Введение

Врожденный иммунитет обеспечивает первую линию активной защиты макроорганизма от патогенов и служит для ограничения их размножения и распространения in vivo. Впоследствии развивается адаптивный иммунный ответ, характеризующийся экспансией антиген-специфических Т- и В-клеток, что приводит к выработке антител (АТ) и образованию цитотоксических Т-клеток, которые обеспечивают элиминацию патогена и формирование иммунологической памяти для защиты от повторного заболевания [1].

Врожденный иммунитет активируется при взаимодействии с чужеродными, эволюционно консервативными молекулярными структурами, называемыми патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (ПАМП), которые экспрессируются широким спектром микроорганизмов [2]. Среди белков, распознающих ПАМП, первым был обнаружен и лучше всех охарактеризован рецептор TLR9 [3]. TLR9 экспрессируются на внутриклеточных везикулах (эндоплазматическом ретикулуме, эндосомах и лизосомах), где распознает участки вирусной и бактериальной ДНК, а также синтетические олигодезоксинуклеотиды [4]. Короткие синтетические одноцепочечные олигодезоксинуклеотиды, содержащие неметилированные CpG-динуклеотиды (CpG-ОДН), имитируют бактериальную ДНК и проявляют сходные иммуностимулирующие эффекты.

TLR9 человека в основном экспрессируется B-клетками и плазмацитоидными дендритными клетками (пДК), в то время как у мышей множество миелоидных клеток экспрессируют TLR9 и могут реагировать на стимуляцию CpG. Это различие необходимо учитывать при анализе результатов доклинических исследований и оценке терапевтического потенциала CpG-ОДН в клинических испытаниях [5].

Связывание CpG ДНК с TLR9 вызывает протеолитическое расщепление рецептора аспарагиновой эндопептидазой и/или катепсином [6]. Расщепление эктодомена обеспечивает механизм, с помощью которого активация рецептора ограничивается эндолизосомными компартментами, дополнительно предотвращая реакцию TLR9 на собственную ДНК. Укороченная форма TLR9 затем рекрутирует MyD88, IL-1R-ассоциированной киназы и фактора 6, ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли, и впоследствии включает активацию нескольких MAP-киназ и факторов транскрипции, таких как NF-kB, AP-1 и IRF-7 (рис.). Врожденный иммунный ответ, вызванный активацией TLR, характеризуется продукцией провоспалительных цитокинов, хемокинов, интерферонов I типа и антимикробных пептидов [2].

Активация TLR9 сигнального пути CpG олигонуклеотидами

Как правило, активации TLR9 достаточно, чтобы вызвать пролиферацию B-клеток иммунологической памяти человека, переключение клеток на синтез IgG2a и секрецию антител. В то же время наивные B-клетки слабо экспрессируют TLR9 и не реагируют на CpG-ОДН [7]. Стимуляция АГ через рецептор B-клеток побуждает наивные B-клетки повышать экспрессию TLR9 и приобретать CpG-реактивность [8], что предотвращает нежелательную поликлональную активацию B-клеток.

Изменения в экспрессии генов могут быть обнаружены в течение 30 мин после введения CpG-ОДН in vivo и включают активацию TNF, IL-1β и IL-1α [9]. Экспрессия генов достигает пика через 3 ч после воздействия CpG-ОДН, в это время происходит активация около 1000 генов, относящихся к различным функциональным категориям [1, 10].

Вышеуказанное позволяет предположить, что, имитируя бактериальную ДНК, CpG-ОДН активируют не только врожденную, но и адаптивную иммунную систему, что позволяет рассматривать их в качестве эффективных адъювантов для вакцин против инфекций [11].

Синтетические CpG олигонуклеотиды

Открытие иммуногенных свойств бактериальной ДНК привело к разработке синтетических CpG олигонуклеотидов, различающихся не только нуклеотидной последовательностью, но и спецификой опосредуемых иммуностимулирующих эффектов. Основываясь на особенностях структурных характеристик, а также иммуностимулирующей активности, все CpG-ОДН были разделены на четыре основных типа: классы A, B, C и P.

