Введение

Как известно, уровень иммунного ответа при использовании разных вакцин непосредственно зависит от количества антигена. Поэтому одной из стратегий усиления иммунного ответа является увеличение экспрессии целевого гена. Этот подход широко использовался при разработке препаратов на основе ДНК-вакцин против различных вирусов [1, 2].

Существует ряд методов для усиления экспрессии целевого гена, в том числе использование так называемых «сильных» промоторов, векторов с множественными копиями гена, введение энхансеров, устранение РНК-интерференции и т.д. Одним из эффективных подходов в этом направлении является оптимизация нуклеотидной последовательности целевого гена. Оптимизация кодонов — это процесс в молекулярной биологии и генной инженерии, при котором последовательность кодонов в гене модифицируется для улучшения его экспрессии в конкретном организме-хозяине. Помимо этого, при оптимизации кодонов дополнительно проводят удаление донорных и акцепторных сайтов сплайсинга, удаление тандемных повторов, преждевременных сайтов полиаденилирования, увеличение GC-состава и др., что влияет не только в целом на уровень экспрессии гена, но и в частности на стабильность мРНК [3].

У большинства организмов при трансляции белка почти для каждой аминокислоты с разной частотой используются кодоны. Использование часто встречающихся кодонов конкретного организма, для которого планируется применение препарата, может улучшить скорость синтеза белка, предотвращая истощение редких тРНК или избегая необходимости присутствия тРНК в стабильных, но низких концентрациях [4, 5].

Для проверки влияния оптимизации последовательности целевого гена на иммуногенность потенциального вакцинного вектора было проведено исследование, целью которого являлось сравнение иммуногенности препаратов рекомбинантных аденовирусов с оптимизированной и неоптимизированной последовательностью гена, кодирующего S-белок вируса SARS-CoV-2.

Материал и методы

Рекомбинантные аденовирусы наращивали на культуре клеток почки эмбриона человека HEK293. Клеточную линию культивировали в среде CDM4HEK293 (HyClone, США).

Для очистки рекомбинантных аденовирусов был использован метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl («ХимКрафт», Россия) [6].

Количество аденовирусных частиц в препарате определяли спектрофотометрически на приборе NanoDrop 2000с (Thermo, США).

Для определения количества инфекционных частиц рекомбинантных аденовирусов был использован модифицированный метод титрования по конечным точкам ТЦД₅₀.

Вирусную ДНК выделяли набором «Wizard Genomic DNA Purification Kit» (Promega, США).

Наличие гена гексона Ad5 и гена S-белка (оптимизированного или не оптимизированного) подтверждали методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием коммерческих смесей qPCRmix-HS и qPCRmix-HS SYBR (ЗАО «Евроген», Россия). Использовали следующие праймеры и зонд: на гексон Ad5 (Real-Ad5-F CTGGGCAATGGTCGCTATGT, Real-Ad5-R AGAAGGTGGCGTAAAGGCAAAT, Ad5-Probe (R6G)CATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCA(BHQ2)); на ген оптимизированного S белка (ba.5-opt-f ACAAGTTGGATTCCAAAGTTGG и ba.5-opt-r GCCGTAGCTTTGTAGAGGAAA); на ген S-белка «дикого типа» (BA5.3.1F CTGGCTTCATCAAACAATATGGT и BA5.3.1R ACCCGCTAACAGTGCAGAA). Праймеры и зонд были синтезированы в ЗАО «Евроген» (Россия).

РНК изолировали реагентом TRIzol™ (Invitrogen, США) согласно протоколу производителя.

Экспрессию S-белка полученными аденовирусами Ad5-S-BA5 и Ad5-S-BA5opt подтверждали методом ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени. Использовали следующие праймеры: BA5.3.1F CTGGCTTCATCAAACAATATGGT и BA5.3.1R ACCCGCTAACAGTGCAGAA; ba.5-opt-f ACAAGTTGGATTCCAAAGTTGG и ba.5-opt-r GCCGTAGCTTTGTAGAGGAAA.

