Высвобождение фагового потомства из бактерий-хозяев является конечной стадией жизненного цикла бактериофагов [1]. Нитевидные фаги, подобные M13, f1, fd, высвобождаются без лизиса, не вызывая гибели микробных клеток [2]. Другие же разрушают клеточную стенку, что приводит к лизису и гибели бактерий. Так, продукт гена E бактериофага φX174 ингибирует синтез муреина и олигомеризуется с образованием канала, соединяющего внутреннюю и наружную мембраны бактериальной клетки, через который цитоплазма покидает клеточную оболочку [3]. Способность белка E инактивировать грамотрицательные бактерии привела к созданию генетически инактивированных вакцин, известных как бактериальные тени (БТ) [4—6].
БТ — это лишенные цитоплазмы клеточные стенки бактерий с неповрежденными поверхностными структурами, содержащими потенциальные протективные антигены и/или обладающие выраженными адъювантными свойствами, а также способностью индуцировать местный и системный иммунитет [7]. Технологический цикл от инокуляции маточной культуры до очищенного концентрата БТ занимает не более суток, а широкий спектр возможных применений сочетается с относительно низкими затратами на производство и пригодностью одних литических конструкций для разработки вакцин против нескольких видов патогенов [6].
Безопасность вакцин на основе БТ не полностью гарантирована из-за возможного сбоя в опосредованной геном E инактивации бактериальных клеток. Полученные путем лизиса с использованием белка E БТ Escherichia coli содержали 1,2% [8], БТ Salmonella enterica serovar Enteritidis приблизительно 10% [9], а БТ Bordetella bronchiseptica — 2% живых клеток [10].
Для усиления литической способности гена E в дополнение к нему в бактериальные клетки вносят другие связанные с бактериолизом гены, такие как гены холина и эндолизина фага λ [11]. С другой стороны, различия в степени деградации бактериальных клеток при использовании различных литических плазмид дают возможность подобрать варианты бактериальных теней нескольких видов патогенов с оптимальным сочетанием степени деградации клеточной стенки и протективной активностью.
В настоящей работе на модели E. coli создан набор плазмид, обеспечивающих за счет различных комбинаций кассет генов лизиса бактериофагов λ [12] или Л-413C [13] с геном E бактериофага φX174 [14] различную степень деструкции клеточной стенки энтеробактерий.
Материалы и методы
Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в работе, представлены в табл. 1. Штамм E. coli DH5α выращивали в жидкой или на агаризованной среде LB (Luria Bertani broth medium — триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л, pH 7,2) [15] с добавлением при необходимости хлорамфеникола до концентрации 20 мкг/мл. Оптическую плотность бактериальных культур измеряли при длине волны 550 нм (ОП550) на McFarland densitometer DEN-1B (BioSan).
Таблица 1. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в исследовании
| Штамм или плазмида | Генотип или соответствующая характеристика | Источник |
| E. coli DH5α | F-, gyrA96(Nalr), recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17(rk-, mk+), glnV44, deoR, Δ(lacZYA-argF)U169, [φ80dΔ(lacZ)M15], supE44 | Invitrogen |
| pACYC184 | Источник p15A ori и cat-гена | [16] |
| pBAD/myc-HisA | Источник терминатора транскрипции rrnB | Invitrogen |
| pET32b (+) | Источник полилинкера | Novagene |
| pEYR’ | Экспрессирующий вектор (pA15 ori, Cmr, cI857/pR’) | НИ |
| pEYR’-E | pEYR’ C геном белка E фага φX174 | НИ |
| pEYR’-Y-K | pEYR’ C генами холина Y и эндолизина K фага Л-413C | НИ |
| pEYR’-Sam7-R-Rz | pEYR’ C генами холина S (амбер-мутант Sam7), эндолизина R, и спанинов Rz и Rz1 фага λ | НИ |
| pEYR’-E-Y-K | pEYR’ C генами белка E фага φX174, холина Y и эндолизина K фага Л-413C | НИ |
| pEYR’-E-Sam7-R-Rz | pEYR’ C генами белка E фага φX174, холина S (амбер-мутант Sam7), эндолизина R, и спанинов Rz и Rz1 фага λ | НИ |
Примечание. *НИ — настоящее исследование
Молекулярное клонирование проводили как описано в руководстве [15], с использованием ферментов производства Thermo Scientific (США). Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase была использована для амплификации фрагментов ДНК при клонировании. Для ПЦР-скрининга клонов использовали Taq-полимеразу. Праймеры, использованные в работе, представлены в табл. 2.