Класс A (D-ОДН) — представители этого класса являются мощными индукторами IFN-α и активаторами NK-клеток, молекулы которых построены из смешанного фосфодиэфирного / фосфотиоатного остова, содержат один CpG-мотив, окруженный палиндромными последовательностями, и имеют поли-G-хвосты на 3’- и 5’-концах, не устойчивы к воздействию нуклеаз [12]. D-ОДН вызывают созревание пДК, но не влияют на B-клетки [13].

Известно о проведении опытов по капсулированию D-ODN в стабильные вирусоподобные частицы и последующем использовании соответствующих препаратов в качестве адъювантов вакцины в доклинических и клинических исследованиях [14].

Способность индуцировать синтез NO в нейтрофилах характерна для ОДН класса A. Механизм стимуляции синтазы оксида азота, основного источника продукции NO в клетках млекопитающих, связан со специфическим взаимодействием центральной «шпильки» этих олигонуклеотидов с рецептором TLR9, поскольку этот эффект полностью исчезал при нарушении палиндромности или инверсии участков CpG и сохранялся в полностью фосфодиэфирных последовательностях [15].

Класс B (K-ODN) — модифицированные фосфоротиоатные нуклеотидные последовательности с одним или несколькими CpG-мотивами. К K-ODN относятся CpG-ОДН с гексамерной структурой и основной формулой «пурин-пиримидин-C-G-пиримидин-пиримидин» (например, 5’-GTCGTT-3’ и 5’-GACGTT-3’). В отличие от CpG-ОДН класса A, K-ODN резистентны к действию нуклеаз, что приводит к более длительному периоду их полураспада in vivo. Кроме того, представители этого класса активируют B-лимфоциты и индуцируют секрецию фактора некроза опухоли и IL-12, но при этом слабо активируют NK-клетки [12, 13].

Класс C — CpG-ОДН класса C сочетают в себе иммуностимулирующие свойства CpG-ОДН класса A и B, хотя выражены они немного слабее. Подобно K-ОДН, молекулы CpG-ОДН класса C имеют модифицированный фосфоротиоатный остов и стимулируют секрецию IL-6 B-лимфоцитами, но при этом, подобно D-ОДН, также обладают выраженной интерфероногенной активностью [16]. CpG-ОДН класса C присутствуют как в ранних, так и в поздних эндосомах и, таким образом, проявляют общие свойства с K-ОДН и D-ОДН [17].

Класс P представлен мощными индукторами IFN-α, хотя, как и представители CpG-ОДН класса C, они слабо стимулируют активацию B-клеток и пДК. CpG-ОДН класса P содержат две палиндромные последовательности, образующих конкатемеры и/или мультимерные единицы, где каждая молекула связана посредством Уотсон-Криковского спаривания оснований со вторым и третьим палиндромами, фланкирующими CpG динуклеотиды [18].

К обособленному классу синтетических CpG олигонуклеотидов можно отнести ОДН, образующие G-квадруплексную вторичную структуру (G4) за счет связывания квартетов гуаниновых оснований водородными связями. Структуры G4 могут повышать устойчивость молекулы к нуклеазам CpG-ОДН с фосфодиэфирным скелетом. CpG-ОДН гибридного класса G4 с мотивом CpG в центральной петле показали высокий иммуностимулирующий эффект, представители указанного класса CpG легко преодолевают клеточную мембрану [19].

Известно, что поли(dG) мотивы образуют четырехцепочечные спирали, стабилизированные квартетом оснований, называемые G-квадруплексами. Наличие G-квадруплексной структуры в ОДН повышает ее поглощение и увеличивает индукцию IL-12 [20].

Однако следует отметить, что мотив поли(dG), содержащийся в ОДН, может индуцировать иммунную активность независимо от CpG-мотивов и запуска TLR9. Сообщалось, что ОДН, содержащие мотивы поли(dG), ко-стимулируют Т-клетки [21] и активируют литическую активность, а также продукцию IFN-γ естественными киллерами (NK-клетками).

