Способ фотодинамического воздействия при хирургическом лечении местного отграниченного перитонита в эксперименте

С каждым годом растет число публикаций, посвященных проблеме стимуляции регенераторных процессов в гнойной хирургии, в частности при лечении местного отграниченного перитонита (МОП) и абсцессов различных локализаций [1, 2]. Так, сообщается об эффективном применении наночастиц металлов (НЧМ) и низкоинтенсивного лазерного излучение (НИЛИ) при лечении моделированных абсцессов [3], а также фотодинамическая терапия (ФДТ), применение которой ускоряет заживление ран, способствуя реэпителизации [4, 5]. Подтверждено локальное фотодинамическое действие метиленового синего, что благодаря подавлению роста бактерий и грибков благоприятно модулирует заживление раны [6]. Приводится количественная оценка эффективности местной низкодозной ФДТ при заживлении ран двухфотонным методом [7]. Однако в литературе имеется исследование, свидетельствующее, что ФДТ замедляет заживление кожных ран у мышей [8].

Известны способы лечения гнойных ран мягких тканей с использованием фотосенсиблизатора хлоринового ряда — фотодитазина [9], а также хлорина Е6, влияющего на агрегационную активность тромбоцитов [10]. Получила широкое распространение ФДТ в онкологии [11], в частности применение хлорина Е6 при лечении глиальных опухолей [12, 13]. Применяется также способ противомикробной ФДТ пиогенных абсцессов печени с помощью чрескожного чреспеченочного дренирования гнойника, причем доказана эффективность ФДТ при ее интраоперационном применении [14, 15]. Преимуществом этих способов является комплексное эндоскопическое малоинвазивное лечение гнойных осложнений органов брюшной полости [16], а недостатками — введение в патологический очаг больших объемов фотосенсибилизатора и длительность сеансов лечения. Для улучшения результатов лечения МОП следует разработать универсальный способ ФДТ, позволяющий достичь полного подавления патогенных микроорганизмов, облитерации полости и сокращения сроков лечения.

Цель исследования: обосновать новый способ применения ФДТ при послеоперационном лечении моделированного МОП.

Настоящее исследование выполнено на базе кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии ФГБОУ ВО «Саратовский медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России. Материалом настоящего исследования служили 80 лабораторных животных (белые крысы массой 200±50 г), которые разделены разделенных на 4 группы, по 20 животных в каждой. На проведение эксперимента получено разрешение локального этического комитета Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского (протокол ЛЭК №2 от 16.09.22). Уход за животными и проведение экспериментов осуществлялись согласно основным морально-этическим принципам проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированных в следующих документах: «Правила лабораторной практики в РФ» (Good Laboratory Practice), утвержденные приказом Министерства здравоохранения и социального развития от 23.08.10 №708н, и «Международные рекомендации по проведению биомедицинских исследований с использованием животных», принятые в 1985 г. Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS).

Моделирование МОП в хирургическом эксперименте проводили в соответствии с методикой, разработанной ранее [17]. В соответствии с целью исследования для комплексной оценки эффективности лечения использовали планиметрические, лабораторные, инструментальные, микробиологические и морфологические методы исследования.

Для определения объема полости МОП в ходе планиметрических исследований использовали градуированный шприц емкостью 3 мл. Полученный экспериментально объем моделированной полости составил в среднем 3,0 см³. Для комплексной планиметрической оценки полости использовали ультразвуковой аппарат производства экспертного класса Philips EpiQ7 (США) с конвексными датчиками, работающими с частотой 3,5 МГц. В ходе ультразвукового исследования (УЗИ) определяли диаметр сформированной полости и толщину фиброзной капсулы. Для контрастного исследования области моделированного абсцесса использовали также цифровой рентгенодиагностический комплекс Flexavision F3.

В целях оценки эффективности противомикробного воздействия ежедневно из гнойной полости получали материал для посева с последующим подсчетом численности микроорганизмов колониеобразующих единиц — КОЕ (log₁₀КОЕ) клинического штамма Staphylococcus aureus FDA 209Р. Проводили общелабораторные исследования крови (общий анализ крови — ОАК).

Морфологическое исследование. Биоптаты из области МОП фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина. Готовили парафиновые блоки по общепринятой методике после обезвоживания в серии спиртов возрастающей концентрации. Срезы препаратов толщиной 3—5 мкм депарафинизировали, окрашивали гематоксилином и эозином. Морфологический анализ препаратов проводили с использованием светового микроскопа.