Таблица 2. Последовательности праймеров, использованных в работе
| Праймер | Последовательность (5’-3’) |
| pEY-1 (ClaI) | CCCATCGATCATATCGTCAATTATTAC* |
| pEY-2 (SphI) | ATATTGCATGCTGTCAAACATGAGAATTAC |
| pEY-5 (NdeI) | GGCCATATGCACCATCATCATC |
| pEY-6 | TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG** |
| pEY-7 | CACCACCACCACCACCACTGATGAGTTTAAACGGTCTCCAG |
| pEY-8 (ClaI) | CCCATCGATTTGCTTCGCAACGTTCAAATC |
| pR-For (SphI) | CACAAAGCATGCGGAGTGAAAATTCCCCTAATTCG |
| pR(T>C) (NdeI) | GTGCATATGAACCTCCTTAGTACATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAATAGTCAACACGCGCGGTGTTAG |
| E1 (NdeI) | AGGCATATGGTACGCTGGACTTTGTG |
| E2 (XhoI) | AATCTCGAGTCACTCCTTCCGCACGTAA |
| Y-NdeI (NdeI) | GGTGGCATATGACAGCAGAAGAAAAAAGC |
| Y-SalI (SalI) | GCCGTCGACAACAGGAGGAATTAACCATGACAGCAGAAGAAAAAAGC |
| K-XhoI (XhoI) | ATTCTCGAGTTAAGCCGGTACGCCGCCAG |
| S-R-Rz-For (SalI) | AAAGTCGACAACAGGAGGAATTAACCATGAAGATGCCAGAAAAACATG |
| S-R-Rz-Rev (XhoI) | ATTCTCGAGCTATCTGCACTGCTCATTAAT |
Примечание. * — сайты связывания эндонуклеаз рестрикции подчеркнуты; ** — курсивом выделены комплементарные последовательности.
Для конструирования вектора pEYR’ фрагмент, содержащий репликон pA15 и ген устойчивости к хлорамфениколу, амплифицировали из плазмиды pACYC184 с использованием праймеров pEY-1 и pEY-2. Промотор pR’ амплифицировали с ДНК фага λ cI857Sam7 (праймеры pR-For и pR(T>C)). Полилинкер плазмиды pET32b(+) и фрагмент плазмиды pBAD/myc-HisA, содержащий терминатор транскрипции rrnB амплифицировали с праймеров pEY-5-pEY-6 и pEY-7-pEY-8 соответственно. Оба фрагмента соединяли в один методом SOE (Splicing by overlap extension) с использованием праймеров pEY-5 и pEY-8. Три фрагмента обрабатывали соответствующими рестриктазами и лигировали вместе. Лигатом трансформировали клетки E. coli DH5α. Из отобранных клонов выделяли плазмидную ДНК и проверяли ее соответствие расчетной конструкции рестрикционным анализом и секвенированием. В данном векторе клонировали различные комбинации генов литических белков.
Сконструированными плазмидами трансформировали клетки E. coli DH5α и использовали полученные штаммы для определения активности литических кассет.
Для наработки БТ в пробирки с LB бульоном с хлорамфениколом вносили ночную культуру штамма E. coli DH5α, несущего литическую плазмиду, до оптической плотности ОП550=0,2. Пробирки инкубировали на шейкере при температуре 28 °C и скорости вращения 160 об/мин до достижении культурой ОП550=0,6. Затем половину культуры переносили в новую пробирку и инкубировали на шейкере при температуре 42 °C. Лизис клеток после индукции контролировали каждый час путем измерения оптической плотности бактериальных культур (ОП550) и подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве десятикратных серийных разведений в изотоническом растворе NaCl (0,9%) на LB-агар каждые 2 ч.
