Витамин А (ретинол) и его аналоги обладают дозозависимой токсичностью [1], что накладывает ограничения на их клиническое применение. Сведения о проявлениях острой и хронической токсичности ретинола у человека и животных можно найти в обзорах литературы [2—4]. Вместе с тем показано, что ретинол в повышенных дозах может оказывать негативное воздействие на клетки и ткани организма до появления клинических признаков гипервитаминоза А [5]. В связи с этим востребован поиск методов прогноза развития данного состояния.

Обладая липофильными свойствами, биологически активные формы витамина А являются мембранотропными соединениями [6]. Для исследования цитотоксичности мембранотропных ксенобиотиков часто используют эритроциты [7]. В норме вязкоупругие свойства и текучесть мембраны определяют способность двояковогнутых эритроцитов к обратимой деформации, а снижение такой способности отражается на их морфологических характеристиках [8]. Поэтому результаты анализа морфологических изменений эритроцитов, возникающих в ответ на введение в организм препаратов ретинола, могут служить индикатором их дозозависимой токсичности и быть использованы в качестве прогностических критериев развития гипервитаминоза А.

Цель исследования — изучить динамику изменений эритроцитов при передозировке ретинола пальмитата.

Материал и методы

Эксперимент проведен на 18 крысах-самцах линии Wistar, полученных из филиала «Столбовая» ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России. Содержание и манипуляции с животными осуществлялись в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики(Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04. 2016 г.). После адаптации в течение 1 нед к условиям вивария животные были распределены на две группы по 9 особей в каждой. Исходная средняя масса тела крыс составляла 120,9±2,6 г. В сформированных группах масса тела животных изначально не различалась (p=0,8), а ее последующие изменения регистрировались в ходе эксперимента.

Для моделирования гипервитаминоза А использовали масляный раствор ретинола пальмитата. Препарат в дозе 150 тыс. МЕ, содержавшихся в 0,3 мл раствора, вводили с помощью мягкого зонда через рот в течение 6 дней. Учитывая возможное воздействие на эритроциты вспомогательных веществ раствора ретинола пальмитата (рапсовое масло с антиоксидантами — масляная основа), в качестве контрольной группы были использованы животные, получавшие масляную основу в том же объеме.

Каплю крови для изготовления мазков получали из прокола вены хвоста стерильным скарификатором с глубиной прокола 2,0 мм. После высушивания мазки фиксировали в течение 15 мин в 96% этаноле. Окрашивание мазков крови от экспериментальных и контрольных животных раствором Лейшмана (эозин метиленовый синий) проводили одновременно. Используя аппаратно-программный комплекс DiaMorph Cito (ЗАО «ДиаМорф», Россия), на оцифрованных снимках мазков крови измеряли геометрические и оптические параметры эритроцитов-дискоцитов, позволяющие получить интегральную характеристику их морфологической и функциональной сохранности и тем самым количественно оценить ранние проявления и характер реакции эритроцитов на воздействие. Такими показателями служили стандартные морфоденситометрические параметры: площадь проекции дискоцита на плоскость, площадь его пеллора — вогнутого центрального участка цитоплазмы, соотношение этих двух параметров и интегральная оптическая плотность цитоплазмы. Кроме того, анализировали параметры, характеризующие профиль дискоцита: кривизну восходящей и нисходящей части тора — выпуклого периферического участка дискоцита, кривизну пеллора, площадь поверхности, объем и их соотношение. Данные морфоденситометрического анализа использовали для компьютерной реконструкции трехмерного профиля дискоцитов.

Для увеличения контраста оцифрованных изображений применяли светофильтр с максимумом пропускания в интервале от λ=530 до λ=580 нм. Используя иммерсионный объектив ×90, в мазках крови каждого животного измеряли морфоденситометрические параметры 30 дискоцитов, находящихся в соседних полях зрения центрального участка мазка. Объем выборки (число анализируемых клеток, число животных) был рассчитан при планировании эксперимента по результатам анализа индивидуальной и групповой дисперсии параметров дискоцитов у 10 интактных крыс с учетом 5% допустимой погрешности.

