировать, что многочисленные методы лечения пациентов с рубцами кожи, в том числе хирургическое иссечение, инъекции глюкокортикостероидов и лучевая терапия, лазерная и прессотерапия, не всегда обеспечивают надежный удовлетворительный результат. В связи с этим необходим поиск новых методов лечения пациентов. Введение ботулотоксина типа A в гипертрофический или келоидный рубец в настоящее время представляется перспективным методом, однако детального понимания механизмов воздействия ботулотоксина типа A на рубцовую ткань пока нет.
E. Çalıskan и соавт. (2016) в экспериментальном исследовании на модели уха кролика сравнили влияние на гипертрофический рубец триамцинолона ацетонида, 5-фторурацила и ботулотоксина типа A относительно контрольной группы. Применение 5-фторурацила обусловило статистически значимое снижение количества фибробластов в рубцах. Разтличий коллагенового индекса в анализируемых группах не выявлено [16]. D.-Q. Liu и соавт. (2018) при сравнении эффективности влияния на гипертрофические рубцы уха кролика ботулотоксина типа A и триамцинолона ацетонида обнаружили, что индекс гипертрофии с учетом соотношения высоты рубца в сопоставлении с неизмененной кожей в случаях применения ботулотоксина типа A оказывается ниже, чем при использовании триамцинолона ацетонида и в контрольной группе [17].
Z. Youjin и соавт. (2019) сравнили результаты введения в рубцы ушных раковин кроликов ботулотоксина типа A и триамцинолона ацетонида с таковыми в контрольной группе и продемонстрировали, что гипертрофические рубцы в экспериментальных группах оказались значительно тоньше, чем в контрольной группе [18].
Одним из определяющих факторов, влияющих на формирование патологического рубца, является натяжение краев раны. Известно, что ботулотоксин блокирует высвобождение ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях и, как следствие, снижает способность мышц к сокращению. Z. Xiao и G. Qu (2012) сообщают, что при введении ботулотоксина в рубец в области уха кролика (отметим, что под кожей ушной раковины кролика находятся тончайшие мышечные волокна) натяжение тканей в непосредственной близости от формирующегося рубца уменьшается, фибробласты постепенно изменяют свое функциональное состояние, в результате чего замедляется их пролиферация, снижается синтез белков внеклеточного матрикса, в том числе коллагена [19]. L. Pan и соавт. (2022) приводит данные, что фибробласты под действием ботулотоксина типа A выделяют меньше некоторых биологически активных веществ, что препятствует их избыточной пролиферации, обеспечивая уменьшение синтеза белков внеклеточного матрикса [12].
N. Zhou и соавт. (2020) приводят сведения, что к 30-м суткам эксперимента высота рубцов в группе инъекций ботулотоксина типа A оказалась в 1,9 раза ниже, чем в контрольной группе. Также выявлена положительная корреляция между плотностью микрососудов и экспрессией VEGF. Этот факт с учетом трехкратного снижения уровня VEGF в рубцах после введения ботулотоксина типа A позволяет полагать, что одной из причин позитивного воздействия ботулотоксина типа A на формирующуюся рубцовую ткань оказывается снижение интенсивности ангиогенеза [10].
Ряд исследователей задаются вопросом о молекулярных механизмах воздействия ботулотоксина типа A на рубец. В частности, X. Zhibo и Z. Miaobo (2008) in vitro установили, что ботулотоксин типа A способствует апоптозу и ингибирует пролиферацию фибробластов, полученных из гипертрофических рубцов. Также ботулотоксин типа A способен ингибировать экспрессию трансформирующего фактора роста (TGF)-β1 в фибробластах гипертрофических рубцов [20, 21]. M. Shah и соавт. (1994) отмечают, что избыточная продукция TGF-β1, обнаруженная в келоидных рубцах, обусловливает увеличение продолжительности фазы пролиферации и кратное повышение синтеза коллагена фибробластами [22]. В эксперименте на крысах доказано, что при введении ботулотоксина типа A к 14 дням после операции в формирующихся рубцах в 2 раза снижается количество воспалительных клеток (нейтрофилов, лимфоцитов). А к 4 нед после хирургического вмешательства инъекции ботулотоксина типа A обусловливают снижение уровня фибробластов и экспрессии TGF-β1 соответственно на 37,7% и 55% по сравнению с контрольной группой [23].
Во многих исследованиях in vitro уделяется особое внимание оценке влияния ботулотоксина типа A на фибробласты и формирование внеклеточного матрикса. Однако не все авторы анализировали влияние ботулотоксина типа A на миофибробласты на модели животных. Модель уха кролика хорошо отражает стадии формирования рубца. Развитие гипертрофии рубца в этих случаях происходит схоже с формированием рубца у человека. Кроме того, кролики обладают хорошим иммунитетом, что важно при заживлении ран.
