На протяжении многих лет как в большинстве стран мира, так и в России отмечается рост заболеваемости и смертности от рака шейки матки (РШМ). Согласно прогнозам, основанным на данных GLOBOCAN, к 2040 г. уровень этих показателей может увеличиться почти на 50% по сравнению с уровнем 2018 г. [1, 2]. Особенно удручающая картина наблюдается в возрастной группе 15—39 лет, где отмечены наиболее высокие показатели заболеваемости и смертности [1, 3]. Профилактика и ранняя диагностика лежат в основе решения проблемы снижения смертности от РШМ. Однако следует отметить, что высокая агрессивность РШМ не всегда позволяет гарантировать благоприятный прогноз заболевания даже при выявлении этой патологии на ранних стадиях. Для улучшения отдаленных результатов лечения РШМ необходима точная оценка риска рецидива заболевания, при этом точность прогноза при использовании рутинных факторов не всегда высокая. В связи с вышесказанным актуальным является поиск новых прогностических маркеров.
Известно, что основной причиной смерти от злокачественных новообразований является метастазирование, которое самым непосредственным образом связано с опухолевым ангиогенезом [4—7]. Несмотря на многочисленные исследования данного вопроса при различных злокачественных новообразованиях [8—12], однозначных результатов оценки активности ангиогенеза при РШМ получить не удалось [13—17]. Возможно, это связано с тем, что авторы использовали преимущественно количественные методы оценки, в частности определение плотности опухолевых микрососудов, выраженности экспрессии фактора роста эндотелия сосудов, пролиферативной активности эндотелиальных клеток и др. [18]. Между тем известно, что сосуды в опухоли гетерогенны и различаются по происхождению, морфологии и клинической значимости. Однако при РШМ гетерогенность опухолевых микрососудов и их связь с клинико-морфологическими характеристиками и прогнозом заболевания остаются малоизученными.
Цель исследования — установить особенности морфологии опухолевых микрососудов и их корреляции с клинико-морфологическими характеристиками и прогнозом РШМ I—IIA стадии.
Материал и методы
В ретроспективное одноцентровое когортное исследование были включены 76 пациенток с впервые выявленным РШМ I—IIA стадии, радикально оперированных в ГБУЗ ООКОД в период с 2008 по 2013 г., не получившие неоадъювантную терапию. Средний возраст пациенток 45,6±13,8 года, медиана 45 лет. Согласно Международной классификации по системе TNM (7-е издание, 2009) и системы Международной федерации акушеров и гинекологов (FIGO, 2009), распределение пациенток по стадиям заболевания было следующим: IA стадия — 30 (39,5%), IB — 37 (48,7%) и IIA — 9 (11,8%). Гистологическая структура опухоли была представлена плоскоклеточным раком в 65 (85,5%) случаях, аденокарциномой в 11 (14,5%). У 19 (25%) пациенток опухоль была высокодифференцированной (G1), у 45 (59,2%) — умеренно-дифференцированной (G2) и у 12 (15,8%) — низкодифференцированной (G3). Всем пациенткам были выполнены радикальные операции: расширенная гистерэктомия с придатками 33 (43,4%), расширенная гистерэктомия без придатков 14 (18,4%), простая гистерэктомия с придатками 25 (32,9%) и расширенная трахелэктомия 4 (5,2%). Адъювантную лучевую терапию получили 37 (48,7%) пациенток, адъювантную химиотерапию — 7 (9,2%).
У 7 (9,2%) пациенток в сроки от 5 до 43 мес после завершения лечения был диагностирован рецидив РШМ. Все эти пациентки умерли в течение 12—72 мес после окончания лечения; 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость была идентична и составила 90,8%, медиана периода наблюдения — 109 мес.
