Введение

Культивирование клеток — процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» связан в основном с выращиванием клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот (животных, человека).

В настоящее время культуры клеток человека и животных стали важным инструментом, используемым во многих областях естественных наук. Они находят все большее применение в научных исследованиях, практической и регенераторной медицине, современных биотехнологиях. Актуальным остается применение стволовых клеток в клинической медицине при лечении сахарного диабета [1], сетчатки глаза [2], легких [3], прогрессирующей неоваскулярной возрастной дегенерации желтого пятна [4], воспалительных заболеваний кишечника [5], печени [6] и сердца [7].

Клеточная культура — размножение и выживание клеток в искусственной среде. С этим понятием тесно связан термин «клеточная линия». Клеточная линия — совокупность клеток, полученная из первичной культуры путем увеличения количества клеток после нескольких генераций с преобладанием клеток или линий дифференцировки с высоким темпом роста и высокой однородностью клеточной популяции. Как только первичная культура посеяна, она называется клеточной линией.

В связи с невозможностью привести полный и подробный список необходимых требований для работы с клеточной культурой из-за большого объема нормативных документов [8—14] в данной работе приводится лишь краткое описание, основанное на личном опыте автора и частично на мировой практике в вопросах безопасности.

Историческая справка

Культура тканей как метод впервые была использована более века назад для изучения процессов эмбрионального развития. Так, S. Ringer в 1880-х годах описал концентрации кальция, калия и натрия, необходимые для поддержания сердечного сокращения лягушки [15, 16]. В 1885 г. W. Roux культивировал куриную эмбриональную ткань в физиологическом растворе в течение нескольких дней. В 1907 г. R. Harrison из Университета Джона Хопкинса первым успешно вырастил нервные волокна in vitro из эмбриональных тканей лягушки, эта тканевая культура успешно сохранялась ex vivo в течение 1—4 нед [17]. В 1912 г. A. Carrel, работавший в Институте Рокфеллера, проводил эксперименты по улучшению состояния культуры клеток животных на модели культуры тканей куриного эмбриона [18]. Ему удалось из сердечного фрагмента куриного эмбриона на 3-й месяц культивирования вырастить соединительную ткань.

Следующим важным достижением стала демонстрация K. Sanford и соавт. (1948) возможности культивирования одиночных клеток млекопитающих на стеклянных пластинах в жидкой среде для получения первой непрерывной клеточной линии [19]. До этого ткани прикрепляли к покровным стеклам, переворачивали и выращивали в каплях крови или плазмы. Наряду с этим в 1955 г. H. Eagle установил, что ранее используемые вещества (сложные экстракты тканей, сгустки и т.д.) для выращивания клеток могут быть заменены на «смесь аминокислот, витаминов, кофакторов, углеводов и солей, дополненные небольшим количеством сывороточного белка...» [20], открыв новые возможности для культивирования клеток. Это увеличило диапазон манипуляций, которые раньше были невозможны при работе с клетками: получение генетически измененных клеточных линий посредством мутагенеза и клонирования, прямое сравнение клеток из нормальных и трансформированных тканей, изучение клеточной физиологии и метаболизма, а также рост нормальных и трансформированных клеток человека in vitro [21—23].

Данные открытия привели к тому, что были созданы клеточные линии, поддерживающие дифференцированные функции, характерные для клеток по типу их происхождения, таких как клетки надпочечников, гипофиза [24], нейронов [25], миоцитов [26] и гепатоцитов [27]. Также были разработаны диплоидные клеточные линии — HeLa [28], MRC-5 и WI-38 [29] из человеческой ткани и Vero, полученная из ткани обезьяны [30]. Это позволило изучать не только рост клеток, но и реакцию на гормоны и другие факторы окружающей среды, выработку и секрецию гормонов, а также другие дифференцированные функции in vitro.