Ранее мы экспериментально установили [2], что 0,24% концентрация рассеивающей среды, в качестве которой выбран интралипид, обеспечивает равномерное распределение НИЛИ по внутренней поверхности полости [3].

В эксперименте применяли комплекс НЧМ (меди, железа и цинка) предоставлены ФГУП РФ «Государственный научно-исследовательский институт химии и технологии элементоорганических соединений» (Москва). Синтез наночастиц основан на плазменной переконденсации сырья с последующим резким охлаждением парогазовой смеси. При данном способе синтеза 95% наночастиц имели средний размер 60—80 нм. Содержание наночастиц в 0,24% растворе интралипида — 1 мг/мл наночастиц в равномерном распределении (меди, железа и цинка — 1:1:1). НИЛИ обеспечивали аппаратом «Матрикс» с лазерной головкой КЛО4, центральной длиной волны 630 нм, мощность 30 мВт. Минимальное поглощение лазерного излучения наблюдается в спектральной области 400—1100 нм. Воздействие НИЛИ проводили в непрерывном режиме ежедневно по 2 мин в течение 14 сут. Комбинацию НИЛИ и НЧМ при лечении абсцессов осуществляли по запатентованной нами методике [18].

В эксперименте in vivo изучали действие красного светодиодного излучения — СИ (660 нм) с плотностью мощности 30 мВт/см² и 0,0001% метиленового синего (МС) на рост клеток исследуемого штамма S. aureus, проинкубированных в изотоническом растворе хлорида натрия и 0,24% растворе интралипида (ИЛ). ФДТ осуществляли сочетанием растворов ИЛ и МС в качестве фотосенсибилизатора с последующим воздействием СИ.

Обработка данных. Статистический анализ полученных данных проводили на основе оценки характера распределения значений исследуемых показателей в группах с последующей оценкой уровня статистической значимости межгрупповых различий. Характер распределения значений исследуемых показателей оценивали с помощью критерия W Шапиро—Уилка. Распределение признаков не соответствовало нормальному, поэтому для оценки наличия статистически значимых отличий использовали непараметрический критерий U Манна—Уитни.

Интерпретация результатов. Межгрупповые различия показателей считали статистически значимыми при p≤0,05, т.е. вероятности безошибочного прогноза 95% и более. Статистическую обработку полученных данных осуществляли программного обеспечения SPSS 17.0 (SPSS: An IBM Company, США).

Этапы исследования. Первым этапом двухнедельного лечения животных всех групп было вскрытие и аспирация содержимого из полости МОП. В 1-й (контрольной) группе проводили санацию полости МОП фурациллином с применением антибиотиков (бициллин 0,3 млн ЕД 1 раз в течение 14 дней). Во 2-й группе выполняли обработку полости 0,24% раствором интралипида с последующем применением НИЛИ.

В 3-й группе проводили обработку полости МОП 0,24% раствором интралипида с НЧМ с последующим НИЛИ.

ФДТ животным 4-й группы проводили по 15 мин в течение 14 сут после формирования МОП.

При исследовании ОАК установлено, что с 11-х суток лечения наблюдалось снижение уровня лейкоцитов, а СОЭ — с 7-х суток у животных 4-й группы, что свидетельствует о снижении уровня воспалительного процесса (табл. 1, 2). Полученные уровни лейкоцитов в 4-й группе свидетельствуют о снижении лейкоцитоза до 12,85×10⁹/л (p₁=0,0001). Мы связываем это с использованием при ФДТ светодиодного красного излучения (660 нм) малой мощности.

Таблица 1. Содержание лейкоцитов в исследуемых группах, ×10⁹/л*

Примечание. Здесь и в табл. 2: * — достоверность различий при попарном сравнении исследуемых групп (2-й, 3-й, 4-й группы) с 1-й (контрольной) группой, рассчитанная при помощи критерия Манна—Уитни при p<0,05. Уровень значимости различий между группами: p₁ — исследуемыми группами (2, 3, 4 группами) и 1-й (контрольной); p₂ — 2-й и 3-й; p₃ — 2-й и 4-й; p₄ — 3-й и 4-й.

Таблица 2. СОЭ в исследуемых группах*

При оценке микробиологических показателей КОЕ S. aureus FDA 209Р (log₁₀КОЕ) в 1-й день исследования наблюдалось увеличение их количества во всех исследуемых группах. Применение ФДТ, начиная с 7-х суток лечения, приводило к уменьшению числа КОЕ в 4-й исследуемой группе, а с 11-го по 14-й день наблюдалось интенсивное снижение числа КОЕ вплоть до полного прекращения роста микрофлоры (p₁=0,0001; табл. 3).