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы IBM PASW Statistics ver. 18.0.0. Для оценки значимости различий средних арифметических двух выборок использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. За критический уровень доверительной вероятности было принято p≤0,05.

Результаты

Первые признаки передозировки ретинола пальмитата были зарегистрированы у крыс на 5-й день после начала его введения. Отмечались изменение поведенческих реакций, учащенное дыхание и снижение массы тела животных. Динамика массы тела в экспериментальной группе и в контроле представлена на рис. 1. Статистически значимые (p=0,001) различия этого показателя в группах были выявлены на 5-й и 6-й дни наблюдения. Масса тела крыс, получавших ретинола пальмитат, составляла в эти дни 87% (117/134) и 80% (114/143) от уровня в контроле.

Значения морфоденситометрических параметров дискоцитов у животных контрольной и экспериментальной группы приведены в таблице. Из представленных в ней данных следует, что на протяжении эксперимента динамика и характер изменений параметров, характеризующих морфофункциональное состояние дискоцитов, были неодинаковыми. Так, при передозировке ретинола пальмитата средние значения площади проекции дискоцитов на плоскость в обеих группах существенно не различались в течение всех дней наблюдения. При этом вследствие значимого снижения площади пеллора на 5—6-й день соотношение этих параметров также уменьшилось. Интегральная оптическая плотность цитоплазмы дискоцитов в эти же дни оказалась значимо сниженной. Рост средних значений кривизны восходящего и нисходящего участков тора был зарегистрирован раньше (3—4-й день) изменений стандартных геометрических и оптических параметров клеток. Значения кривизны пеллора снизились на 6-й день введения ретинола пальмитата. В совокупности следствием изменения кривизны различных участков профиля дискоцитов стало изменение их формы, что наглядно демонстрируют результаты реконструкции трехмерного профиля клеток (рис. 2). К концу эксперимента форма дискоцитов крыс, получавших ретинола пальмитат, характеризовалась снижением высоты клеток в области тора, утолщением пеллора с одновременным уменьшением его площади. Изменение кривизны профиля дискоцитов сопровождалось уменьшением площади их поверхности и объема (с 3-го дня). При этом соотношение двух параметров оставалось неизменным до 6-го дня, когда этот показатель статистически значимо снизился.

В зависимости от продолжительности введения ретинола пальмитата изменения морфоденситометрических параметров дискоцитов возникали неодновременно. В частности, средние значения кривизны восходящей и нисходящей части тора, а также площади поверхности и объема дискоцитов начали существенно отличаться от показателей в контрольной группе до появления признаков передозировки препарата (3—4-й день). Изменения остальных параметров дискоцитов совпали по времени с первыми симптомами гипервитаминоза А (5—6-й день).

Обсуждение

Использованная доза ретинола пальмитата позволила за короткое время смоделировать у крыс состояние гипервитаминоза А и сопоставить морфологические изменения эритроцитов в отсутствие видимых признаков токсического действия ретинола пальмитата (доклиническая стадия) и на момент возникновения первых симптомов его передозировки. Наиболее показательным из них было снижение массы тела животных, что является неспецифическим критерием развивающегося гипервитаминоза А [2, 3]. Поступающий в организм ретинол в виде эфиров депонируется в печени, а затем в комплексе с ретинолсвязывающим белком транспортируется к органам [9]. У молодых крыс ретинол рециркулирует в крови более продолжительное время, чем у взрослых [10], в связи с чем его содержание в крови может быть значительно выше. Это одна из причин более быстрого развития гипервитаминоза А в молодом возрасте и при приеме меньших доз ретинола, чем во взрослом [4]. Исходная масса тела крыс, использованных в данном исследовании, соответствовала приблизительно возрасту 1,5—2 мес [11], следовательно, появление симптомов гипервитаминоза А через 5—6 дней после начала введения ретинола пальмитата было обусловлено не только его передозировкой, но и возрастом животных.