Информация о том, что у каждого типа клеток есть оптимальное сочетание питательных веществ, поддерживающих их функции [31], привела к появлению питательных сред, используемых для культивирования определенных типов клеток в специализированных условиях. Вместе с тем замена сыворотки определенными компонентами, такими как поверхностные и транспортные белки, гормоны и факторы роста [32, 33], дала возможность для поддержания специализированных клеток и тканей в in vitro продолжительное время, что способствовало появлению новых биологических открытий, например рекомбинантной экспрессии белков и созданию линий гибридомных клеток, продуцирующих антитела.

Условия культивирования клеток

Лаборатории клеточных культур представляют собой особые области, отличающиеся от многих других рабочих мест. Специальные методы, используемые в этих лабораториях, требуют большого количества различного оборудования, растворителей, химикатов и реагентов. Существует много агрессивных, токсичных, легковоспламеняющихся и мутагенных химических веществ. Кроме того, часть оборудования имеет сложные конструкции и механизмы. Недостаточная информация о свойствах и использовании этого оборудования может привести к травмам. Также неправильное их использование может привести к поражению электрическим током или пожару. Некоторые химические вещества, используемые в лаборатории, могут быть опасны для человека или окружающей среды. Так, например, вдыхание, контакт с кожей или слизистыми оболочками, брызги на кожу, взрывы или пожары, а также неисправности при утилизации отходов — вот некоторые из общих проблем безопасности.

Другая степень опасности проистекает из характеристик биологических материалов, используемых в исследованиях клеточных культур. В основном это ткани, жидкости и клетки, полученные от человека и животных. Исследователи могут быть заражены различными бактериальными и вирусными агентами, грибами, микоплазмой, которые могут нести эти материалы в соответствии с типом полученного организма, если не принимаются достаточные меры безопасности. В частности, при использовании клеточного штамма, инфицированного или трансформированного латентными вирусами, необходимо более осторожное отношение к процедурам безопасности, требующим неукоснительного соблюдения. Тем не менее некоторые клеточные штаммы несут онкогенный потенциал спонтанно или в результате вмешательства, и существует риск развития рака при доступе к макроорганизму.

Специализированные боксы и различные способы контроля (автоматизированные системы культивирования и анализа (биостанции) с возможностью настраиваемых удаленно параметров, техническое обслуживание боксов, соблюдение передовых лабораторных методов и использование специальных средств индивидуальной защиты для конкретного процесса/исследования) играют важную роль в предотвращении или минимизации таких опасностей (см. таблицу) [34].

Классификация риска на основе типа клеток

Происхождение и источник клеток

Выделяют первичные и вторичные клеточные культуры. Первичные клеточные культуры получают из эмбриональной ткани животных и человека, поскольку эмбриональные клетки обладают способностью к росту и размножению [35]. Чаще культуры клеток готовят из смеси нескольких тканей, например кожной, костной и мышечной. Так получают фибробласты эмбриона человека (ФЭЧ), клетки почек человека (КПЧ) и др. Для получения клеточных культур используют эмбриональную ткань человека (в случае прерывания беременности), а также 8—12-дневные куриные эмбрионы [36].

Получение первичных клеточных культур непосредственно из органов и тканей различных животных, особенно тех, которых отлавливают в природе (млекопитающих, птиц, рыб, насекомых), приводит к частой контаминации клеток вирусами, нередко небезопасными для человека.

Чистые клеточные линии представляют минимальный риск для здоровья человека и окружающей среды. Вследствие иммунного отторжения чужеродных тканей маловероятно, что случайное воздействие культивируемых клеток приведет к их выживанию и размножению у нормальных здоровых людей (за исключением некоторых опухолевых клеток), что не отменяет соблюдения правил техники безопасности при работе с биологическими объектами [37].

Вирусное загрязнение

Вирусы, патогенные для человека, являются одной из наиболее вероятных биологических угроз, представленных клеточными культурами. Основными вирусами, контаминирующими ткани человека, являются вирусы гепатита; ретровирусы человека; вирусы герпеса; popovirues; прионы [34, 38].