При проведении данного исследования продемонстрировано влияние ботулотоксина типа A на пролиферацию фибробластов и миофибробластов в рубцах. Сведения, полученные при выполнении работы, позволяют полагать, что в группе применения ботулотоксина типа A наблюдалось отчетливое снижение количества фибробластов и миофибробластов по сравнению с контрольной группой, что частично объясняет, почему ботулотоксин типа A улучшает итоговый вид рубца и подавляет рост гипертрофических и келоидных рубцов.
В данной статье представлены результаты исследования, направленного на выяснение причин позитивного влияния ботулотоксина типа A на формирование рубцов кожи в эксперименте. Тем не менее это исследование не отвечает на все вопросы. В частности, в дальнейшем целесообразно оценить молекулярные механизмы действия ботулотоксина типа A на ингибирование пролиферации фибробластов и миофибробластов. Оценка способности фибробластов к секреции коллагена in vitro, а также генетическое исследование экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) коллагеновых волокон смогли бы прояснить некоторые молекулярные механизмы действия ботулотоксина типа A.
Заключение
При проведении исследования установлено, что инъекции ботулотоксина типа A через 7 дней после операции позволяют уменьшить вероятность формирования гипертрофических рубцов кожи. Одной из точек воздействия ботулотоксина типа A, вероятно, оказывается влияние на количество миофибробластов, содержащихся в рубцовой ткани в стадиях пролиферации и ремоделирования внеклеточного матрикса.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Кораблева Н.П., Романенков Н.С., Кремлёв Д.И.
Сбор и обработка материала — Косулин А.В., Кремлёв Д.И., Мирошниченко М.С., Арбеков П.В.
Статистическая обработка данных — Коваленко А.П., Романенков Н.С.
Написание текста — Кремлёв Д.И., Некрасов А.А.
Редактирование — Кораблева Н.П., Романенков Н.С.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of authors:
Concept and design of the study — Korableva N.P., Romanenkov N.S., Kremlev D.I.
Data collection and processing — Kosulin A.V., Kremlev D.I., Miroshnichenko M.S., Arbekov P.V.
Statistical processing of the data — Kovalenko A.P., Romanenkov N.S.
Text writing — Kremlev D.I., Nekrasov A.A.
Editing — Korableva N.P., Romanenkov N.S.
Funding. The study had no sponsorship.
Список литературы:
- Li Y-H, Yang J, Liu J-Q, Xie S-T, Zhang Y-J, Zhang W, Zhang J-L, Zheng Z, Hu D-H. A Randomized, Placebo-Controlled, Double-Blind, Prospective Clinical Trial of Botulinum Toxin Type A in Prevention of Hypertrophic Scar Development in Median Sternotomy Wound. Aesthetic Plast Surg. 2018 Oct;42(5):1364-1369. Epub 2018 July 17. PMID: 30019241. https://doi.org/10.1007/s00266-018-1187-x
- Tawfik AA, Ali RA. Evaluation of botulinum toxin type A for treating post burn hypertrophic scars and keloid in children: An intra-patient randomized controlled study. J Cosmet Dermatol. 2023;22(4):1256-1260. https://doi.org/10.1111/jocd.15634
- Chen Z, Chen Z, Pang R, Wei Z, Zhang H, Liu W, Li G. The effect of botulinum toxin injection dose on the appearance of surgical scar. Sci Rep. 2021;11(1):13670. https://doi.org/10.1038/s41598-021-93203-x
- Kasyanju Carrero LM, Ma W-W, Liu H-F, Yin X-F, Zhou B-R. Botulinum toxin type A for the treatment and prevention of hypertrophic scars and keloids: Updated review. J Cosmet Dermatol. 2019;18(1):10-15. Epub 2018 Dec 12. PMID: 30548742. https://doi.org/10.1111/jocd.12828
- Wang Y-X, Wang Y, Zhang Q, Zhang R-D. Current Research of Botulinum Toxin Type A in Prevention and Treatment on Pathological Scars. Dermatol Surg. 2023;49(5S):S34-S40. https://doi.org/10.1097/DSS.0000000000003770
- Huang Y-L, Wallace CG, Hsiao Y-C, Lee M-C, Huang J-J, Chang FC-S, Chen ZC, Hu S, Chen J-P. Botulinum Toxin to Improve Lower Blepharoplasty Scar: A Double-Blinded, Randomized, Vehicle-Controlled Clinical Trial. Aesthet Surg J. 2021 Aug 13;41(9):1003-1010. PMID: 34128526. https://doi.org/10.1093/asj/sjab024
