Введение

Коронарная болезнь сердца сохраняет ведущие позиции в структуре смертности и причин стройкой нетрудоспособности населения в экономически развитых странах. Это почти 30% всех случаев смерти лиц старше 35 лет [1]. Зачастую коронарная болезнь сердца сопровождается частичной или полной блокадой кровотока по магистральным коронарным артериям вследствие разрыва атеросклеротической бляшки, приводя к формированию инфаркта миокарда (ИМ). В свою очередь тяжелые нарушения кровообращения вследствие ИМ [2] приводят к нарастающей гибели кардиомиоцитов и запускают каскад постишемического ремоделирования органа, часто проявляющегося дилатацией левого желудочка, гипертрофией миокарда, образованием фиброзной несокращающейся рубцовой ткани [3]. Ремоделирование сердца имеет большое значение как для патологически измененных, так и первично интактных областей сердца и может приводить к развитию тяжелой хронической сердечной недостаточности [4].

В последние годы регенеративные методы, основанные на мультипотентных и плюрипотентных стволовых клетках, показали многообещающие результаты в опытах как in vivo, так и in vitro, хотя и с невысоким потенциалом к их клинической трансляции [5]. Однако большие успехи в разработке терапевтических стратегий по поддержке инфарцированных тканей и нарушенных электромеханических процессов в органе вселяют надежды в умы исследователей.

Тканевая кардиоинженерия включает разработку временных биомиметических скафолдов, которые позволяют оптимизировать и организовывать локальные процессы клеточного роста и дифференцировки [4]. Как правило, подобные конструкции призваны механически поддерживать зону инфаркта, минимизировать процессы ремоделирования сердца, сохранять сократительную функцию органа [6]. Однако полное восстановление исходной структурно-функциональной организации сердечной мышцы остается спорным и далеким от решения вопросом вследствие главным образом чрезвычайной сложности структуры, биохимических и биофизических свойств миокардиального окружения [7].

В частности, среди непременных требований к рассматриваемым конструкциям необходимо отметить хорошую переносимость и приживаемость, высокое сопротивление и устойчивость к повторяющейся ритмической нагрузке сокращающегося сердца [8]. В то же время дополнительными и не менее важными аспектами при создании скафолдов являются биосовместимые материалы, способные к биодеградации в заданных временных границах. Современные биоинженерные технологии позволяют использовать с целью формирования сердечно-сосудистых заплат как населенные клетками материалы, так и неклеточные структуры синтетического или биологического происхождения [9].

В то же время поскольку ключевым физиологическим процессом в миокарде является электромеханическое сопряжение, которое и обусловливает возможность реализации сократительной функции миокарда, альтернативные стратегии, позволяющие поддерживать электрическую проводимость в зоне инфаркта, также должны учитываться при конструировании биоскафолдов [10]. Такие проводящие структуры были сконструированы и апробированы в условиях эксперимента [11]. При этом оказалось, что некоторые скафолды, созданные из электропроводящих полимеров (полипироллы, полианилин, углеродные нанотрубки), могут вызывать цитотоксические реакции [12]. Более того, нанокомпозитные гидрогели могут даже терять проводимость вследствие деформации и увеличения расстояния между входящими в их структуру наночастицами [13].

Другой важный вызов, с которым сталкиваются разработчики биоматериалов для сердечно-сосудистой практики, — необходимость восстановления исходной фибриллярной топографии миокарда, обеспечивающей синхронные электромеханические процессы в органе в продолжение сердечного цикла. Проблема заключается в неоднородности экстрацеллюлярного матрикса миокарда, составленного из коллагеновых волокон 1-го и 3-го типов, имеющих неравномерный диаметр, длину и расположение и обеспечивающих фиксацию, миграцию и пространственную организацию клеток. В связи с этим многочисленные микротехнологические подходы были использованы для создания скафолдов с нано- и микротканевой архитектурой [14]. Среди таковых наиболее распространенным методом производства скафолдов является метод электроспиннинга, позволяющий создавать заплаты с заданными поверхностными свойствами и определенной пространственной структурой [15].

Помимо сложностей с разработкой биоскафолдов для сердечно-сосудистой хирургии существуют серьезные лимитирующие обстоятельства, связанные с фиксацией структуры к поврежденному участку сердца или сосуда, использования того или иного шва, клипсы, что ведет к последующей травматизации ткани, риску развития кровотечения и инфекции.

Описанные обстоятельства обусловливают чрезвычайно высокую важность продолжения исследований в указанной области. Так, изучение биосовместимости и эффективности применения инновационных биоскафолдов, разработанных учеными Московского института электронной техники, является предметом настоящего исследования.