Морфологическое исследование выполнено на архивных парафиновых блоках. Срезы толщиной 4—5 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Иммуногистохимические исследования выполняли в соответствии с протоколами производителей с использованием антител к CD34 в разведении 1:100 («Cloud-Clone Corp», Техас, США); к подопланину — 1:50 («Cloud-Clone Corp», Техас, США); к Snail1 — 1:100 («Cloud-Clone Corp», Техас, США) и к HIF1α — 1:200 («Cloud-Clone Corp», Техас, США). Окрашивание проводили с использованием Autostainer 480 («Thermo Fisher Scientific Ltd., Вантаа, Финляндия). Для визуализации первичных антител использовании систему NovolinkTM («Leica Biosystems», Ньюкасл, Великобритания). Для отрицательного контроля первичные антитела заменяли фосфатным буфером и обрабатывали аналогичным образом. Позитивным контролем для антител к CD34 служило окрашивание эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, для антител к Podoplanin — окрашивание сосудов ткани РШМ без элементов красной крови. Препараты изучали с помощью цифрового микроскопа Levenhuk D740T, оснащенного видеокамерой 5,1 Мпикс («Levenhuk», Россия). Все гистопрепараты оценивали, не имея информации о клинических и морфологических характеристиках пациенток.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программы Statistica 6. Для выражения числовых показателей использовали среднее выборочное (М) и стандартное отклонение (σ). Для оценки связи между показателями использовали методы ранговой корреляции по Спирмену и Гамма-тест, для сравнения различий показателя между группами — тесты медианный и Манна—Уитни. С использованием критерия χ2 оценивали достоверность различий частоты признака в обследуемых группах. Для анализа общей и безрецидивной выживаемости использовали метод Каплана—Мейера. Long-Rank-тест использовали для сравнения показателей выживаемости между группами пациенток. Различия между показателями считали достоверными при p≤0,05.
Результаты и обсуждение
Изучение особенностей ангиогенеза при РШМ I—IIA стадии позволило выделить 8 типов опухолевых микрососудов и структур с эндотелиальной выстилкой (см. рис. 1, а—з, на цв. вклейке).
Рис. 1. (a—e). Разные типы опухолевых микрососудов.
а — обычные микрососуды; б — дилатированные капилляры; в — микрососуды со слабовыраженной экспрессией CD34; г — микрососуды контактного типа; д — микрососуды в солидном компоненте опухоли; е — атипичные дилатированные капилляры. ИГХ-окраска с антителами к CD34, ×800.
Рис. 1. (ж—з).Разные типы опухолевых микрососудов.
ж — структуры с частичной эндотелиальной выстилкой; з — лимфатические капилляры в лимфоидных и полиморфно-клеточных инфильтратах. ИГХ-окраска с антителами к CD34, ×800.
В табл. 1 представлены данные об особенностях морфологии разных типов опухолевых микрососудов и их корреляции с клинико-морфологическими характеристиками РШМ и прогнозом заболевания.
Таблица 1. Особенности морфологии разных типов опухолевых микрососудов и их корреляция с клинико-морфологическими характеристиками и прогнозом рака шейки матки
| Типы и особенности морфологии опухолевых микрососудов и структур с эндотелиальной выстилкой | Корреляция с клинико-морфологическими характеристиками и прогнозом рака шейки матки |
| Обычные микрососуды (см. рис. 1, а, на цв. вклейке): диаметр 5—40 мкм, контуры четкие, ровные, клетки эндотелиальной выстилки уплощенные с гиперхромными ядрами, экспрессия CD34 и подопланина равномерная, интенсивная, расположены в интра- и перитуморальной строме | Не выявлена |
| Дилатированные капилляры (см. рис. 1, б, на цв. вклейке): диаметр 40 мкм и больше (средний диаметр 101,9±52,2 мкм), контуры четкие, ровные, клетки эндотелиальной выстилки уплощенные с гиперхромными ядрами, экспрессия CD34 и подопланина равномерная, интенсивная, расположены в интра- и перитуморальной строме | Не выявлена |
| Микрососуды со слабовыраженной экспрессией CD34 (см. рис. 1, в, на цв. вклейке): диаметр 59,4±29,6 мкм, клетки эндотелиальной выстилки с крупными светлыми ядрами с нежно-сетчатой структурой хроматина, экспрессия CD34 выражена слабо, экспрессии подопланина нет, расположены в рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани, имеющей характерное ячеистое строениеРРЦ | Стадия (p<0,00001), глубина инвазии опухоли (p=0,000002), гистологический тип опухоли (p=0,002), лимфоваскулярная инвазия (ЛВИ) (p=0,003), феномен фрагментации в солидном компоненте опухоли (p=0,000005), рецидив (p=0,0005) |