Зараженные вирусом культуры клеток представляют опасность для сотрудников лаборатории, пациентов, а также для чистых клеточных культур. В отличие от бактериального и грибкового загрязнения вирусное загрязнение не может быть обнаружено с помощью нормальной световой микроскопии. Только при морфологической модификации культивируемых клеток, такой как цитопатический эффект, можно заподозрить контаминацию вирусом [34, 35, 38].

Культуры клеток могут быть загрязнены следующими способами:

1) инфицированы как первичные культуры (поскольку источник клеток уже был заражен);

2) инфицированы в результате использования зараженного сырья;

3) через животный пассаж.

Микоплазмы

Во всем мире основными источниками контаминации считаются вирусы, но не менее значимой и опасной признается микоплазма (Mycoplasma pneumoniae). Молликуты, часто называемые микоплазмами, представляют собой группу чрезвычайно мелких бактерий [34].

Клеточные культуры всех типов, ведущие свое происхождение от различных эукариотических организмов (млекопитающие, птицы, рептилии, рыбы, насекомые и растения), подвержены контаминации микоплазмами [39]. По результатам экспериментальных работ, проведенных в разных странах мира, пораженность культур микоплазмами в различных лабораториях варьирует от 15 до 80%, а в некоторых достигает 100% [40—42].

В отличие от прямых видимых загрязнений бактериями или грибами, которые убивают клетки в течение нескольких дней, микоплазмы способны сохраняться в постоянных клеточных культурах и не обнаруживаться в течение многих лет. Единственный гарантированный способ выявления загрязнения микоплазмой — это периодическое тестирование культур с использованием флюоресцентного окрашивания, ПЦР, авторадиографии [36]. Для обнаружения микоплазм в клеточных культурах используются системы молекулярно-генетического тестирования. Этот анализ основан на способности иммунной системы (в частности, TLR2) распознавать микоплазмы и может быть внедрен в процедуры культивирования клеток для проведения рутинных проверок на все виды загрязнения микоплазмой (см. рисунок).

Пути заражения клеточных культур микоплазмами.

Перекрестное загрязнение

Перекрестная контаминация (cross contamination) — это именование клеточной линии с другими/неправильными признаками. При исследованиях изофермента, проведенных в 1960-х годах, было показано, что 18 из 20 клеточных линий человека имеют сродство с клетками HeLa [28].

Причины перекрестного загрязнения: неправильная маркировка флаконов с культурой в результате небрежности персонала при работе с клеточными линиями; загрязнение одной клеточной линии путем переноса в нее другой клеточной линии через общие флаконы с питательной средой [43], нестерильные инструменты или по воздуху (клетки HeLa способны перемещаться по воздуху с частицами пыли или на нестерильных инструментах, недостаточно тщательно вымытых руках, одежде [28]).

Загрязнение культуральных сред

При культивировании клеток используются среды животного происхождения, что могут выступать в качестве потенциального источника загрязнения [44]. Большинство сред, сывороток и других биологических препаратов животного происхождения пропускают через мембранные фильтры (иногда также используется УФ- или ɣ-излучение), так как их нельзя стерилизовать нагреванием для удаления биологических загрязнений. Вещества, простерилизованные через фильтр непосредственно в лаборатории, следует всегда проверять на стерильность перед использованием. В фабричных продуктах стерильность гарантирует производитель. Но нужно иметь в виду, что фильтрация через мембраны 0,2 мкм, являющаяся эффективной для устранения большинства биологических загрязнений, не может гарантировать полное удаление вирусов и микоплазм, особенно в сыворотках.

