Введение

Гепатит B — потенциально опасное для жизни инфекционное заболевание печени, возбудителем которого является вирус гепатита B (ВГВ). Это заболевание представляет собой серьезную проблему здравоохранения во всем мире в связи с вероятностью перехода в хроническую форму заболевания и высоким риском летального исхода от цирроза и рака печени [1]. Наиболее эффективной профилактической мерой против заболевания, вызываемого ВГВ, является вакцинация. Вакцинация новорожденных против гепатита B в России включена в Национальный календарь профилактических прививок с 2001 г. [2]; детей в возрасте от 1 года до 17 лет, а также взрослых в возрасте от 18 до 55 лет, не привитых ранее, — с 2007 г. [3].

HBsAg — основной серологический маркер инфекции вируса гепатита B. Серологические различия из-за отличий в аминокислотных последовательностях поверхностного белка ВГВ у разных его штаммов позволяют выделить 9 антигенных субтипов HBsAg: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+, adrq- [4—6]. Таксономическая классификация ВГВ, основанная на различиях в последовательностях геномных ДНК вирусных изолятов, в настоящее время выделяет не менее 9 генотипов (обозначаемых A-I) [7—9].

Состояние здоровья коренных народностей, представляющих изолированную группу с возможно уникальными генетическими вариантами данного патогена, остается мало изученным. Еще меньше данных о распространении ВГВ у коренного населения отдаленных регионов с суровыми условиями жизни, таких как Крайний Север. Гренландия, где основную массу населения составляют инуиты, всегда считалась зоной высокого риска инфекции ВГВ (более 75% представителей местного населения, участвовавших в обследовании, имели маркеры нынешней или прошлой инфекции HBV) [10]. Инуиты Канады и Аляски имели, в целом, схожие показатели: маркеры воздействия ВГВ в 85% [11] и до 70% случаев соответственно [12]. В настоящее время в результате реализации программ всеобщей вакцинации против гепатита B показатели заболеваемости ВГВ в данных группах, вероятно, значительно ниже.

В Российской Федерации к территориям Заполярья относятся Мурманская область, Ненецкий автономный округ, часть Архангельской области, Республики Коми, Ямало-Ненецкого автономного округа (ЯНАО), часть Красноярского края (Таймырский (Долгано-Ненецкий) автономный округ, Эвенкийский автономный округ), часть Республики Саха (Якутия), Чукотского автономного округа (ЧАО). По отдельным регионам Российской Федерации, находящимся за полярным кругом, доступны публикации о распространении и генотипическом разнообразии ВГВ. Так, показано, что помимо доминирующего во всех случаях генотипа D ВГВ обнаружены также изоляты вируса генотипа C ВГВ в Красноселькупском районе ЯНАО [13], а также в Таймырском (Долгано-Ненецком) автономном округе Красноярского края [13], генотипа A ВГВ — в Пуровском районе ЯНАО [13], а в Республике Саха (Якутия) [14] и ЧАО [15] — изоляты генотипов A и C. При этом среди упомянутых территорий только ЯНАО относится к низкоэндемичным регионам по частоте встречаемости HBsAg (1,7%) [13].

В наших предыдущих работах [13] были исследованы образцы плазмы крови коренного населения Шурышкарского, Приуральского, Красноселькупского, Пуровского районов ЯНАО.

Цель данного исследования — определение частоты встречаемости серологических маркеров ВГВ в образцах плазмы крови коренного населения ранее не изученного села Гыда Тазовского района ЯНАО, а также определение генотипов ВГВ, субтипов HBsAg в образцах плазмы крови, содержащих HBsAg.

Справка. Село Гы́да — поселок и морская пристань в Тазовском районе Ямало-Ненецкого автономного округа (ЯНАО). Расположено на севере Гыданского п-ва, в устье одноименной реки, в 380 км к северу от п. Тазовский. Основное занятие местного населения, проживающего большей частью в Гыданской тундре, — оленеводство и рыболовство. Численность населения на 1 января 2020 г. составляла 3747 человек, до 90% жителей — ненцы [16].

Материал и методы

Исследуемый район и популяция

Все обследованные являлись коренными жителями села Гыда и прилегающей Гыданской тундры. Возраст обследуемых на момент взятия крови составлял от 5 лет до 75 лет. Национальный состав группы: 636 — тундровые ненцы (в том числе 48 нен/татар, нен/рус) (91%), 57 — русские (8%), 9 — другие национальности (1%).

Половозрастной состав группы: мужчины — 277 (39%) в возрасте от 8 лет до 71 года (средний возраст 18); женщины — 425 (61%) в возрасте от 5 до 75 лет (средний возраст 23).

