Оценка противоопухолевой эффективности комбинации L-лизин-α-оксидазы и иринотекана в эксперименте

L-лизин-α-оксидаза — ЛО (КФ 1.4.3.2) — катализирует окислительное дезаминирование L-лизина с образованием α-кето-ε-аминокапроновой кислоты и пероксида водорода. Механизм антипролиферативного действия фермента связан с уменьшением потребления опухолевыми клетками L-лизина, а также высвобождением пероксида водорода, обладающего прямой цитотоксичностью [3, 4]. Возможными молекулярными мишенями действия ЛО являются β-адренорецепторы и белки, ответственные за адгезивные свойства клеток [5]. В культуре клеток лимфомы Беркитта (P3HRj) показано, что фермент блокирует переход клеток из фазы S в G2/М клеточного цикла [6]. ЛО Trichoderma harzianum Rifai, впервые выделенная в России в 1980-х годах, в отличие от L-аспарагиназы E. coli, обладает существенно более широким спектром противоопухолевой активности in vivo и эффективна в отношении ряда гемобластозов и солидных опухолей мышей [7]. ЛО имеет слабый аллергенный потенциал, практически не влияет на гуморальный иммунный ответ и функциональную активность Т-лимфоцитов [7]. Особенностью действия ЛО in vivo является оригинальный спектр противоопухолевой активности и отсутствие лимитирующей гематологической токсичности. Это дает возможность считать ЛО перспективным препаратом для включения в схемы комбинированной химиотерапии [2]. Поскольку in vivo наиболее чувствительными к ЛО оказались различные модели опухолей толстой кишки, в качестве компонента при полихимиотерапии был выбран обладающий высокой эффективностью при раке толстой кишки в клинике ингибитор топоизомеразы I — иринотекан [1].

Цель исследования — оценка возможности комбинации L-лизин-α-оксидазы с иринотеканом под контролем токсичности и эффективности.

В исследовании решались следующие задачи:

1) определить расчетные токсические дозы иринотекана и L-лизин-α-оксидазы для здоровых мышей;

2) определить эффективность и переносимость комбинации иринотекан + L-лизин-α-оксидаза на моделях перевиваемых опухолей мышей.

Определение расчетных токсических доз иринотекана и L-лизин-α-оксидазы для здоровых мышей. Опыты проведены на 78 здоровых мышах-самцах линии Balb/c средней массой тела 20—22 г. С использованием метода Литчфилда—Уилкоксона определены расчетные токсические дозы ЛД16, ЛД50, ЛД84 и ЛД100 каждого препарата при однократном внутривенном (в/в) введении. Иринотекан 2% вводили в дозах 120, 180, 210, 240, 270 и 300 мг/кг. ЛО с удельной активностью 95—280 Е/мг, выделенную по отработанной ранее методике [10], вводили в дозах 300, 600, 900, 1200, 2400 и 3000 Е/кг. Более высокие дозы не использовали, так как более концентрированные растворы ЛО нестабильны, а введение высоких доз требует увеличения объема, лимитированного размером мыши.

Учитывая влияние циркадных ритмов на показатели токсичности цитостатиков у лабораторных мышей, опыты выполнены в осенне-зимний период с началом лечения в 10—11 ч утра. Оценивали общее состояние, особенности поведения, потребление корма и воды, изменения физиологических отправлений, динамику массы тела и селезенки, количество павших животных и сроки гибели. За состоянием и поведением животных наблюдали в течение первых 3 ч после введения препаратов и затем ежедневно в течение 60 дней, после чего выживших мышей умерщвляли и подвергали аутопсии.