Иммуногенность рекомбинантных аденовирусных векторов оценивали по титру RBD-специфических IgG антител в сыворотках крови иммунизированных животных. Мыши линии BALB/с (самки, масса тела 18—20 г) были разделены на 3 группы по 6 голов в каждой. Первой группе (группа отрицательного контроля) внутримышечно вводили 100 мкл фосфатно-солевого буфера. Второй и третьей группам мышей вводили Ad5-S-BA5 и Ad5-S-BA5opt, соответственно в дозе 10¹⁰ вирусных частиц на животное.

Титр RBD-специфических антител в сыворотке крови мышей на 14, 21 и 28-й день после иммунизации рекомбинантными аденовирусами определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по стандартному протоколу. Для проведения анализа использовали иммуносорбент из набора реагентов «SARS-CoV-2-RBD-ИФА-Гамалеи» производства ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Для детекции использовали вторичные антитела, специфичные к IgG мышей и конъюгированные с пероксидазой хрена (A9044-2ML, Sigma-Aldrich, США).

Статистический анализ проводился при помощи программы GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, США), а также Excel (Microsoft, США). Для анализа несвязанных выборок применялся критерий Манна—Уитни. Результаты сравнения экспериментальных и контрольных групп считали статистически достоверными при p<0,05.

Результаты

Модификация кодонов гена S-белка вируса SARS-CoV-2. Нативная последовательность гена S-белка вируса SARS-CoV-2 не является оптимальной для экспрессии в клетках млекопитающих — согласно расчетам, индекс адаптации кодонов (CAI — codon adaptation index) составляет 0,67. В связи с этим нуклеотидная последовательность была изменена с сохранением аминокислотного состава для увеличения частоты использования оптимальных кодонов. Помимо предпочтительного кодонного состава, учитывали такие факторы, как GC-состав, сайты альтернативного сплайсинга, повторы более 10 нуклеотидов. В результате была получена последовательность с CAI=0,87. Относительно исходной последовательности GC-состав увеличен с 37,3 до 52,9%. Снижено количество сайтов альтернативного сплайсинга: донорных с 13 до 7, акцепторных с 17 до 5. Количество повторов (прямых, инвертированных, симметричных) в последовательности снижено с 36 до 8. При обнаружении последовательностей длиной более 11 нуклеотидов, которые повторяются на протяжении гена, проводили замену кодонов на синонимичные, поскольку наличие таких повторов может приводить к появлению мутаций. Гомология оптимизированной последовательности гена относительно нативной составила 73,7% (рис. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_04_045_add.zip).

Сравнение экспрессии оптимизированного гена S в составе рекомбинантного аденовируса. Аденовирусы Ad5-S-BA5 (экспрессирующий неоптимизированный ген S-белка вируса SARS-CoV-2 линии BA5) и Ad5-S-BA5opt (экспрессирующий оптимизированный ген S-белка линии BA5) были получены в лаборатории иммунобиотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России стандартным способом [7]. После препаративного наращивания рекомбинантные аденовирусы характеризовали по следующим параметрам: среднему количеству вирусных частиц, инфекционному титру, количеству копий гена гексона аденовируса и количеству копий целевого гена S-белка (оптимизированного или неоптимизированного) (табл. 1).

Таблица 1. Результаты анализа полученных рекомбинантных аденовирусов Ad5-S-BA5 и Ad5-S-BA5opt

Результаты анализа означают, что полученные препараты рекомбинантных аденовирусов Ad5-S-BA5 и Ad5-S-BA5opt значимо не отличаются друг от друга по исследованным показателям.

