Однонуклеотидные полиморфизмы в гене U86 Human betaherpesvirus 6B

Human Herpes Virus 6 (HHV-6) — вирус герпеса человека 6 типа (ВГЧ-6) впервые был обнаружен в 1986 г. в крови больного лимфомой. До 2012 г. различали A и B варианты (подтипы) HHV-6 [1]. Согласно современной классификации ВГЧ-6А (Human betaherpesvirus 6А) и ВГЧ-6В (Human betaherpesvirus 6B) являются самостоятельными видами и принадлежат к подсемейству Betaherpesvirinae рода Roseolovirus [2]. Оба вируса инфицируют Т-лимфоциты, моноциты (макрофаги), клетки эпителия и центральной нервной системы. В большинстве регионов мира распространенность ВГЧ-6 в человеческой популяции превышает 90%, преимущественно за счет ВГЧ-6B [3, 4]. Первичная инфекция ВГЧ-6B является причиной внезапной экзантемы (exanthema subitum), нередко сопровождаемой судорогами у детей раннего возраста. ВГЧ-6A ассоциирован с неврологическими болезнями, включая энцефалит, синдром хронической усталости и рассеянный склероз [3]. Персистенция ВГЧ-6A и ВГЧ-6B в организме способствует развитию пожизненной латентной формы инфекции с периодическими обострениями, причем в 1% случаев геном ВГЧ-6 наследуется вследствие интеграции в клетках зародышевой линии [3, 4].

Генетический материал ВГЧ-6A и ВГЧ-6B представлен двухцепочечной ДНК протяженностью 159—162 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), включающей несколько областей [5]. Центральная U-область (unique) фланкирована идентичными концевыми прямыми повторами (direct repeats, DR), содержащими консервативные мотивы pac-1 и pac-2 и два фрагмента теломерных повторов (TRS, telomere repeat sequences), участвующих в процессе интеграции генома ВГЧ-6 с хромосомой клетки позвоночных путем гомологичной рекомбинации между TRS и теломерами [4, 5]. В пределах U-области на обеих цепях ДНК находится большинство из 110—120 кодирующих белки открытых рамок считывания (ORFs). Эта область генома ВГЧ-6 имеет выраженное сходство с таковой у ВГЧ-7 и ВГЧ-5 (цитомегаловирус человека, ЦМВ) [1, 2, 5]. В целом геномы ВГЧ-6A и ВГЧ-6B колинеарны. Наиболее консервативный участок U включает открытые рамки считывания U2—U85. Вариабельные области охватывают U86—U100 [1, 2]. Анализ одиночных нуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphisms, SNPs) U-области был использован для видовой идентификации ВГЧ-6A и ВГЧ-6B [2]. В отечественной научной литературе имеются единичные публикации, посвященные видовой идентификации и типированию ВГЧ-6 [6, 7]. Между тем определение видов ВГЧ-6A и ВГЧ-6B может помочь установить их ассоциацию с заболеваниями детей и взрослых, прогнозировать развитие неврологических осложнений. Оценка генетического полиморфизма (внутривидовое типирование) позволит проследить географическое распределение и особенности циркуляции в человеческих популяциях различных генотипов вируса.

Цель настоящего исследования — анализ однонуклеотидных полиморфизмов в гене U86 для характеристики разнообразия российской популяции ВГЧ-6В.