Анализ морфометрических параметров дискоцитов крыс экспериментальной группы позволил оценить степень их морфологической сохранности. В течение всех дней наблюдения площадь проекции дискоцитов на плоскость статистически значимо не различалась с показателями в контроле. Вместе с тем изменения таких параметров, как кривизна тора в восходящем и нисходящем участке, кривизна и площадь пеллора, его соотношение с площадью проекции дискоцита на плоскость, свидетельствовали о постепенном изменении формы клеток, что связано с модифицирующим действием ретинола пальмитата на эритроцитарную мембрану. В присутствии ретинола вязкоупругие свойства и текучесть эритроцитарной мембраны меняются вследствие увеличения содержания в ней холестерина [12], фосфолипидов и перераспределения последних в липидном бислое [13], что отражается на способности эритроцитов к обратимой деформации [14].

Помимо изменения вязкоупругих свойств мембраны способность эритроцитов обратимо менять форму зависит от концентрации гемоглобина [15]. Поскольку показателем содержания гемоглобина в эритроцитах является интегральная оптическая плотность цитоплазмы [16], снижение значений этого параметра дискоцитов при передозировке ретинола пальмитата свидетельствовало о более низком содержании в них гемоглобина и совпало по времени с появлением у крыс признаков гипервитаминоза А.

Критериями степени деформированности эритроцитов служат площадь их поверхности и ее соотношение с объемом [17, 18]. Полученные результаты свидетельствуют о снижении обоих параметров в дискоцитах крыс экспериментальной группы с 3-го дня эксперимента. Характерно, что темпы уменьшения площади поверхности и объема дискоцитов были идентичными, так как их соотношение на протяжении всего срока наблюдения оставалось неизменным и значимо снизилось лишь на 6-й день. Это служит основанием полагать, что изменение деформабельных свойств эритроцитов на доклинической стадии гипервитаминоза А, вызванного передозировкой ретинола пальмитата, не критично и, скорее всего, обратимо.

Следует отметить асинхронность изменений морфоденситометрических параметров дискоцитов, возникающих на фоне ежедневного ведения животным ретинола пальмитата. Установлено, что значения почти всех измеренных параметров дискоцитов у животных экспериментальной группы претерпели изменения одновременно с появлением признаков передозировки препарата. В отсутствие этих признаков статистически значимые различия с контролем имели только кривизна восходящей и нисходящейчасти тора дискоцитов, площадь их поверхности и объем, что подтверждает данные литературы о токсических эффектах ретинола на доклинической стадии гипервитаминоза А [5] и указывает на возможность использовать изменения этих параметров в качестве прогностических критериев передозировки ретинола пальмитата.

Выявленные изменения морфоденситометрических параметров дискоцитов являются неспецифическими. Подобные изменения могут возникать под воздействием разнообразных факторов, имея при этом иную направленность и степень выраженности. Поэтому при использовании эритроцитов в качестве объектов морфоденситометрического анализа и выборе прогностических критериев, позволяющих отличить норму от патологии, целесообразно в каждом случае оценивать характер их морфологических изменений с учетом природы воздействующего фактора и продолжительности его воздействия.

Заключение

При ежедневном пероральном введении масляного раствора ретинола пальмитата в дозе 150 тыс. МЕ симптомы гипервитаминоза А возникают у крыс с исходной средней массой тела 120 г на 5—6-й день. К моменту появления этих симптомов дискоциты периферической крови деформируются, что подтверждается совокупностью изменений их морфоденситометрических параметров. Очередность появления этих изменений зависит от продолжительности введения ретинола пальмитата. Изменения кривизны тора и пеллора дискоцитов, их площади поверхности и объема возникают на доклинической стадии гипервитаминоза А, смоделированного передозировкой ретинола пальмитата, и могут служить прогностическими критериями его развития.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Н. Яцковский

Сбор и обработка материала — Т.А. Ломановская.

Статистическая обработка — Т.А. Ломановская.

Написание текста — Т.В. Боронихина.

Редактирование — А.Н. Яцковский.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.