Оценка противоопухолевой эффективности комбинации L-лизин-α-оксидазы и иринотекана в эксперименте

Введение

L-лизин-α-оксидаза — ЛО (КФ 1.4.3.2) — катализирует окислительное дезаминирование L-лизина с образованием α-кето-ε-аминокапроновой кислоты и пероксида водорода. Механизм антипролиферативного действия фермента связан с уменьшением потребления опухолевыми клетками L-лизина, а также высвобождением пероксида водорода, обладающего прямой цитотоксичностью [3, 4]. Возможными молекулярными мишенями действия ЛО являются β-адренорецепторы и белки, ответственные за адгезивные свойства клеток [5]. В культуре клеток лимфомы Беркитта (P3HRj) показано, что фермент блокирует переход клеток из фазы S в G2/М клеточного цикла [6]. ЛО Trichoderma harzianum Rifai, впервые выделенная в России в 1980-х годах, в отличие от L-аспарагиназы E. coli, обладает существенно более широким спектром противоопухолевой активности in vivo и эффективна в отношении ряда гемобластозов и солидных опухолей мышей [7]. ЛО имеет слабый аллергенный потенциал, практически не влияет на гуморальный иммунный ответ и функциональную активность Т-лимфоцитов [7]. Особенностью действия ЛО in vivo является оригинальный спектр противоопухолевой активности и отсутствие лимитирующей гематологической токсичности. Это дает возможность считать ЛО перспективным препаратом для включения в схемы комбинированной химиотерапии [2]. Поскольку in vivo наиболее чувствительными к ЛО оказались различные модели опухолей толстой кишки, в качестве компонента при полихимиотерапии был выбран обладающий высокой эффективностью при раке толстой кишки в клинике ингибитор топоизомеразы I — иринотекан [1].

Цель исследования — оценка возможности комбинации L-лизин-α-оксидазы с иринотеканом под контролем токсичности и эффективности.

В исследовании решались следующие задачи:

1) определить расчетные токсические дозы иринотекана и L-лизин-α-оксидазы для здоровых мышей;

2) определить эффективность и переносимость комбинации иринотекан + L-лизин-α-оксидаза на моделях перевиваемых опухолей мышей.

Материалы и методы

Определение расчетных токсических доз иринотекана и L-лизин-α-оксидазы для здоровых мышей. Опыты проведены на 78 здоровых мышах-самцах линии Balb/c средней массой тела 20—22 г. С использованием метода Литчфилда—Уилкоксона определены расчетные токсические дозы ЛД16, ЛД50, ЛД84 и ЛД100 каждого препарата при однократном внутривенном (в/в) введении. Иринотекан 2% вводили в дозах 120, 180, 210, 240, 270 и 300 мг/кг. ЛО с удельной активностью 95—280 Е/мг, выделенную по отработанной ранее методике [10], вводили в дозах 300, 600, 900, 1200, 2400 и 3000 Е/кг. Более высокие дозы не использовали, так как более концентрированные растворы ЛО нестабильны, а введение высоких доз требует увеличения объема, лимитированного размером мыши.

Учитывая влияние циркадных ритмов на показатели токсичности цитостатиков у лабораторных мышей, опыты выполнены в осенне-зимний период с началом лечения в 10—11 ч утра. Оценивали общее состояние, особенности поведения, потребление корма и воды, изменения физиологических отправлений, динамику массы тела и селезенки, количество павших животных и сроки гибели. За состоянием и поведением животных наблюдали в течение первых 3 ч после введения препаратов и затем ежедневно в течение 60 дней, после чего выживших мышей умерщвляли и подвергали аутопсии.