Таблица 3. Микробиологические показатели (log10КОЕ в 1 мл), влияющие на выживаемость клинического метициллинчувствительного штамма S.aureus

Примечание. Данные представлены в виде Median [Q₁; Q₃] (min—max).

Представляет интерес оценка изменения численности бактерий под действием СИ и используемых растворителей в эксперименте in vivo. Так, СИ несущественно влияло на рост клеток исследуемого штамма S. aureus, проинкубированных в изотоническом растворе хлорида натрия. В данном исследовании использовалась ультранизкая концентрация МС. Установлено, что даже незначительно количество фотосенсибилизатора позволяет достигнуть фотодинамического эффекта. Снижение численности S. aureus при использовании комбинации МС + изотонический раствор хлорида натрия составило 65% после 5-минутного облучения и не изменялось до 15 мин, данная комбинация обеспечивала уменьшение числа КОЕ на 75% после 30-минутного воздействия. Использование ИЛ вызывало видимое усиление фотодинамического эффекта МС после 15-минутного облучения (сокращение КОЕ на 68%) и к 30-минутному облучению обеспечивало гибель 85% бактериальной популяции (рис. 1).

Рис. 1. Действие красного светодиодного (660 нм) излучения на выживаемость клинического метициллинчувствительного штамма S. aureus в присутствии различных растворителей (p<0,05).

ФР — физиологический раствор; ИЛ —интралипид.

При сравнении динамики размеров моделированного МОП (абсцесса) брюшной полости по данным УЗИ установлено, что диаметр полости наиболее интенсивно начал уменьшаться с 7-х суток лечения лишь у животных 4-й группы, при этом полная облитерация полости достигнута к 14-м суткам лечения.

Кроме того, при УЗИ во 2-й группе животных на 1-й день лечения наблюдалось существенное утолщение стенки полости по сравнению с таковой у животных контрольной группы, однако с 7-го по 14-й день отмечено уменьшение размеров стенки.

У животных 3-й группы к 14-м суткам лечения толщина стенки достигла 3,61 мм, а в 4-й группе — 5,05 мм, что в 2 раза превышает размер стенки у животных 1-й группы (табл. 4). На момент завершения лечения лишь у животных 4-й группы имеются ультразвуковые признаки облитерированной полости.

Таблица 4. Ультразвуковые показатели в исследуемых группах в зависимости от варианта и срока лечения*

Примечание. * — достоверные различия между группой исследования и 1-й (контрольной) группой, рассчитанная при помощи критерия Манна—Уитни, при p<0,05. p₁ — для различий между исследуемой группой и I (контрольной) группой; p₂ — для различий между 2-й и 3-й группами; p₃ — для различий между 2-й и 4-й группами; p₄ — для различий между 3-й группой и 4-й группами.

Подтверждением достигнутой облитерации полости МОП у животных 4-й группы являются результаты контрастного рентгенологического исследования на 14-е сутки лечения. На рис. 2 представлены размеры полостей животных исследуемых групп в зависимости от сроков лечения.

На 15-е сутки после выведения из эксперимента во всех группах животных выполняли гистологическое исследование участков ткани в зоне гнойника.

Рис. 2. Сравнение показателей рентгеноконтрастного метода в исследуемых группах.

В 1-й (контрольной) группе вокруг полости отмечался воспалительный инфильтрат, по краям и у дна раны только появилась молодая грануляционная ткань и коллагеновые волокна на фоне выраженного ангиогенеза. Клеточный полиморфизм был представлен большим количеством фибробластов, тучных клеток. Картина гистологического препарата представлена на рис. 3, а.

Рис. 3. Данные гистологического исследования участков ткани в зоне гнойника. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 64,6×.

а — 1-я группа; б — 2-я группа; в — 3-я группа; г — 4-я группа.

При гистологическом исследовании ткани животных 2-й группы отмечено значительное разрастание соединительнотканной капсулы. Вокруг последней имелись единичные комплексы лейкоцитов и макрофагов, фибробластов (рис. 3, б).

При морфологической оценке препаратов животных 3-й группы отмечено незначительное количество фибрина и лейкоцитов. На границе стенки и содержимого определялась клеточная инфильтрация, грануляционная ткань, затем рыхлая соединительная, переходящая в плотную соединительную ткань. Вокруг выраженной капсулы, представленной разрастанием соединительной ткани, имеется зона дегенеративных изменений и участков скопления лейкоцитов (рис. 3, в).