Материал и методы

В работе были использовано 40 особей белых лабораторных крыс обоего пола, разделенных на четыре группы: 1-я — животные с имплантированной биодеградируемой тканеинженерной конструкции (ТК) без клеток, 2-я — животные с окклюзией левой коронарной артерии (ОЛКА), 3-я — животные с ОЛКА с имплантированной ТК без стволовых клеток, 4-я — животные с ОЛКА с имплантированной ТК, заселенной клетками. Животных наркотизировали и укладывали на подогреваемый операционный столик производства фирмы «PrecisionInstruments» (США) [16], интубировали и переводили на искусственную вентиляцию «ТОРО» («KentScientific», США). Осуществляли доступ к бедренной вене и катетеризировали ее венозным катетером, который подключали к программируемому электронному инжектору. В четвертом межреберье слева проводили торакотомию, а затем перикардиотомию. С помощью иглы круглого сечения капроновой лигатурой прошивали левую коронарную артерию (ЛКА) в области ушка сердца. О формировании инфаркта судили по изменения на электрокардиограмме (рис. 1).

Рис. 1. Моделирование острого повреждения сердца с фиксацией трехмерных клеточно- и тканеинженерных конструкций.

а — уровень перевязки левой нисходящей артерии (ЛКА); б — область имплантации ТКТК; в — ЭКГ до перевязки ЛКА; г — ЭКГ после перевязки ЛКА (стрелкой показан подъем сегмента ST).

На переднебоковую стенку левого желудочка узловыми швами фиксировали фрагмент ТК размером 3×2 мм. Рану послойно ушивали, животных переводили на спонтанное дыхание.

С целью мониторинга общего состояния животных после имплантации ТК и возможных нежелательных реакций в плазме крови животных всех групп изучали концентрацию аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), общего белка, альбумина, общего билирубина, креатинина и мочевины сухим способом на автоматическом ветеринарном биохимическом экспресс-анализаторе FUJI-DRI-CHEM 4000ie (Япония). Осуществляли мониторирование артериального давления, электрокардиограммы (ЭКГ) неинвазивным способом. На 4-е, 8-е и 12-е сутки животных выводили из эксперимента, забирали фрагменты из поврежденных (места фиксации ТК) и неповрежденных участков сердца животных размером до 1 см³ и фиксировали в нейтральном забуференном 10% растворе формалина на протяжении 48 ч. Гистологическую проводку биологического материала осуществляли в автоматическом режиме с использованием автоматической станции марки STP-120 (типа «Карусель», Германия), последующую парафинизацию блоков также проводили автоматически, применяли систему EC350 (Германия). Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином по Хеллендахелю. Для иммуногистохимических исследований (ИГХИ) использовали мышиные антитела к Ki-67 (клон ММ1, «NovoCastra», Великобритания), фактор роста эндотелия сосудов — VEGF MonoclonalAntibody (клон JH121, «Invitrogen», США) и ядерный антиген пролиферирующих клеток — PCNA (клон PC10, «Dako», Дания, разведение 1:100). Анализ иммуногистохимической реакции выполняли в 6 полях зрения (по 3 поля из зоны имплантации ТК и по 3 — из периферических отделов сердца) при увеличении ×100 и ×200 на микроскопе Olympus BX51 (Япония).

Результаты

В группе животных с окклюзией ЛКА летальность составляла 20%. Имплантация ТК, заселенной клетками и без клеточных элементов, не вызвала гибели животных ни в одной из экспериментальных групп. Кроме того, на всех сроках наблюдения за животными не регистрировали увеличения сывороточной концентрации печеночных трансаминаз, что свидетельствовало об отсутствии цитолитического синдрома. Концентрация общего билирубина в плазме периферической крови не повышала референсных значений, что на фоне неизменной активности ЩФ служило подтверждением отсутствия признаков эндогенной интоксикации. Уровень общего белка в крови не изменялся на фоне имплантации конструкций животным. Кроме того, регистрировали отсутствие динамики концентрации мочевины и креатинина, глюкозы и холестерина.