Определение эффективности и переносимости комбинации иринотекан + L-лизин-α-оксидаза на моделях перевиваемых опухолей мышей. Опыты проведены на гибридных мышах BDF1 обоего пола массой тела 20—22 г разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, которых содержали в виварии РОНЦ при естественном освещении на брикетированном корме и постоянном доступе к воде. Использовали 4—15 пассажи внутрибрюшинно трансплантированного лимфолейкоза Р388 и солидной подкожно перевитой эпидермоидной карциномы легкого Льюис (LLC) из Банка опухолевых штаммов РОНЦ [4, 5]. Мышей делили на группы (n=5—11), которые получали препараты по отдельности или в комбинации под контролем роста опухоли без лечения. Лечение мышей с P388 начинали через 24 ч, с LLC — через 48 ч после трансплантации. Комбинированную химиотерапию выполняли одновременно последовательно, первым вводили иринотекан. Иринотекан («TEVA», Аргентина) в монорежиме вводили однократно в/в в дозах 20, 40, 50, 60 или 100 мг/кг, а в комбинации с ЛО — в дозах 50 или 100 мг/кг. ЛО с удельной активностью 95 Е/мг разводили 0,9% раствором хлорида натрия непосредственно перед введением до концентрации 10—20 Е/мл. В монорежиме ЛО вводили мышам в/в 5-кратно в разовых дозах 33—200 Е/кг (суммарные дозы 232—600 Е/кг), а в комбинации с иринотеканом — в дозах 50—200 Е/кг (суммарные дозы 300—600 Е/кг). Оценка эффективности лечения проведена по стандартным критериям: торможению роста солидной опухоли (ТРО, %) и увеличению продолжительности жизни (УПЖ, %). Значимыми считали ТРО ≥50%, УПЖ ≥25% [4, 5]. Об эффективности комбинированной химиотерапии судили по аддитивности результатов лечения в сравнении с группами, получавшими терапию в монорежиме. О переносимости лечения судили по состоянию и поведению животных в процессе и после окончания лечения, косвенным признакам общей и гематологической токсичности (достоверному уменьшению массы тела ≥30% и селезенки), фиксировали гибель мышей от токсичности и результаты аутопсии павших или умерщвленных мышей.

Статистическая обработка данных. Выполнена по методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова с расчетом доверительных интервалов средних сравниваемых величин. Достоверными считали различия при p<0,05.

Завершение экспериментов. Мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза с соблюдением гуманных методов, принятых в РФ, трупный материал подвергали кремации в специализированном подразделении РОНЦ.

Расчетные токсические дозы иринотекана и L-лизин-α-оксидазы для здоровых мышей. Результаты приведены в табл. 1.

Расчетная величина ЛД50 для ЛО в изученном диапазоне доз оказалась недостижимой: гибель мышей не получена, токсические дозы рассчитать не удалось. В дальнейших экспериментах для оценки эффективности использовали разовые дозы ЛО от 33 до 200 Е/кг.

Эффективность и переносимость комбинации иринотекан + L-лизин-α-оксидаза на моделях перевиваемых опухолей мышей. Результаты изучения на модели лимфолейкоза Р388 представлены в табл. 3.

1. Для мышей-самцов линии Balb/c при внутривенном введении ЛД50 иринотекана составляет 231,32 [218,8—243,9] мг/кг, а МПД близка к 200 мг/кг. При изучении острой токсичности L-лизин-α-оксидазы с удельной активностью 280 Е/мл (10,4 мг/мл) смертельных доз достичь не удалось, максимальная введенная доза составила 3000 Е/кг.

2. На модели внутрибрюшинного лейкоза Р388 терапевтический выигрыш комбинации иринотекан + L-лизин-α-оксидаза регистрируется только при применении низких терапевтических доз компонентов.

3. На модели LLC комбинация иринотекан 1/4 МПД + L-лизин-α-оксидаза 300—450 Е/кг дает суммарный терапевтический эффект с увеличением продолжительности жизни мышей до 35%.

4. Комбинация иринотекан + L-лизин-α-оксидаза не приводит к усилению характерной для иринотекана гастроинтестинальной токсичности и не дает новых побочных эффектов у мышей с внутрибрюшинным Р388 или подкожным LLC.

За помощь в финансировании работы авторы выражают благодарность Правительству г. Москвы.