Для трансмиссионной электронной микроскопии препараты теней фиксировали глутаровым альдегидом и четырехокисью осмия, заливали аралдитом, контрастировали срезы уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в трасмиссионном электронном микроскопе SpiritBioTWIN (FEI, Голландия, Чехия) при ускоряющем напряжении 120 кВ и увеличении от 10 000 до 100 000 крат. Ультратонкие срезы бактерий фотографировали с помощью CCD-камер высокого разрешения GatanOriusSC200W 120 kV и GatanOriusSC 1000В 200 к V при рабочих увеличениях трансмиссионного электронного микроскопа 10—20 тысяч крат. С каждого образца фотографировали по 15—20 случайных полей с экваториальными срезами не менее 300—500 клеток.
Результаты и обсуждение
Созданный набор плазмид предназначен для экспрессии кассет генов литических белков бактериофагов φX174, λ (cI857Sam7) и Л-413C. Векторы, которые используют для этих целей, должны обладать следующими характеристиками: небольшое количество копий на клетку, строго контролируемый индуцируемый промотор, наличие универсального сайта для множественного клонирования и модульное строение, чтобы обеспечить будущие адаптации.
Сконструированная плазмида pEYR’ представляет собой вектор на базе репликона p15A с копийностью 5—20 копий на клетку, способный реплицироваться в различных видах семейства Enterobacteriaceae. Плазмида содержит ген устойчивости к хлорамфениколу cat из транспозона Tn9, терминатор транскрипции рибосомальных генов E. coli rrnB и мутантный вариант промотора бактериофага λ pR (pR’) с мутациями в гене белка-репрессора cI (cI857) и во втором операторе [17], что позволяет экспрессировать гены при повышении температуры культивирования до 42 °C. В данном векторе pEYR’ клонировали все варианты кассет генов литических белков (рис. 1, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_03_029_add.zip).
Литическая кассета плазмиды pEYR’-Y-K состоит из генов холина (Y) и эндолизина (K) бактериофага Л-413C, клонированных по сайтам рестрикции NdeI-XhoI. В кассете плазмиды pEYR’-E-Y-K к генам холина (Y) и эндолизина (K) бактериофага Л-413C с собственным сайтом связывания рибосом, клонированных по сайтам рестрикции SalI-XhoI, добавили ген белка E бактериофага φX174, клонированный по сайтам рестрикции NdeI-SalI. Кассета плазмиды pEYR’-Sam7-R-Rz включала гены холина (Sam7), эндолизина (R) и спанинов (Rz и Rz1) бактериофага λ (cI857Sam7) с собственным сайтом связывания рибосом, клонированных по сайтам рестрикции SalI-XhoI. Кассета плазмиды pEYR’-E-Sam7-R-Rz состояла из генов холина (Sam7) и эндолизина (R) и спанинов (Rz и Rz1) бактериофага λ (cI857Sam7) с собственным сайтом связывания рибосом, клонированных по сайтам рестрикции SalI-XhoI, и гена белка E бактериофага φX174, клонированного по сайтам рестрикции NdeI-SalI.
У полученных в результате трансформации литическими плазмидами производных штамма E. coli DH5α изучали способность образовывать БТ при различных температурах культивирования. Эксперименты показали, что рост при температуре 28 °C не вызывает лизиса бактериальных культур (рис. 2, а, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_03_029_add.zip, табл. 3). При повышении температуры с 28 °C до 42 °C наблюдали лизис культур штаммов DH5α/pEYR’-E, DH5α/pEYR’-Y-K, DH5α/pEYR’-E-Y-K, DH5α/pEYR’-E-Sam7-R-Rz (см. рис. 2, б, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_03_029_add.zip, см. табл. 3).