В 4-й группе животных полость гнойника не определялась. При гистологическом исследовании полость абсцесса замещена соединительной тканью с большой сетью микроциркуляторного русла. Однако в перифокальных участках полости встречаются немногочисленные васкуляризированные коллагеновые волокна, окруженные фибробластами, тучными клетками и лейкоцитарным инфильтратом. Местами на границе мышечной и соединительной ткани определялись мельчайшие очаги воспалительной инфильтрации с преобладанием плазматических клеток, что подтверждает значительную пролиферацию полости (рис. 3, г).

При исследовании ОАК лишь в 4-й группе животных установлено снижение СОЭ (см. табл. 2) с 7-х суток и уровня лейкоцитов (см. табл. 1) с 11-х суток лечения, что свидетельствует о снижении уровня воспалительного процесса на фоне применения ФДТ с использованием светодиодного красного излучения (660 нм) малой мощности.

Изучая динамику обсемененности log₁₀КОЕ/мл в МОП, мы установили, что применение НИЛИ в сочетании с НЧМ у животных 3-й группы значительно подавляло рост бактерий, достигая 2,7 log₁₀КОЕ/мл (p₁=0,0001; см. табл. 3) на 14-е сутки лечения. Лишь у животных 4-й группы при фотодинамическом воздействии происходило снижение количества бактерий в экссудате из гнойной полости с 7-х по 11-е сутки лечения и достигало стерильности полости на 14-е сутки лечения (p₁=0,0001; см. табл. 3).

При оценке размеров полости МОП на 14-е сутки лечения у животных 3-й группы констатировано уменьшение объема полости до 7,0 мм (p₁=0,0001; см. табл. 4), тогда как применение ФДТ позволило полностью ее облитерировать. Таким образом, выявлена корреляция подавления роста микрофлоры и снижения объема полости МОП у животных 3-й и 4-й групп на 14-е сутки лечения.

Морфологическое исследование при МОП у животных 4-й группы в результате двухнедельной ФДТ показало, что внутренний слой соединительнотканной капсулы полости представлен обильно васкуляризированными коллагеновыми волокнами, местами на границе мышечной и соединительной ткани мельчайшие очаги воспалительной инфильтрации с преобладанием плазматических клеток, что подтверждает значительную пролиферацию. Эти данные свидетельствуют не только о бактерицидном действии комплекса метиленовый синий + интралипид + излучение, но и стимуляции образования соединительной ткани с большой сетью микроциркуляторного русла и множеством коллагеновых волокон.

Анализируя показатели ОАК, обсемененности МОП, сроки облитерации и данные морфологических исследований, мы установили, что применение предложенной нами схемы лечения животных 4-й группы позволило сократить сроки лечения по сравнению со схемой лечения животных 3-й группы на 4 сут. При этом у животных 1-й и 2-й групп перечисленные показатели не достигли лечебного эффекта даже к 14-м суткам лечения МОП.

Использованные при апробации способы применения фотодинамической терапии клинические и инструментальные методы исследования являются эффективными методами оценки результатов лечения моделированного местного отграниченного перитонита. Принципиально значимым является то, что описанный способ фотодинамической терапии обладает не только бактерицидным эффектом и ускоряет сроки облитерации, но и позволяет своевременно оценивать качество проводимой терапии и прекращать лечение в тот момент, когда положительный эффект уже достигнут. Контроль за скоростью заживления и качеством терапии представляется важным для экономии ресурсов в медицинских и ветеринарных учреждениях.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Мусаелян А.Г., Алипов В.В., Тучина Е.С.

Сбор и обработка материала — Мусаелян А.Г., Тучина Е.С., Алипов А.И., Грицай У.О., Гаджиева Э.Э., Гаспарян Б.Т., Рыхлов А.С., Мыльников А.М.

Написание текста — Мусаелян А.Г., Алипов В.В., Тучина Е.С., Алипов А.И., Грицай У.О., Гаджиева Э.Э., Гаспарян Б.Т.

Редактирование — Мусаелян А.Г., Тучина Е.С.

Participation of authors:

Concept and design of the study — Musaelyan A.G., Alipov V.V., Tuchina E.S.

Data collection and processing — Musaelyan A.G., Tuchina E.S., Alipov A.I., Gritsai U.O., Gadzhieva E.E., Gasparyan B.T., Rykhlov A.S., Mylnikov A.M.

Text writing — Musaelyan A.G., Alipov V.V., Tuchina E.S., Alipov A.I., Gritsai U.O., Gadzhieva E.E., Gasparyan B.T.

Editing — Musaelyan A.G., Tuchina E.S.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.