Количество мотивов CpG является одним из параметров, влияющих на эффективность стимуляции TLR9 с помощью G4 CpG-ОДН. Даже при наличии только одного мотива CpG, G4 CpG-ОДН способствуют продукции цитокинов при условии, что мотив CpG пространственно удален от фланкирующих G-трактов. Фосфодиэфирный Y-образный ОДН, содержащий только один мотив CpG, индуцирует продукцию IL-6 и TNF-α в клетках RAW264 [22]. Иммуностимулирующая активность G4 CpG-ОДН усиливается с увеличением количества мотивов CpG. Эта закономерность характерна как для линейных CpG-ОДН [23], так и для ОДН с внутренними структурами [22]. Однако добавление более двух мотивов CpG не оказывает существенного влияния на иммуностимулирующую активность ОДН. Более того, добавление более четырех мотивов CpG к ОДН снижает его активность.

CpG-ОДН в составе препаратов против инфекционных болезней

Разными группами ученых установлено, что CpG-ОДН усиливают гуморальный иммунитет, индуцированный вакцинами против большого числа патогенов с увеличением титров антиген-специфических антител до трех порядков (табл.) [24—26]. Работ об исследованиях вакцин, предназначенных для индукции Т-клеточных ответов, известно значительно меньше, но они также свидетельствуют об эффективности адъювантов CpG-ОДН. Например, на мышиной модели лейшманиоза включение CpG-ОДН в состав вакцины ускоряло образование IFN-γ-секретирующих Т-клеток и увеличивало их количество в 2—3 раза [27].

Таблица. CpG олигонуклеотиды в составе вакцин против инфекционных болезней

У мышей, вакцинированных адсорбированной вакциной против сибирской язвы с CpG адъювантом, защитный иммунитет развивался в 3 раза быстрее, чем у мышей, иммунизированных без адъюванта. При этом формирование защитного уровня антител наблюдалось через 5 дней после введения препарата, без адъюванта — через 15 дней. Комбинация CpG-ОДН с сибиреязвенной вакциной способствовала более раннему формированию IgG против ПА в значительно более высоких титрах [28]. Применение протективного антигена и белка S-слоя ЕА1 сибиреязвенного микроба в сочетании с CpG адъювантом приводит к формированию напряженного и продолжительного иммунитета, а также увеличивает ЛД₅₀ с 3,1·10³ до 2·10⁵ спор тест-штамма B. anthracis [29, 30].

Была также исследована способность CpG-ОДН усиливать мукозальный иммунный ответ при местном применении вакцин. У животных, иммунизированных интравагинально вакциной против вируса простого герпеса HSV-2 в сочетании с CpG-ОДН, быстро развился сильный слизистый и системный Th1-иммунный ответ, который защищал от летальной инфекции HSV-2 [31]. Введение CpG-ОДН с рекомбинантным гликопротеином-B HSV интраназально индуцировало значительные уровни гликопротеина B-специфического IgA и анти-ВПГ ЦТЛ в половых путях и защищало мышей от заражения HSV-2 [32]. Конъюнктивальное применение вакцины HSV-1 в сочетании с CpG-ОДН у кроликов способствовало образованию специфических вируснейтрализующих IgA и IgG как в слезной жидкости, так и в сыворотке крови [33].

Как и в ходе доклинических исследований на лабораторных мышах, адъювантный эффект CpG-ОДН наблюдался на нескольких моделях крупных животных. Иммунизация телят вакциной, полученной путем инактивации формалином респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в сочетании с CpG-ОДН, усиливала ответ антиген-специфических антител и снижала количество вируса в легких животных, иммунизированных вакциной без адъюванта [34]. Пероральная вакцинация новорожденных поросят живым аттенуированным вирусом псевдобешенства в сочетании с CpG-ОДН приводила к 18-кратному повышению титров IgG в сыворотке и повышению в 10 раз уровня IgA слизистых оболочек по сравнению с животными, иммунизированными только вирусом [35]. Точно так же CpG-ОДН повышала активность вакцины против болезни Ньюкасла у цыплят, увеличивая антиген-специфический ответ IgG в 3 раза по сравнению с обычной вакциной [36].