Образцы. Образцы, полученные от жителей Гыды, помечены шифром «ГЫД» с указанием порядкового номера. От тундровых и поселковых жителей (ненцев) села Гыда Тазовского района ЯНАО были получены 702 образца плазмы крови. Материалы были собраны во время трех экспедиций: Гыд1—Гыд122 (лето 2013 г.), Гыд123—Гыд635 (октябрь—ноябрь 2014 г.), Гыд636—Гыд719 (октябрь 2016 г.).

Образцы плазмы крови были заморожены и хранились в морозильной камере при –20 °C до момента исследования. Все обследованные лица или их родители дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Иммуноферментный анализ. Исследования на наличие HBsAg проводили с помощью зарегистрированных в России наборов реагентов «Вектогеп-B-HBs-антиген», «Вектогеп-B-HBs — антиген-подтверждающий тест» (АО «Вектор-Бест», Россия) согласно инструкции производителя.

Образцы плазмы крови, взятые в первой и второй экспедициях, дополнительно были исследованы на наличие серологических маркеров — анти-HBs и анти-HBcore. Данная часть исследований была проведена с помощью наборов реагентов «ВектоHBsAg-антитела» и «ВектоHBcore-антитела» (АО «Вектор-Бест», Россия) согласно соответствующим инструкциям по применению. Всего было исследовано 300 образцов плазмы крови женщин и мужчин в возрасте от 15 до 75 лет.

Оригинальный метод определения генотипов ВГВ и субтипов HBsAg. Определение генотипов ВГВ и субтипов HBsAg с помощью моноклональных антител (МАТ) анти-HBs проводили согласно [17].

Молекулярно-биологические методы

Выделение ДНК

Для выделения нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) из инактивированной плазмы крови человека использовали набор реагентов «Реал-Бест Экстракция 100» (АО «Вектор-Бест», Россия) согласно инструкции производителя.

Полимеразная цепная реакция и секвенирование. Объем ПЦР-смеси для наработки фрагмента ДНК ВГВ составлял 50 мкл. В реакцию вносили 5 мкл образца, праймеры вносили до конечной концентрации 0,5 мкМ. Фрагмент ДНК ВГВ длиной 934 п.о., включающий область, кодирующую S-ген, нарабатывали с использованием праймеров: 3s-seq-F1 5’ — GCTGGTGGCTCCAGTTC — 3’ (позиция¹ 59-75), 2s-seq-R1 5’ — TTGACAGACTTTCCAATCAATAGG — 3’ (993-970). ПЦР проводили по протоколу амплификации: 94 °C — 3 мин, 50 циклов (94 °C — 10 с, 60 °C — 10 с, 72 °C — 30 с), финальная инкубация 72 °C — 1 мин.

Очистку продуктов амплификации производили методом SPRI [18, 19] с использованием магнитных микрочастиц производства АО «Вектор-Бест».

В реакции Сэнгера использовали те же праймеры, что и для наработки фрагмента ДНК. Объем реакционной смеси составлял 30 мкл. В реакционную смесь вносили 1 мкл BigDye 3.1 (Thermo Scientific, США), 5 пмоль секвенирующего праймера. Температурный профиль реакции соответствовал рекомендациям фирмы-производителя (Thermo Scientific, США). Очистку продуктов реакции Сэнгера проводили методом гельфильтрации на колонках с Sephadex G50 (GE Healthcare, Великобритания). Образцы сушили на центрифужном испарителе Concentrator plus (Eppendorf, Германия) и передавали в Центр коллективного пользования «Геномика» СО РАН.

Анализ последовательностей

Для анализа и множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали пакет программ Vector NTI (InforMax, США). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы MEGA7 [20], методом Maximum Likelihood. Трансляцию нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программного обеспечения MEGA7. Для определения генотипа выделенных нуклеотидных последовательностей использовали прототипные последовательности геномов ВГВ разных генотипов из международной электронной базы данных GenBank (A: AM282986.1, KC875260.1, B: AB368295.1, EU579441.1, C: EU579443.1, KC875274.1 D: KC875342.1, AM422939.1, F: DQ823095.1, AY179735.1, G: AP007264.1; H: AB275308.1, AB179747.1).

Для выделенных изолятов вируса по нуклеотидным последовательностям, кодирующим участок S-гена, выводили аминокислотные последовательности. По выведенным аминокислотным остаткам в положениях 122, 127, 134, 140, 159, 160, участвующим, как известно, в формировании субтип-специфических детерминант [21—23], были установлены предсказанные субтипы HВsAg выделенных изолятов.

Статистическая обработка данных

Накопление и систематизация исходной информации, визуализация полученных результатов осуществлялись в Microsoft Office Excel 2016. Статистический анализ проводили с использованием программы Excel. Для сравнения процентных долей в двух группах использовали критерий 2 (онлайн-калькулятор [24]); для оценки достоверности различий среднего возраста носителей HBsAg — критерий Манна—Уитни (онлайн-калькулятор [25]) при пороговом значении значимости 0,05.