| Микрососуды контактного типа (см.рис. 1, г, на цв. вклейке): диаметр 48,7±10,5 мкм, клетки эндотелиальной выстилки непосредственно контактируют с опухолевыми клетками, экспрессия CD34 равномерная, средней интенсивности, экспрессии подопланина нет, расположены в интратуморальной строме | Стадия (p=0,00004), глубина инвазии опухоли (p<0,00001), ЛВИ (p=0,000001), феномен фрагментации в солидном компоненте опухоли (p=0,005), рецидив (p=0,000005) |
| Микрососуды в солидном компоненте опухоли (см. рис. 1, д, на цв. вклейке): 2 типа микрососудов, которые наблюдаются только при плоскоклеточном РШМ, непосредственно контактирующие с опухолевыми клетками и ретракцией стенки сосуда от опухолевых клеток, экспрессия CD34 интенсивная, равномерная, экспрессии подопланина нет | Стадия (p=0,00004), глубина инвазии опухоли (p=0,00002), степень дифференцировки опухоли (p=0,006), ЛВИ (p=0,0003), феномен фрагментации в солидном компоненте опухоли (p=0,01), рецидив (p=0,006) |
| Атипичные дилатированные капилляры (см. рис. 1, е, на цв. вклейке): диаметр 109,7±43,9 мкм, клетки эндотелиальной выстилки неправильной формы расположены хаотично, экспрессия CD34 и подопланина неравномерная, интенсивная, расположены в интра- и перитуморальной строме | Не выявлена |
| Структуры с частичной эндотелиальной выстилкой (см. рис. 1, ж, на цв. вклейке): клетки эндотелиальной выстилки неправильной формы расположены хаотично, экспрессия CD34 и подопланина неравномерная, интенсивная, в просвете часто наблюдаются комплексы опухолевых клеток, расположены в интра- и перитуморальной строме | Не выявлена |
| Лимфатические капилляры в лимфоидных и полиморфно-клеточных инфильтратах (см. рис. 1, з, на цв. вклейке): диаметр 85,2±33,3 мкм, эндотелиальная выстилка очень тонкая, иногда чуть заметная, экспрессия CD34 умеренная, экспрессия подопланина наблюдается во всех сосудах данного типа, в просвете лимфоциты и лейкоцитарные клетки часто с ядерной экспрессией подопланина | Стадия (p=0,0005), глубина инвазии опухоли (p<0,00001), ЛВИ в лимфатических сосудах (p=0,0003), феномен фрагментации в солидном компоненте опухоли (p=0,000001) |
Как следует из данных табл. 1, с рецидивом заболевания и при плоскоклеточном РШМ, и при аденокарциноме коррелировали только микрососуды контактного типа и микрососуды со слабовыраженной экспрессией CD34.
Кроме того, при изучении образцов опухоли был описан феномен фрагментации в солидном компоненте опухоли. При его наличии в солидном компоненте опухоли выявлялись несвязанные между собой фибробластоподобные опухолевые клетки с ядерной экспрессией HIF-1α и Snail (см. рис. 2, а—в, на цв. вклейке).
Рис. 2. Феномен фрагментации в солидном компоненте опухоли.
а — окраска гематоксилином Майера и эозином, ×800; б — ядерная экспрессия HIF-1α в опухолевых клетках, окраска антителами к HIF-1α, ×800; в — ядерная экспрессия Snail в опухолевых клетках, окраска антителами к Snail, ×800.
В результате анализа установлено, что показатели 5-летней выживаемости были достоверно ниже при наличии в образцах опухоли микрососудов контактного типа, микрососудов со слабовыраженной экспрессией CD34 и феномена фрагментации в солидном компоненте опухоли. Данные представлены в табл. 2.
Таблица 2. Показатели 5-летней выживаемости в зависимости от наличия микрососудов контактного типа, микрососудов со слабовыраженной экспрессией CD34 и феномена фрагментации в солидном компоненте опухоли
| Фактор | Пятилетняя выживаемость, % | р | |
| есть | нет | ||
| Микрососуды контактного типа | 72,2 | 96,6 | 0,002 |
| Микрососуды со слабовыраженной экспрессией CD34 | 81,8 | 97,7 | 0,02 |
| Феномен фрагментации в солидном компоненте опухоли | 70,6 | 96,6 | 0,001 |
Таким образом, наличие микрососудов контактного типа, микрососудов со слабовыраженной экспрессией CD34 и выявленный феномен фрагментации в солидном компоненте опухоли были расценены как потенциальные факторы неблагоприятного прогноза РШМ I—IIA стадии. В зависимости от их сочетания в образцах опухоли пациентки были разделены на четыре группы: 1-я — факторы не обнаружены; 2-я — выявлен только 1 из факторов; 3-я — 2 фактора; 4-я — выявлены все 3 фактора. Установлено, что одновременно 2 или 3 фактора (3-я и 4-я группы) достоверно чаще наблюдались при IB и IIA стадии РШМ по сравнению с IA (p=0,001) при аденокарциноме, чем при плоскоклеточном раке (p=0,02), при низкой степени дифференцировки опухоли (p=0,005), при наличии лимфоваскулярной инвазии (p=0,005) и рецидива заболевания (p<0,00001). При наличии в образцах опухоли одновременно 2 или 3 факторов (3-я и 4-я группы) глубина инвазии опухоли была достоверно больше (p=0,005). Данные представлены на рис. 3—6.