Препараты, разрабатываемые для медицинского применения CpG-ОДН, эффективны в качестве адъювантов у приматов. Иммунная система нечеловекообразных приматов распознает и реагирует на все классы CpG-ОДН, которые стимулируют клетки человека [7, 37]. Наблюдаемый иммунный ответ развивался быстрее, антитела имели высокую авидность и обеспечивали большую защиту от сибирской язвы, чем те, которые наблюдались после вакцинации без адъюванта. Сходные реакции наблюдались и у мышей [28]. Также K-ОДН значительно усиливали антиген-специфический ответ IgG в сыворотке у обезьян рода Aotus, иммунизированных противомалярийной вакциной на основе пептидов. Эта эффективная индукция антиген-специфического иммунного ответа была характерна для используемой последовательности, так как контрольные ОДН не влияли на иммуногенность вакцины.

Адъювантную активность CpG-ОДН исследовали путем введения его в комбинации с квасцами. Включение CpG-ОДН улучшало как гуморальный, так и клеточный иммунитет у мышей, особенно Th1-зависимый и цитотоксический иммунный ответ [38]. CpG-ОДН способствовал повышению иммуногенности вакцин на основе квасцов против инфекционных заболеваний, включая гепатит B [39, 40], сибирскую язву [41] и грипп [42]. Также исследованы эффекты применения CpG-ОДН с адьювантами на масляной основе. Агонисты TLR9 в целом усиливают иммунный ответ на вакцинные антигены в составе комплексов Quil A Emulsigen® (эмульсия минерального масла в воде) [43] и Montanide® (эмульсия вода-в-минеральном масле) [44].

Холерный токсин стал ведущим экспериментальным адъювантом для индукции сильного антиген-специфического иммунного ответа слизистой оболочки [45]. Недавние исследования показывают, что сочетание с CpG-ОДН увеличивает эффективность холерного токсина в качестве адъюванта.

Исследования вакцины против сибирской язвы показали, что введение CpG-ОДН с холерным токсином приводило к более высоким титрам антиген-специфических антител по сравнению с иммунизацией с одним из адъювантов [46].

Первой CpG-содержащей вакциной против вируса гепатита B (HBV), завершившей клинические испытания фазы III, была HEPLISAV. Одобренная в настоящее время вакцина требует трех иммунизаций в течение 6 мес для достижения защитных титров антител. При этом у 5—10% иммунизированных лиц не наблюдается защитных титров антител [47]. Включение CpG-ОДН в HEPLISAV улучшает индукцию гуморального и клеточного иммунного ответа.

Другой вариант иммуногенной вакцины против HBV был основан на использовании поверхностного антигена вируса гепатита B (HbsAg), который экспрессируется на поверхности HBV и высвобождается в сыворотку после инфицирования. Доклинические исследования показали, что CpG 2216 и CpG 2395 вызывают 2—4-кратное увеличение продукции IFN-γ и IL-4 у пациентов с хронической инфекцией HBV [48]. Аналогичные результаты наблюдались при оценке CpG 7909 и ISS 1018 в клинических испытаниях: у здоровых добровольцев при иммунизации адъювантной вакциной титры анти-HBV-АГ АТ были выше в 3—10 раз по сравнению с контрольной группой [39, 40]. CpG-ОДН 7909 в дозе 0,5 мг был наиболее эффективным, индуцируя у всех субъектов защитные титры, которые сохранялись до 24-й недели [39].

Вакцина против сибирской язвы адсорбированная («Biothrax», «Cyfendus»), лицензированная в США для иммунизации людей, вводится путем 6 подкожных инъекций в течение 18 мес с последующими ежегодными бустерными прививками.