Результаты и обсуждение

Из 702 образцов плазмы крови только 3 образца содержали HBsAg, частота встречаемости HBsAg составила 0,4%. Следовательно, данный регион относится к низкоэндемичным, что согласуется с литературными данными о низкой частоте встречаемости HBsAg в северных (по сравнению с другими) регионах РФ, полученными ранее [13]. Так, средняя частота встречаемости HBsAg в образцах крови коренных народностей ЯНАО (1,6%) была значительно ниже, чем в Республике Алтай (9,6%), Кемеровской области (10,2%), Иркутской области (6,0%), Красноярском крае (11,7%) [13].

Для определения иммунного статуса ВГВ образцы плазмы крови 1-й и 2-й экспедиций (лица от 15 лет и старше) были исследованы, помимо HBsAg, на другие серологические маркеры ВГВ: анти-HBs и анти-HBcore (табл. 1). Из 300 образцов, взятых в исследование, отрицательными, не содержащими маркеры ВГВ, оказались 103 (34,3%) образца. Остальные 197 (65,7%) образцов содержали маркеры гепатита B: HBsAg — 0,7% (2/300), анти-HBs — 64% (191/300), анти-HBcore —11% (34/300).

Таблица 1. Встречаемость серологических маркеров ВГВ

Только анти-HBs в защитном титре (от 10 мМЕ/мл и выше) содержали 163 (54,3%) образца (отнесены в группу «иммунитет после вакцинации»). Еще 28 (9,3%) образцов содержали антитела анти-HBs и анти-HBcore, что позволило присвоить им статус «перенесенный гепатит B». Следует отметить, что в анкетах данные о наличии или отсутствии вакцинации против гепатита B у лиц, включенных в исследование, отсутствуют. Мы предполагаем, что столь высокая доля обследуемых с наличием антител против HBsAg объясняется включением в 2007 г. вакцинации против вирусного гепатита B детей от 1 года до 17 лет, а также взрослых от 18 до 55 лет, не привитых ранее, в Национальный календарь профилактических прививок [3] в дополнение к вакцинации новорожденных и детей 13 лет, принятой в 2001 г. [2]. Кроме того, на сайте Роспотребнадзора по ЯНАО есть информация, подтверждающая вакцинацию взрослых в этом регионе с 2011 г. [26].

Мы оценили распространенность маркеров вирусного гепатита B в разных возрастных группах (см. табл. 1). Оказалось, что частота встречаемости серологических маркеров ВГВ ниже всего в группе людей пожилого возраста (60—74 лет), за счет уменьшения доли лиц с наличием анти-HBs (29%) по сравнению с группами 15—29 лет, 30—44 лет и 45—59 лет, в которых этот показатель составил 65, 69 и 62% соответственно (p<0,05). И связано это, скорее всего, с тем, что эти обследуемые не были вакцинированы, а большинство тех, кто был инфицирован, умерли рано. Доля лиц, переболевших гепатитом В (одновременное присутствие анти-HBs и анти-HBcore в образцах), оказалась минимальной (2%) в группе 15—29 лет, в то время как в других возрастных группах эта величина была выше (p<0,05) и достигала 14; 22 и 14% (см. табл. 1). Кроме того, «изолированные» антитела анти-HBcore были обнаружены только в группах обследуемых старше 30 лет. Все эти результаты в совокупности говорят о снижении числа переболевших и наличии защитных антител предположительно в результате вакцинации в группе людей молодого возраста по сравнению с более старшими возрастными группами.

Наличие анти-HBcore при отсутствии HBsAg и анти-HBs может свидетельствовать об оккультном (скрытом) вирусном гепатите B, который характеризуется «наличием ДНК ВГВ в ткани печени (независимо от ее наличия в плазме крови) и отсутствием HBsAg в сыворотке крови» [27]. В нашем исследовании образцов с «изолированными анти-HBcore» оказалось 4 (гыд59, гыд269, гыд351, гыд420) (1,3%), причем уровень антител в них достаточно высок, что говорит о большой вероятности присутствия кольцевой ковалентно замкнутой ДНК (ккзДНК) в тканях печени этих лиц [28]. Нам не удалось выделить вирусную ДНК из образцов плазмы крови ни в одном из четырех случаев «изолированных анти-HBcore». По данным разных авторов [29—32], ДНК ВГВ в плазме крови выявляется менее чем в 14,4% проб с «изолированными анти-HBcore». Причинами низкого уровня вирусной репликации могут быть формирование дефектных вирусных частиц, мутации в участках, отвечающих за контроль транскрипции, приводящих к неэффективности репликации, а также недетектируемому уровню ДНК ВГВ в сыворотке крови при ее наличии в ткани печени [33, 34]. Другой причиной скрытого гепатита B могут быть коинфекции, например, вирусом гепатита C (ВГС) [35—37], приводящие к снижению уровней синтеза HBsAg и репликации ВГВ.