Изучены 49 образцов ДНК ВГЧ-6, полученных из крови детей с проявлениями острой ВГЧ-6-инфекции в Санкт-Петербурге [7]. ДНК выделяли с помощью Multi-DNA-Extraction kit (Astra Biotech GmbH, Германия). Для оценки генетической вариабельности 49 изолятов ВГЧ-6В проводили амплификацию фрагмента (317 п.н.) гена U86 ВГЧ-6B, используя внешние праймеры, P2F GGAACTAGGTCTGTATGATAAACTG и P3R AGAGTTCCTACAGAGAATCTAG, и внутренние праймеры, P2FB CTGATTGCGTCAGGAGACG и P3RB CCGATAGAGGATATGACTCTAACTTTAGAC. Последовательности проверяли на образование димеров, шпилек и других вторичных структур (https://eu.idtdna.com/site). Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы ЗАО «Синтол» (Россия). Секвенирование ДНК по Сэнгеру проводили на анализаторе ABI 3130 (Applied Biosystem, США) с последующей обработкой хроматограмм секвенирования и триммингом нуклеотидных последовательностей. Выравнивание сиквенсов на референсные геномы HHV-6B (GenBank NCBI acc. No. NC_000898) и HHV-6A (GenBank NCBI acc. No. NC_001664) проводили методом локального парного выравнивания (алгоритм Смита—Ватермана); трансляцию генов, идентификацию нуклеотидных и аминокислотных замен выполняли с использованием пакета UGENE 1.32 (Россия). Поиск гомологичных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей фрагмента гена U86 и построение филогенетического древа проводили с помощью сервиса BLAST NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Ранее принадлежность клинических 49 изолятов к ВГЧ-6B была установлена нами путем выявления специфических однонуклеотидных полиморфизмов в гене U67 методом ПЦР [7]. Исследование однородности изолятов ВГЧ-6B проводили путем анализа полиморфизма последовательности гена U86, имеющего <70% сходства у ВГЧ-6A и ВГЧ-6B и характерную делецию 15 п.н. у ВГЧ-6A [8]. Ген U86 расположен на комплиментарной цепи в референс-геноме HHV-6B штамма Z29 (NCBI Reference Sequence: NC_000898.1, позиции 127307-131901) и представлен одной открытой рамкой считывания, которая кодирует ранний белок (immediate-early protein) IE-A из 1520 аминокислотных остатков, экспрессируемый на ранних стадиях взаимодействия вируса с клеткой. После протеолитического расщепления белка его эпитопы в сочетании с лейкоцитарными антигенами (HLA класса 1) распознаются рецепторами CD8+ цитотоксических T-лимфоцитов (T-киллеров), обеспечивающих специфический противовирусный клеточный иммунитет [9].

Полученные нами в результате секвенирования по Сэнгеру последовательности фрагмента гена U86 49 клинических изолятов ВГЧ-6B депонированы в базе данных GenBank NCBI (регистрационные номера MK629887-MK629935). Нуклеотидные последовательности фрагмента гена U86 протяженностью 317 п.н. (позиции 131132—131448 в референс-геноме HHV-6B NC_000898) у 31 (63,3%) из 49 изолятов были идентичны референсной последовательности HHV-6B NC_000898, но отличались от последовательности HHV-6A NC_001664, имевшей характерную делецию. Вместе с тем секвенированные фрагменты U86 демонстрировали полиморфизм: у 18 (37%) были выявлены четыре варианта однонуклеотидных замен в разных областях секвенированного фрагмента гена U86(табл. 1, рис. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_03_025_add.zip). При этом последовательности 11 (6%) изолятов отличались от референсной по двум SNP, шести (3%) — по всем четырем SNP; один (0,5%) изолят имел три однонуклеотидные замены (табл. 2).

Таблица ١. Полиморфизм фрагмента гена U86 клинических изолятов ВГЧ-٦B в сравнении с референс-геномом (HHV-6B NC_000898)

Таблица 2. Однонуклеотидные полиморфизмы в гене U86 российских и зарубежных клинических изолятов ВГЧ-6B

Примечание. * — обозначения нуклеотидных последовательностей участка гена U86 (317 п.н.) 49 изученных российских изолятов согласно GenBank NCBI; ** — идентичность профиля по четырем позициям; *** — синонимическая замена.

Три из четырех однонуклеотидных замен являлись несинонимическими, что обусловило наличие «аминокислотных» вариантов белка. Синонимическая замена C>T (позиция 131206) оставила аминокислотную последовательность без изменения. Полиморфизмы, обнаруженные на относительно коротком участке, свидетельствуют о вариабельности нуклеотидной последовательности гена U86 ВГЧ-6B. Однако влияние подобных несинонимических замен на экспрессию белка не изучено.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей участка гена U86 (317 п.н.) 49 изученных российских изолятов выявил аналоги всех четырех вариантов профиля однонуклеотидных замен (сиквенс-типы) у 195 из нескольких сотен изолятов ВГЧ-6B различного географического происхождения, имеющихся в настоящее время в международной базе данных GenBank NCBI (см. табл. 2). Приведенные данные отражают актуальность популяционных исследований ВГЧ-6, в частности, в связи с оценкой роли персистенции вируса в патологии человека [4, 5].

Секвенирование фрагмента (317 п.н.) гена U86 подтвердило видовую принадлежность 49 исследованных нами изолятов ВГЧ-6B и позволило оценить распространенность и филогенетическое родство сиквенс-типов в российской и зарубежных популяциях вируса.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.