Результаты клинических испытаний показали, что добавление CpG-ОДН к адсорбированной вакцине против сибирской язвы увеличивает титры сывороточных IgG анти-ПА в 6—8 раз, сокращая время, необходимое для индукции защитного титра, почти на 3 нед [41]. Результаты исследования по оценке двух доз адсорбированной вакцины, введенных внутримышечно, подтверждают, что добавление CpG 7909 значительно улучшило титры АТ и ускорило индукцию иммунитета [49].

Результаты клинических испытаний свидетельствуют, что у добровольцев наблюдался значительно более сильный иммунный ответ на малярийные антигены, которые вводили совместно с CpG-ОДН [50].

Проведенные испытания на некоторых животных моделях показали, что добавление CpG-ОДН к лицензированным противогриппозным вакцинам улучшает их иммуногенность [51]. Например, добавление CpG-ОДН к вакцине против гриппа человека Fluviral (включая антигены A/Сидней, A/Пекин и B/Харбин) индуцировало более высокие титры вирус-специфичных антител, что приводило к лучшей защите у хорьков, о чем свидетельствует снижение вирусной активности на 20% по сравнению с вакциной без адъюванта [51].

Безопасность

Профиль безопасности CpG-ОДН широко исследовали на грызунах, нечеловекообразных приматах и людях. Установлено, что иммунная стимуляция, вызванная CpG олигонуклеотидами, может снижать апоптотическую гибель стимулированных лимфоцитов, индуцировать активацию поликлональных B-клеток и увеличивать продукцию ауто-АТ и провоспалительных цитокинов [51]. Все эти эффекты могут увеличить риск аутоиммунных заболеваний [52]. Чтобы установить масштабы этой проблемы, были проведены эксперименты in vivo, в которых мышам многократно вводили иммуностимулирующие дозы ДНК CpG. Хотя количество B-клеток, секретирующих IgG анти-ДНК, увеличилось в 2—3 раза, а титры антител IgG к ДНК в сыворотке увеличились на 60%, величина этих эффектов была недостаточной, чтобы вызвать аутоиммунные реакции [53].

Другой результат наблюдался в случае органоспецифических аутоиммунных заболеваний, которым обычно способствует тип ответа Th1, предпочтительно вызываемый ДНК CpG. В IL-12-зависимой модели экспериментального аллергического энцефаломиелита (имитирующего рассеянный склероз) у животных, получавших CpG-ДНК, а затем зараженных ауто-АГ, формировались аутореактивные эффекторные Th1-клетки [54]. В модели молекулярной мимикрии CpG-ДНК совместно с антигеном, полученным из хламидий, способствовали индукции аутоиммунного миокардита [55]. Установлено также, что CpG-ОДН повышают восприимчивость мышей к артриту [56]. Эти данные указывают на то, что мотивы CpG могут при определенных обстоятельствах способствовать развитию аутоиммунных реакций.

Проведение очередного этапа клинического испытания с использованием CpG-ОДН в качестве адъюванта для вакцины против гепатита B было остановлено, когда у одного субъекта развился гранулематоз Вегенера — аутоиммунное заболевание, характеризующееся воспалением сосудистой системы [57]. Принимая во внимание отсутствие значимых различий в частоте аутоиммунных заболеваний между реципиентами HEPLISAV и реципиентами вакцины Engerix-B с квасцовым адъювантом, консультативный комитет FDA заключил, что HEPLISAV не вызывает опасений по поводу безопасности его применения [57]. Поскольку имеются многочисленные сообщения о развитии васкулита после введения обычной вакцины против гепатита [58], значение и причинно-следственную связь этого единичного события трудно оценить.

Бактериальный токсический шок могут вызвать повторные воздействия на инфицированный макроорганизм липополисахарида и D-галактозамина [59]. Токсический шок наблюдался у мышей после введения CpG-ОДН в сочетании с сублетальными дозами липополисахарида и у животных, предварительно сенсибилизированных D-галактозамином [4, 60]. Однако токсический шок у лабораторных животных не наблюдался при введении CpG-ОДН в концентрациях, характерных для вакцинных препаратов [61].