Три образца, содержащие HBsAg, были исследованы дополнительно с целью определения генотипов ВГВ и субтипов HBsAg двумя методами. С помощью оригинальной методики, описанной в источнике [17], генотипы ВГВ и субтипы HBsAg были установлены в 2 образцах из трех (табл. 2). В обоих случаях установлен генотип D ВГВ, наиболее распространенный на территории РФ (субтипы HBsAg ayw2 и ayw3).

Таблица 2. Результаты определения генотипов ВГВ и субтипов HBsAg у носителей HBsAg Тазовского района ЯНАО

Из тех же двух образцов (Гыд112 и Гыд320) была выделена ДНК ВГВ. Анализ нуклеотидных последовательностей вирусных ДНК показал принадлежность к генотипу D ВГВ (субгенотипы D3 и D2, соответственно). Выведенные аминокислотные последовательности позволили предсказать субтипы HBsAg в данных образцах, полностью совпадающие с установленными согласно оригинальной методике с применением МАТ.

Для образца Гыд345 результаты генотипирования ВГВ и субтипирования HBsAg обоими методами признаны невалидными. ДНК ВГВ из данного образца выделить не удалось, а содержание HBsAg в нем оказалось менее 0,025 МЕ/мл (определено против международного стандарта [38]), что ниже необходимого для проведения генотипирования с помощью МАТ-уровня [17].

Таким образом, в данной работе результаты определения генотипов ВГВ и субтипов HBsAg у носителей HBsAg полностью совпали при исследовании двумя методами.

Сравнительный анализ с прилегающим Пуровским районом

При сравнении частот встречаемости HBsAg в Тазовском (0,4%) и в граничащем с ним Пуровском (Самбургская тундра, ранее опубликованные данные [13, 39]) районе (1,7%), где основное население также составляют ненцы, были получены статистически значимые различия (p<0,05), которые, вероятно, являются следствием вакцинации (образцы Пуровского района были собраны почти на 20 лет ранее). Отсутствие статистически значимой разницы в возрасте носителей HBsAg на указанных территориях (p>0,05, U-критерий Манна—Уитни), по всей видимости, объясняется их малым числом (n=3) в Тазовском районе. При этом средний возраст носителей HBsAg на территории изучаемого в данной работе Тазовского района составил 33 года (медиана 29 лет), в исследованном ранее Пуровском районе (n=12) — 24 года (медиана 16 лет), что демонстрирует, что в Пуровском районе до включения вакцинации против гепатита B в Национальный календарь прививок в России в 2001 г. [2] доля носителей HBsAg была выше, и чаще всего это были люди молодого возраста. Кроме того, показатели иммуноферментных тест-систем, применяемых и 20 лет назад, и в настоящее время, претерпели существенные изменения. Так, например, предел обнаружения HBsAg в образцах сыворотки (плазмы) крови современными тестами на основе ИФА составляет 0,01—0,05 МЕ/мл, в то время как 20 лет назад этот показатель составлял 0,1 МЕ/мл. В связи с этим частота встречаемости HBsAg на изученных ранее территориях может быть выше, а средний возраст носителей HBsAg — несколько иным при проверке архивных образцов современными средствами диагностики. Эта тема может быть отдельным предметом дальнейших исследований.

Отмечено также отличие в распределении генотипов ВГВ: в Тазовском районе для 2 выделенных изолятов установлен генотип D (100%), в Пуровском — 7 выделенных изолятов были отнесены ранее к генотипам A (29%) и D (71%) [13].

Заключение

Таким образом, село Гыда Тазовского района ЯНАО относится к низкоэндемичным регионам по распространенности HBsAg. Выделенные изоляты ВГВ относятся к наиболее распространенному на территории РФ генотипу D ВГВ (субтипы HBsAg ayw2, ayw3).

Финансирование

Работа проведена в основном без специальной финансовой поддержки. Участие С.В.Нетесова было поддержано в рамках государственного задания по финансированию НИР в Новосибирском государственном университете №FSUS-2020-0035 и Программы повышения конкурентоспособности российских университетов ТОП-100 НГУ.

Участие Л.П. Осиповой и Л.Э. Табихановой поддержано бюджетным проектом ИЦиГ СО РАН №0259-2021-0014.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹Номер в базе данных GenBank: AB675681.1 (Hepatitis B virus DNA, complete genome, isolate: 10B19)