Определение эффективности и переносимости комбинации иринотекан + L-лизин-α-оксидаза на моделях перевиваемых опухолей мышей. Опыты проведены на гибридных мышах BDF1 обоего пола массой тела 20—22 г разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, которых содержали в виварии РОНЦ при естественном освещении на брикетированном корме и постоянном доступе к воде. Использовали 4—15 пассажи внутрибрюшинно трансплантированного лимфолейкоза Р388 и солидной подкожно перевитой эпидермоидной карциномы легкого Льюис (LLC) из Банка опухолевых штаммов РОНЦ [4, 5]. Мышей делили на группы (n=5—11), которые получали препараты по отдельности или в комбинации под контролем роста опухоли без лечения. Лечение мышей с P388 начинали через 24 ч, с LLC — через 48 ч после трансплантации. Комбинированную химиотерапию выполняли одновременно последовательно, первым вводили иринотекан. Иринотекан («TEVA», Аргентина) в монорежиме вводили однократно в/в в дозах 20, 40, 50, 60 или 100 мг/кг, а в комбинации с ЛО — в дозах 50 или 100 мг/кг. ЛО с удельной активностью 95 Е/мг разводили 0,9% раствором хлорида натрия непосредственно перед введением до концентрации 10—20 Е/мл. В монорежиме ЛО вводили мышам в/в 5-кратно в разовых дозах 33—200 Е/кг (суммарные дозы 232—600 Е/кг), а в комбинации с иринотеканом — в дозах 50—200 Е/кг (суммарные дозы 300—600 Е/кг). Оценка эффективности лечения проведена по стандартным критериям: торможению роста солидной опухоли (ТРО, %) и увеличению продолжительности жизни (УПЖ, %). Значимыми считали ТРО ≥50%, УПЖ ≥25% [4, 5]. Об эффективности комбинированной химиотерапии судили по аддитивности результатов лечения в сравнении с группами, получавшими терапию в монорежиме. О переносимости лечения судили по состоянию и поведению животных в процессе и после окончания лечения, косвенным признакам общей и гематологической токсичности (достоверному уменьшению массы тела ≥30% и селезенки), фиксировали гибель мышей от токсичности и результаты аутопсии павших или умерщвленных мышей.

Статистическая обработка данных. Выполнена по методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова с расчетом доверительных интервалов средних сравниваемых величин. Достоверными считали различия при p<0,05.

Завершение экспериментов. Мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза с соблюдением гуманных методов, принятых в РФ, трупный материал подвергали кремации в специализированном подразделении РОНЦ.

Результаты и обсуждение

Расчетные токсические дозы иринотекана и L-лизин-α-оксидазы для здоровых мышей. Результаты приведены в табл. 1.

Показано, что после введения иринотекана в интервале доз ≥210 мг/кг часть мышей погибала через 20—40 мин при явлениях дезориентации, адинамии и ареактивности. Двигательная активность выживших мышей восстанавливалась через 2 ч. На протяжении недели после введения препарата независимо от дозы иринотекана у всех животных отмечали диарею различной степени выраженности. Через 7—10 сут после введения препарата средняя масса тела выживших мышей уменьшалась на 30%. Отмечено 2 пика гибели мышей, характерных для иринотекана: сразу после введения (нейротоксичность) и на 4—8-е сутки (гематологическая и гастроинтестинальная токсичность) [8]. При аутопсии мышей, получивших иринотекан в интервале доз от 210 до ≥270 мг/кг, обнаружены изъязвления и отечность серозной оболочки тонкой кишки с кровоизлияниями, расцененными как проявление лимитирующей гастроинтестинальной токсичности. Расчетная величина ЛД50 иринотекана для мышей-самцов линии Balb/c (табл. 2)

составила 231,32 [218,8—243,9] мг/кг, что согласуется с известными данными [9]. В качестве лечебных для однократного введения иринотекана были выбраны разовые дозы 50—100 мг/кг, составляющие примерно 1/2—1/4 МПД.

Расчетная величина ЛД50 для ЛО в изученном диапазоне доз оказалась недостижимой: гибель мышей не получена, токсические дозы рассчитать не удалось. В дальнейших экспериментах для оценки эффективности использовали разовые дозы ЛО от 33 до 200 Е/кг.

Эффективность и переносимость комбинации иринотекан + L-лизин-α-оксидаза на моделях перевиваемых опухолей мышей. Результаты изучения на модели лимфолейкоза Р388 представлены в табл. 3.