Для сравнения экспрессии оптимизированного гена S-белка и нативного проводили два вида анализа. Функциональную активность белка оценивали по образованию синцития в клеточном монослое. Транскрипционную активность определяли по количеству мРНК S-белка в трансдуцированных клетках. Клетки Vero Е6 трансдуцировали Ad5-S-BA5 и Ad5-S-BA5opt в дозе 1000 в.ч./клетку. Экспрессия S-белка вируса SARS-CoV-2 индуцирует образование синцития путем слияния мембраны вируса с мембраной клетки хозяина или клетки с клеткой, что приводит к формированию гигантских многоядерных клеток — синцитий [8]. Через 72 ч после трансдукции в результате экспрессии оптимизированного гена S-белка наблюдали формирование многоядерных клеток (рис. 2, а, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_04_046_add.zip). При этом в клетках, трансдуцированных Ad5-S-BA5, образование синцитиальных формирований не детектировали.

Чтобы установить, отражают ли наблюдаемые различия в экспрессии S-белка для Ad5-S-BA5 и Ad5-S-BA5opt разницу в транскрипции или трансляции, из трансдуцированных клеток выделяли тотальную клеточную РНК. Определение количества мРНК гена S белка проводили через 1, 72 и 168 ч после трансдукции с помощью ОТ-ПЦР-РВ (рис. 2, б). В клетках, трансдуцированных Ad5-S-BA5, через 72 ч обнаружили 11550 ± 1909 копий мРНК. К 7-му дню (168 ч) количество мРНК значимо не увеличилось и составило 12100 ± 424 копий. В клетках, трансдуцированных Ad5-S-BA5opt, через 72 ч обнаружили почти в 8 раз достоверно больше копий мРНК гена S белка (91200 ± 565, p = 0,0003, непарный t-критерий Стьюдента). К 7-му дню разница в количестве мРНК для оптимизированного и нативного гена составила больше 30 раз (381000 ± 11313, p = 0,0004, непарный t-критерий Стьюдента).

Сравнение иммуногенности оптимизированного гена S в составе рекомбинантного аденовируса. Для изучения иммунных реакций in vivo, индуцированных аденовирусными векторами, экспрессирующими разные варианты гена S-белка, мышей линии BALB/c внутримышечно иммунизировали Ad5-S-BA5 и Ad5-S-BA5opt в дозе 10¹⁰ в.ч./животное. В сыворотке крови животных, выделенной через 14, 21 и 28 дней после иммунизации, анализировали титры антигенспецифичных антител. Полученные титры сравнивали с титрами мышей из контрольной группы. Индивидуальные данные, а также среднее геометрическое значение титра (СГТ) представлены графически на рис. 3.

Рис. 3. Динамика иммунного ответа у лабораторных животных после иммунизации рекомбинантными аденовирусами.

* — значимые отличия от контрольной группы при p<0,01; данные представлены как средний геометрический титр антител с 95% доверительным интервалом.

Рекомбинантный аденовирус Ad5-S-BA5opt, экспрессирующий оптимизированный ген S-белка линии BA5, показал высокую иммуногенность у мышей в течение всего периода исследования. Антитела, специфичные к RBD S-белка вируса SARS-CoV-2, были обнаружены на 14, 21 и 28-й дни после иммунизации, СГТ составил 1131, 2016 и 2540 соответственно. При этом в группе животных, иммунизированных Ad5-S-BA5, на 14-й день после иммунизации все значения оказались ниже предела обнаружения, а на 21 и 28-й дни СГТ составил 31 и 40, соответственно. Различия в титрах антител, специфичных к RBD, между группами Ad5-S-BA5opt и Ad5-S-BA5 являются статистически значимыми (p = 0,0022, критерий Манна—Уитни). У контрольных животных все значения находились ниже предела обнаружения (ниже 1:50).