Рис. 3. Наличие факторов неблагоприятного прогноза в опухоли в зависимости от стадии рака шейки матки (p=0,001).
Рис. 4. Наличие факторов неблагоприятного прогноза в опухоли в зависимости от наличия лимфоваскулярной инвазии (p=0,005).
Рис. 5. Наличие факторов неблагоприятного прогноза в опухоли в зависимости от наличия рецидива рака шейки матки (p<0,00001).
Рис. 6. Глубина инвазии опухоли в зависимости от количества факторов неблагоприятного прогноза в опухоли (p=0,005).
При выявлении в образцах опухоли всех 3 факторов частота рецидива составила 66,7%, а 5-летняя безрецидивная и общая выживаемость — 97,3, 100,0, 87,5 и 33,3% соответственно при отсутствии факторов, при наличии 1, 2 и 3 описанных факторов в образцах опухоли (p<0,00001).
Следует отметить, что в настоящее время для оценки прогноза заболевания учитывают такие факторы, как возраст пациенток, стадия заболевания, размер и глубина инвазии опухоли, гистологический тип опухоли, состояние линии резекции, наличие лимфоваскулярной инвазии и др. [19—22]. Однако учет всех этих факторов не позволяет однозначно прогнозировать риск развития рецидива заболевания [18, 23, 24]. Известно, что при наличии одних и тех же факторов риска в ряде случаев развивается рецидив, а в других — нет. В связи с этим установление новых факторов, связанных с прогнозом РШМ, имеет принципиальное значение для индивидуализации проводимой терапии и улучшения ее отдаленных результатов. Особенно актуально это для пациенток с ранним РШМ, у которых остро стоит вопрос о выборе метода лечения, возможности выполнения органосохраняющих операций и целесообразности проведения адъювантной терапии.
В результате проведенного исследования установлено, что при РШМ I—IIA стадии опухолевые микрососуды гетерогенны и отличаются не только по морфологии, но и по клинической значимости. При этом с отдаленными результатами лечения коррелировали только микрососуды контактного типа, со слабовыраженной экспрессией CD34 и наличие феномена фрагментации в солидном компоненте опухоли. Сочетание в образцах опухоли одновременно 2 или 3 описанных факторов было расценено как потенциальный предиктор, связанный с неблагоприятным прогнозом РШМ I—IIA стадии. В то же время отсутствие этих факторов в образцах опухоли достоверно чаще наблюдалось при IA стадии РШМ (в 66,7, 37,8 и 33,3% соответственно при IA, IB и IIA стадии; p=0,001), при плоскоклеточном раке (в 53,9 и 18,2% соответственно при аденокарциноме и плоскоклеточном раке; p=0,02), при отсутствии лимфоваскулярной инвазии (в 60,0 и 31,3% соответственно; p=0,007) и рецидива заболевания (в 52,2 и 14,3% соответственно при отсутствии и наличии рецидива РШМ; p<0,00001). Следует отметить, что при IB и IIA стадии более чем у 1/3 пациенток в образцах опухоли отсутствовали вышеописанные факторы, в связи с чем, полагаем, вопрос о целесообразности адъювантной терапии в этой группе требует дальнейшего изучения.
Заключение
Таким образом, сочетание в образцах опухоли микрососудов контактного типа, микрососудов со слабовыраженной экспрессией CD34 и феномена фрагментации в солидном компоненте опухоли может рассматриваться как потенциальные предиктор, позволяющий не только выделять группу с высоким риском рецидива, но и пациенток с вероятным благоприятным прогнозом заболевания при I—IIA стадии РШМ. Полагаем, необходимы дальнейшие проспективные исследования роли разных типов опухолевых микрососудов и их сочетания в образцах опухоли для улучшения диагностики и обоснования показаний к оптимизации лечебной тактики при РШМ.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — М.А. Сенчукова
Сбор и обработка материала — Е.В. Макарова
Статистическая обработка — Е.В. Макарова
Написание текста — Е.В. Макарова, М.А. Сенчукова
Редактирование — М.А. Сенчукова, Н.Н.Волченко
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.