Видно, что комбинация иринотекан + ЛО при одновременном начале лечения не дала достоверного повышения эффекта по сравнению с монотерапией иринотеканом: УПЖ=82—120% против 105—175% (p<0,05). ЛО в монотерапии дала минимально значимый эффект, УПЖ=29%. Некоторая тенденция к повышению эффективности комбинации получена при применении относительно невысоких доз препаратов: 50 мг/кг иринотекана и суммарной дозы ЛО 300—450 Е/кг: УПЖ=114—120% против 82—86% (р<0,05). Переносимость комбинации или монотерапии была удовлетворительной, гибели животных от токсичности не отмечали. В группах с иринотеканом наблюдали умеренную диарею со снижением массы тела на 10—20%, более выраженным при использовании иринотекана в дозе 100 мг/кг и ЛО в суммарной дозе 600 Е/кг. Монотерапия ЛО не давала осложнений. Таким образом, на модели внутрибрюшинного лейкоза Р388 показана высокая эффективность иринотекана, на фоне которой терапевтический выигрыш комбинации с ЛО можно уловить только при применении невысоких терапевтических доз. Этот дозовый режим был изучен на LLC. Результаты представлены в табл. 4.

Видно, что на этой модели монотерапия ЛО или иринотеканом в низких терапевтических дозах была равноэффективной. Для иринотекана в дозах ≥50 мг/кг ТРОmax составило 87% с сохранением >50% в течение 2 нед. Комбинация иринотекана 50 мг/кг и ЛО в суммарной дозе 300 мг/кг дала ТРОmax=94% против ТРОmax=40—43% при применении одного иринотекана в дозах 20 и 40 мг/кг и ТРОmax=42% при монотерапии ЛО. Ингибирующий эффект комбинации, сопоставимый с эффектом иринотекана в дозе 100 мг/кг, был более существенным, так как в отличие от всех групп монотерапии сопровождался достоверным продлением жизни мышей, УПЖ=35% (p<0,05). Следовательно, добавление ЛО к невысокой дозе иринотекана позволяет получить терапевтический выигрыш и повысить выживаемость мышей. Изменение срока начала введения ЛО (48 или 96 ч после трансплантации опухоли) или увеличение суммарной дозы ЛО >300 Е/кг не сказывалось на эффективности комбинации. Переносимость комбинации иринотекан + ЛО в использованном дозовом диапазоне или обоих препаратов по отдельности была одинаково удовлетворительной: состояние и поведение мышей без особенностей. В группах, получавших иринотекан, в течение 10 сут отмечали умеренную диарею при небольшой потере массы тела (<10%). Гибели от токсичности при всех видах лечения не отмечали. Таким образом, на модели LLC комбинация иринотекан 1/4 МПД + ЛО 300—450 Е/кг дает значимый суммарный терапевтический выигрыш. Удовлетворительная переносимость комбинации и отсутствие усиления проявлений гастроинтестинальной токсичности позволяют считать эту комбинацию перспективной для углубленного доклинического изучения.

Выводы

1. Для мышей-самцов линии Balb/c при внутривенном введении ЛД50 иринотекана составляет 231,32 [218,8—243,9] мг/кг, а МПД близка к 200 мг/кг. При изучении острой токсичности L-лизин-α-оксидазы с удельной активностью 280 Е/мл (10,4 мг/мл) смертельных доз достичь не удалось, максимальная введенная доза составила 3000 Е/кг.

2. На модели внутрибрюшинного лейкоза Р388 терапевтический выигрыш комбинации иринотекан + L-лизин-α-оксидаза регистрируется только при применении низких терапевтических доз компонентов.

3. На модели LLC комбинация иринотекан 1/4 МПД + L-лизин-α-оксидаза 300—450 Е/кг дает суммарный терапевтический эффект с увеличением продолжительности жизни мышей до 35%.

4. Комбинация иринотекан + L-лизин-α-оксидаза не приводит к усилению характерной для иринотекана гастроинтестинальной токсичности и не дает новых побочных эффектов у мышей с внутрибрюшинным Р388 или подкожным LLC.

За помощь в финансировании работы авторы выражают благодарность Правительству г. Москвы.