Через 4 нед после окклюзии ЛКА в гистологических препаратах сердца крыс, окрашенных гематоксилином и эозином, на фоне диффузного разрастания соединительной ткани с выраженной пролиферацией соединительнотканных элементов сохранялись участки некроза кардиомиоцитов, представляющие собой набухшие, с потерей ядер и поперечной исчерченности, бесструктурные образования. В сердце крыс с ОЛКА и ТК без клеток также сохранялись очаги ишемии и некроза, наблюдались умеренная воспалительная инфильтрация, слабовыраженный кардиосклероз, неравномерная гипертрофия кардиомиоцитов, новообразованием тонкостенных сосудов с небольшим количеством макрофагов и гемосидерофагов. При ИГХИ и окрашивании на Ki-67 количество положительно окрашенных клеток в миокарде составляло 1—2%. Экспрессия PCNA гладкими мышечными клетками сосудов не зафиксирована. Наблюдали умеренную экспрессию VEGF в эндотелии сосудов и в миокарде, что свидетельствует об активном росте сосудов. Иммуногистологическая картина в группе животных с ОЛКА и ТК, заселенной клетками, характеризовалась большей активностью пролиферативных процессов, о чем свидетельствовало увеличение Ki-67-позитивности до 2—3% положительно окрашенных клеток в миокарде, экспрессии PCNA гладкими мышечными клетками сосудов и VEGF в эндотелии сосудов и в миокарде (рис. 2).

Рис. 2. Индексы пролиферации на основании оценки интенсивности окрашивания на PCNA и VEGF.

Различия статистически значимы (p<0,05) при сравнении * — с контролем (одномерный дисперсионный анализ, критерий Даннета); ^f — с соответствующими группами тканевой ТКТК (тТКТК) на одинаковых сроках наблюдения статистически значимы (одномерный дисперсионный анализ, парный критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони). кТКТК — клеточная ТКТК.

Через 8 нед после имплантации заселенной клетками ТК, по результатам морфометрии, воспалительная инфильтрация снижалась, наблюдались слабовыраженный кардиосклероз, неравномерная гипертрофия кардиомиоцитов. Визуализировались частично деградирующие наложения на миокард, с ПАС+ коллагеновыми волокнами. Кроме того, отмечались явления кардиосклероза субэндокардиальных отделов миокарда левого желудочка и слабовыраженного периваскулярного кардиосклероза.

Морфологические изменения в группе животных с ОЛКА и ТК без клеток характеризовались более выраженной воспалительной инфильтрацией, умеренным кардиосклерозом при сравнении с 4-й группой (рис. 3).

Рис. 3. Морфологическая и иммуногистохимическая картина сердца крыс с острым инфарктом миокарда и имплантированными ТКТК на 4-й, 8-й и 12-й неделях наблюдения.

Через 12 нед после имплантации клеточно-инженерной ТК сохраняется только субэндокардиальный и периваскулярный кардиосклероз с лимфогистиоцитарной инфильтрацией. Ткани ТК полностью деградируют. Наблюдается выраженная васкуляризация области повреждения и прикрепления клеточно-инженерной ТК (см. рис. 2). Имплантация ТК без клеток в зону ишемии приводила к выраженному крупноочаговому кардиосклерозу и перимускулярному склерозу вблизи не до конца деградированного ТК, а также сохранялась умеренная лимфогистиоцитарная воспалительная инфильтрация на фоне умеренной васкуляризации области повреждения и прикрепления тканеинженерной ТК (см. рис. 3).

Заключение

Таким образом, имплантация тканеинженерных конструкций на сердце в области острой ишемии миокарда и формирующегося инфаркта миокарда влечет активацию регенерации в месте повреждения, в том числе с индукцией неоангиогенеза. На фоне имплантации тканеинженерной конструкции как с клетками, так и без них не развивалась эндогенная интоксикации, что свидетельствует об отсутствии токсического воздействия на организм и безопасности применения данной конструкции. Кроме того, использование клеточно-инженерной и тканеинженерной конструкций приводит к индукции дифференцировки кардиомиоцитов и фибробластов и васкуляризации в области ишемического повреждения миокарда. Имплантация клеточно-инженерной и тканеинженерной конструкций ведет к статистически более значимой активации указанных процессов преимущественно на 8-й и 12-й неделях наблюдения и является перспективным методом для стимулирования заживления и восстановления поврежденных тканей при ишемии сердца.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.В. Блинова, А.В. Николаев

Сбор и обработка материала — Е.В. Галицкий, О.В. Кытько, А.В. Миронцев, А.И. Соколов, Е.А. Коган

Статистическая обработка — Д.О. Шматок

Написание текста — Е.В. Блинова

Редактирование — А.Ю. Герасименко

Participation of authors:

Concept and design of the study — E.V. Blinova, A.V. Nikolaev

Data collection and processing — E.V. Galitsky, O.V. Kytco, A.V. Mirontsev, A.I. Sokolov, E.A. Kogan

Statistical processing of the data — D.O. Shmatok

Text writing — E.V. Blinova

Editing — A.Yu. Gerasimenko

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.