Данные клинических испытаний показывают, что CpG-ОДН относительно безопасны при использовании в качестве адъювантов вакцин. Вакцинные препараты и соответствующие препараты с адъювантом CpG по профилю безопасности, как правило, значимо не отличаются [40]. Тем не менее в нескольких исследованиях было отмечено повышение частоты и/или тяжести местных нежелательных явлений (НЯ) (реакций в месте инъекции, таких как боль, отек, уплотнение, зуд и эритема) и системных симптомов (включая гриппоподобные симптомы) при использовании вакцин с CpG адъювантом. Большинство НЯ, о которых сообщалось в клинических исследованиях, были легкой или средней степени тяжести, появлялись в течение 24 ч после приема препарата и сохранялись несколько дней. В одном двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании с участием ВИЧ-инфицированных взрослых добровольцев инъекция PPV-23 привела к значительно более высокой частоте гриппоподобных симптомов в сочетании с CpG-ОДН по сравнению с вакциной без адъюванта (37 из 41 против 2 из 41 участников) [62]. В общей сложности у 75,6% субъектов, вакцинированных CpG-ОДН плюс PPV-23, развились НЯ, классифицированные как умеренные-тяжелые по интенсивности, и один субъект был госпитализирован с лихорадкой и недомоганием в течение 5 дней. Напротив, гриппоподобные симптомы были редкостью среди тех, кто получал только PPV-23. Возможно, что повышенная реактогенность, обнаруженная с адъювантной вакциной, отражает синергизм между CpG-ОДН и ПАМП бактериальной клеточной стенки, присутствующими в вакцине PPV-23 [63].

В ходе клинических исследований HEPLISAV около 5000 пациентов получили препарат, содержащий CpG-ОДН. Общие НЯ включали местные реакции в месте инъекции (эритема, отек, воспаление и боль) или системные гриппоподобные симптомы (головная боль, озноб, тошнота и лихорадка) [12]. Эти симптомы обычно развивались в течение 24 ч после введения вакцины и были проходящими, длящимися менее двух дней. За некоторыми исключениями, они были легкой и средней степени тяжести (1/2 балла по Общепринятым терминологическим критериям). Серьезных НЯ, связанных с введением HEPLISAV здоровым взрослым людям, не отмечено [61].

Заключение

Создание эффективных вакцин против инфекций — актуальная цель биомедицинских исследований. Результаты исследований показывают, что CpG-ОДН усиливают гуморальный и клеточный иммунные ответы при введении вакцины здоровым людям. CpG-ОДН ускоряют индукцию специфических иммуноглобулинов и способствуют образованию более высоких и стойких титров антител при использовании совместно с белковыми вакцинами. Лучше всего это продемонстрировали обширные испытания вакцин против сибирской язвы и гепатита B. Важным преимуществом использования CpG-ОДН в качестве адъюванта является повышение активности адаптивного иммунитета даже у субъектов с ослабленной иммунной системой, значительно улучшая реакцию на вакцину.

CpG-ОДН активируют врожденную иммунную систему, связываясь с родственными им рецепторами TLR-9 внутри клетки. Иммунный ответ характеризуется продукцией Th1, провоспалительных цитокинов, хемокинов, и поддерживает индукцию адаптивного иммунного ответа в присутствии АГ CpG-ОДН. CpG-ОДН также улучшают антиген-презентирующую функцию ДК, моноцитов и макрофагов, индуцирует пролиферацию B-клеток и косвенно стимулирует активность естественных киллеров. Эти разнообразные эффекты подтверждают способность CpG-ОДН действовать в качестве адъювантов вакцин, индуцируя быстрые, сильные, более высокие аффинные и продолжительные гуморальные и клеточные иммунные ответы.

Прогресс в разработке терапевтических CpG-ОДН включает в себя не только поиск новых классов CpG-ОДН и улучшение активности уже известных, но и определение механизмов действия ОДН на отдельные элементы иммунной системы. Еще одним важным направлением исследований является изучение способов доставки и применение CpG-ОДН в сочетании с другими адъювантами, включая лиганды, нацеленные на другие TLR. Такие комбинации могут стать мощным средством повышения иммуногенности вакцин.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.