Таблица 3. Жизнеспособность штаммов E. coli DH5α, содержащих различные литические плазмиды при температурах культивирования 28 °C и 42 °C
| Плазмида | 0 ч | Время после индукции, ч | |||
| 2 ч | 4 ч | ||||
| КОЕ/мл | |||||
| 28 °C | 28 °C | 42 °C | 28 °C | 42 °C | |
| pEYR` | 1,6×108 | 7,8×108 | 8,7×108 | 9×108 | 9,3×108 |
| pEYR`-E | 3,6×108 | 2,8×108 | 0 | 1,0×109 | 0 |
| pEYR’-Y-K | 2,8×108 | 4,6×108 | 0 | 7,3×108 | 0 |
| pEYR’-E-Y-K | 1,6×108 | 2,1×108 | 0 | 7×108 | 0 |
| pEYR’-Sam7-R-Rz | 1,9×108 | 2,7×108 | 3,9×108 | 4,3×108 | 7,3×108 |
| pEYR’-E-Sam7-R-Rz | 2,7×108 | 3,2×108 | 0 | 4,3×108 | 0 |
Исключение составил лишь штамм DH5α/pEYR’-Sam7-R-Rz, несущий кассету генов Sam7-R-Rz бактериофага λ (cI857Sam7). Амбер-мутация в гене холина (Sam7) приводит к отсутствию синтеза белка S и накоплению эндолизина R и спанинов Rz и Rz1 в цитоплазме бактериальной клетки. Лизис клеток DH5α/pEYR’-S-R-Rz практически не наблюдался при росте культуры, как и у контрольного штамма DH5α/pEYR’.
Анализ ультратонких срезов препаратов БТ методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) показал положительную корреляцию с данными определения оптической плотности и результатами высевов индуцированных культур сконструированных штаммов, а также позволил оценить тонкое строение бактериальных клеток, несущих различные комбинации литических фаговых генов (рис. 3, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_03_029_add.zip).
Как видно из рис. 3, а, клетки контрольного штамма DH5α/pEYR’, несущего векторную плазмиду, сохранили интактную структуру после индукции. То же можно сказать и про штамм DH5α/pEYR’-Sam7-R-Rz (см. рис. 3, а, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_03_029_add.zip). Клетки же остальных штаммов подверглись различной степени лизиса, сопровождавшегося потерей цитоплазматического содержимого, в результате частичного разрушения цитоплазматической мембраны и клеточной стенки под действием различных комбинаций литических фаговых белков.
Ранее было показано, что при образовании БТ инактивация E. coli может быть не абсолютной — незначительное количество жизнеспособных клеток присутствовало в препарате бактериальных теней [5, 8]. По нашим данным, после индукции фаговых генов число жизнеспособных клеток в суспензиях DH5α/pEYR’-E, DH5α/pEYR’-Y-K, DH5α/pEYR’-E-Y-K, DH5α/pEYR’-E-S-R-Rz быстро снижалось (см. табл. 3). Ни одной живой клетки не обнаружили на втором часу культивирования после подъема температуры до 42 °C при высеве на питательный агар LB. Таким образом, эффективная продукция эндолизинов в сконструированных штаммах обеспечивает быструю инактивацию E. coli с образованием бактериальных теней.
В представленной работе мы впервые продемонстрировали, что использование холина и эндолизина фага Л-413C в отдельности или в сочетании с белком E бактериофага φX174 способствует эффективному образованию БТ E. coli. Кроме того, мы наблюдали, что совместная экспрессия генов лизиса E и S-R-Rz позволяет более эффективно инактивировать клетки E. coli во время процедуры формирования бактериальных теней по сравнению с использованием литической плазмиды pEYR’-S-R-Rz, несущей только гены холина, эндолизина и спанинов S-R-Rz, но незначительно уступает по эффективности плазмидам pEYR’-E, pEYR’-Y-K и pEYR’-E-Y-K.
Заключение
Таким образом, совместная экспрессия литического гена E фага φX174 и генов холина-эндолизина фага Л-413C индуцирует быструю и эффективную продукцию БТ. Мы считаем, что стратегия использования БТ обладает потенциалом при создании высокоэффективных инактивированных вакцин-кандидатов, которые могли бы заменить имеющиеся в настоящее время бактериальные термоинактивированные и формолвакцины. В пользу этого предположения свидетельствует наша недавняя публикация [18], посвященная конструированию на основе аттенуированного штамма чумного микроба производных с различным сочетанием описанных в данной работе литических плазмид, показавшая, что увеличение степени деградации пептидогликана вплоть до его полного гидролиза достоверно повышает протективность препаратов БТ, возможно, за счет образования адъювантно-активных молекул мурамилдипептида (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина) [19], усиливающих иммунный ответ.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант 19-15-00072).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.