Обсуждение

Увеличение экспрессии антигена в результате оптимизации нуклеотидной последовательности может значительно улучшать иммуногенность вакцин [9-11]. Для оптимизации нуклеотидной последовательности разработчики применяют разные алгоритмы: некоторые просто используют наиболее часто встречающиеся кодоны, в то время как другие моделируют схему использования кодонов организмом-мишенью. Высокоэкспрессируемые гены смещены в сторону кодонов, которые распознаются наиболее распространенными видами тРНК в организме [12]. Одним из показателей этого смещения является индекс адаптации кодонов (CAI) [13]. Поскольку нативная последовательность гена S-белка вируса SARS-CoV-2 линии BA5 имеет средний CAI в клетках млекопитающих, его экспрессия в клетках может быть неоптимальной. Поэтому мы синтезировали ген S, используя набор кодонов, разработанных для максимального увеличения CAI у млекопитающих, и протестировали их экспрессию in vitro и иммуногенность на мышиной модели. CAI оптимизированного по нуклеотидному составу гена S-белка вируса SARS-CoV-2 был увеличен с 0,67 до 0,87 (максимально возможное значение 1,0). Содержание GC пар было увеличено с 37,3 до 52,9% в оптимизированной последовательности. Снижено количество сайтов альтернативного сплайсинга и повторов внутри последовательности. Перечисленные факторы благоприятно влияют на стабильность мРНК и эффективность трансляции целевого белка.

Экспрессию генов S-белка вируса SARS-CoV-2 оценивали по транскрипционной активности и функциональным свойствам белка. В клетках, трансдуцированных аденовирусом, несущим оптимизированный ген, экспрессия S-белка на поверхности клетки приводила к слиянию клеточных мембран с образованием крупных многоядерных клеток — синцитий. Следует отметить, что формирование синцития не наблюдали в клетках, трансдуцированных аденовирусом, несущим неоптимизированный ген. Полученные функциональные отличия соотносятся с результатами анализа транскрипционной активности. Уровень мРНК, транскрибируемой с гена BA5opt, был значительно выше, чем с нативного гена BA5. Увеличенное количество мРНК также может быть следствием ее большей стабильности. Таким образом, более высокая экспрессия S-белка с оптимизированной нуклеотидной последовательностью была следствием увеличения транскрипции и трансляции.

По результатам проведенного исследования иммуногенности in vivo важно отметить значительную разницу в уровне титров антигенспецифичных антител между конструкциями, отличающимися исключительно нуклеотидным составом целевого гена, но не другими компонентами вектора. Данные результаты согласуются с проведенными ранее исследованиями [14, 15]. Принято считать, что доступность тРНК выше в конструкциях, использующих кодоны, типичные для генов млекопитающих. В настоящей работе аденовирусный вектор, несущий целевой ген с оптимизированной нуклеотидной последовательностью, показал в целом более высокую иммуногенность по сравнению с его аналогом, содержащим ген белка «дикого типа».

Заключение

В ходе исследования были произведены наращивание и очистка двух рекомбинантных аденовирусов с оптимизированной и неоптимизированной последовательностью гена, кодирующего S-белок SARS-CoV-2. Подлинность полученных препаратов была подтверждена методом ПЦР-РВ и иммуноблоттингом. Сравнение иммуногенности Ad5-S-BA5 и Ad5-S-BA5opt показало, что оптимизация последовательности антигена значительно усиливает иммунный ответ у животных на введение рекомбинантных аденовирусов.

Оптимизация нуклеотидной последовательности может привести к повышению стабильности мРНК и значительному увеличению экспрессии целевого гена, и, как следствие, значительному увеличению протективных свойств кандидатного препарата. Можно полагать, что данный метод окажется перспективным в плане разработки вакцин против вирусов, содержащих низкоиммуногенные антигены.

Полученные результаты подчеркивают необходимость использования метода оптимизации кодонного состава целевого гена при разработке вакцинных препаратов, особенно в контексте применения рекомбинантных аденовирусных векторов. Данные результаты дополняют существующие знания в области молекулярной биологии, предоставляя важную информацию для разработки более эффективных стратегий вакцинации и генной терапии.

Финансирование. Исследование проводилось в рамках работы по гос. заданию «Разработка прототипа векторной вакцины для профилактики коронавирусной инфекции COVID-19».

Соблюдение этических стандартов. Лабораторных животных содержали в виварии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, все работы проводили в соответствии с ГОСТ №33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». Проведение экспериментов одобрено местными правилами этики (протокол №9, 16 апреля 2021).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.