- Fu Z, Huang H, Huang J. Efficacy and safety of botulinum toxin type A for postoperative scar prevention and wound healing improvement: A systematic review and meta-analysis. J Cosmet Dermatol. 2022;21(1):176-190. https://doi.org/10.1111/jocd.14617
- Gauglitz GG, Korting HC, Pavicic T, Ruzicka T, Jeschke MG. Hypertrophic scarring and keloids: pathomechanisms and current and emerging treatment strategies. Mol Med. 2011;17(1-2):113-125. https://doi.org/10.2119/molmed.2009.00153
- Hinz B. The role of myofibroblasts in wound healing. Curr Res Transl Med. 2016;64(4):171-177. https://doi.org/10.1016/j.retram.2016.09.003
- Zhou N, Li D, Luo Y, Li J, Wang Y. Effects of Botulinum Toxin Type A on Microvessels in Hypertrophic Scar Models on Rabbit Ears. Biomed Res Int. 2020;2020:2170750. https://doi.org/10.1155/2020/2170750
- Yang Z, Lv Y, Yang Z, Cao L, Cao D. Concentration-Dependent Inhibition of Hypertrophic Scar Formation by Botulinum Toxin Type A in a Rabbit Ear Model. Aesthetic Plast Surg. 2022;46(6):3072-3079. https://doi.org/10.1007/s00266-022-03008-0
- Pan L, Qin H, Li C, Yang L, Li M, Kong J, Zhang G, Zhang L. Safety and efficacy of botulinum toxin type A in preventing and treating scars in animal models: A systematic review and meta-analysis. Int Wound J. 2022;19(4):774-781. https://doi.org/10.1111/iwj.13673
- Rozemond H. Laboratory animal protection: the European Convention and the Dutch Act. Vet Q. 1986;8(4):346-349. https://doi.org/10.1080/01652176.1986.9694067
- Gadhia K, Walmsley AD. Facial aesthetics: is botulinum toxin treatment effective and safe? A systematic review of randomised controlled trials. Br Dent J. 2009 Sept 12;207(5):E9; discussion 216-217. PMID: 19749689. https://doi.org/10.1038/sj.bdj.2009.813
- Tang-Liu DD-S, Aoki KR, Dolly JO, de Paiva A, Houchen TL, Chasseaud LF, Webber C. Intramuscular injection of 125I-botulinum neurotoxin-complex versus 125I-botulinum-free neurotoxin: time course of tissue distribution. Toxicon. 2003 Oct;42(5):461-469. PMID: 14529727. https://doi.org/10.1016/s0041-0101(03)00196-x
- Çalıskan E, Gamsızkan M, Açıkgöz G, Durmuş M, Toklu S, Doğrul A, Kurt A, Tunca M. Intralesional treatments for hypertrophic scars: comparison among corticosteroid, 5-fluorouracil and botulinum toxin in rabbit ear hypertrophic scar model. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2016;20(8):1603-1608.
- Liu D-Q, Li X-J, Weng X-J. Effect of BTXA on Inhibiting Hypertrophic Scar Formation in a Rabbit Ear Model. Aesthetic Plast Surg. 2017 June; 41(3):721-728. Epub 2017 Feb 08. PMID: 28180922. https://doi.org/10.1007/s00266-017-0803-5
- Youjin Z, Xiaoguang Y, Xiaojing Y, Dongmei F, Yuanhui W. Inhibitory effect of botulinum toxin type A on hypertrophic scar formation in rabbit ears. Genom Appl Biol. 2019;38(10):4785‐4789.
- Xiao Z, Qu G. Effects of botulinum toxin type A on collagen deposition in hypertrophic scars. Molecules. 2012 Feb 21;17(2):2169-2177. PMID: 22354193; PMCID: PMC6268678. https://doi.org/10.3390/molecules17022169
- Zhibo X, Miaobo Z. Botulinum toxin type A affects cell cycle distribution of fibroblasts derived from hypertrophic scar. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery: JPRAS. 2008 Sept;61(9):1128-1129. Epub 2008 June 13. PMID: 18555763. https://doi.org/10.1016/j.bjps.2008.05.003
- Zhibo X, Miaobo Z. Potential therapeutical effects of botulinum toxin type A in keloid management. Med Hypotheses. 2008;71(4):623. https://doi.org/10.1016/j.mehy.2008.04.018
- Shah M, Foreman DM, Ferguson MW. Neutralising antibody to TGF-beta 1,2 reduces cutaneous scarring in adult rodents. J Cell Sci. 1994 May; 107(Pt 5):1137-1157. PMID: 7929624. https://doi.org/10.1242/jcs.107.5.1137
- Lee B-J, Jeong J-H, Wang S-G, Lee J-C, Goh E-K, Kim H-W. Effect of botulinum toxin type a on a rat surgical wound model. Clin Exp Otorhinolaryngol. 2009 Mar;2(1):20-27. Epub 2009 Mar 26. PMID: 19434287; PMCID: PMC2671832. https://doi.org/10.3342/ceo.2009.2.1.20