Биобезопасность и управление рисками в лабораториях in vitro

Риски, которым подвергается персонал, работающий в лаборатории клеточных культур, классифицируют на две основные группы: риски, связанные с рабочей зоной, и риски, связанные с рабочими материалами. Риски, которым подвергаются сотрудники, могут влиять как на здоровье, так и на окружающую среду. Чтобы избежать этого, персонал лаборатории должен соблюдать действующие правовые нормы и требования, изложенные в протоколах о работе и безопасности. Важным документом, в котором подробно изложены риски и меры предосторожности при работе с клеточными культурами, является «Руководство по биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях», подготовленное ВОЗ совместно с Национальным институтом здоровья (США) [8, 9]. В этом Руководстве были определены четыре основных уровня безопасности (BSL1—4) и меры предосторожности, на его основании в каждой лаборатории клеточных культур создаются Инструкции по биобезопасности в зависимости от объема исследований, целей и задач.

Необходимым требованием для работы с клеточными культурами является стерильность ламинарных боксов и окружающих помещений, в которых процедуры выполняются с минимумом загрязнений [45, 46]. Создать полностью стерильную лабораторию без загрязнения микроорганизмами практически невозможно, но уровень контаминации должен быть сведен к минимуму. Для этого необходимо ежедневное, в течение не менее 1 ч для боксового помещения и не менее 40 мин для ламинара, облучение ультрафиолетом до начала работы и после ее окончания. Ламинар снаружи и внутри обрабатывают специальными дезинфицирующими средствами. Все используемые материалы после окончания работы должны быть дезактивированы путем автоклавирования или дезинфекции перед утилизацией. Стеклянную посуду, используемую в работе, помещают в емкости со стерилизующей жидкостью (как правило, это 1% раствор гипохлорида натрия). Для проверки стерильности бокса в ламинар помещают чашки Петри с твердыми питательными средами, селективными для бактериальной микрофлоры воздушной среды. Чашки оставляют открытыми в течение 4 ч, после чего закрывают и инкубируют при 25—37 °C в течение 2 сут. Отсутствие роста бактериальных колоний на поверхности агара — показатель правильной подготовки ламинара к работе.

Важнейшей особенностью лаборатории является отделение стерильной рабочей зоны от других зон. Зоны культивирования клеток должны занимать ограниченное пространство с минимальным количеством персонала. Фильтрация воздуха является одним из наиболее важных вопросов. В культуральном боксе должна быть кабина с ламинарным потоком класса II, в котором после отбора чистого воздуха снаружи и стерилизации его подают в бокс с положительным давлением. Это гарантирует, что количество частиц в окружающем пространстве минимально. Ламинар с воздушным потоком, микроскоп и инкубатор должны быть расположены близко друг к другу, чтобы физический контакт культур был сведен к минимуму. Выполнение нестерильных процессов, таких как промывание культуры, должно происходить на другой стороне стерильной зоны. Система воздушного охлаждения необходима из-за тепла, выделяемого электронными устройствами. Такие меры предосторожности служат для уменьшения количества загрязняющих веществ и сводят их до минимума. Только руки сотрудника, выполняющего необходимые манипуляции с культурой клеток, должны контактировать с кабиной с ламинарным потоком, являющейся стерильной зоной. Все лабораторные помещения следует регулярно обрабатывать дезинфицирующими средствами.

Необходимо строго соблюдать рекомендации BSL-2 в отношении средств защиты персонала, таких как лабораторные халаты, перчатки и средства защиты глаз. Тестирование на вирусы является обязательным и очень важным этапом для снижения опасности использования зараженных вирусом клеточных линий, но не обеспечивает абсолютную безопасность, так как существует риск заражения случайными агентами. Следовательно, пользователи и производители биотехнологических продуктов, работающие с клетками животных, должны строго придерживаться вышеописанных правил по биобезопасности и гарантировать отсутствие каких-либо случайных агентов и/или вирусов.

Заключение

Работа с клеточной культурой является потенциально опасной как для персонала, работающего непосредственно с данной культурой, так и для окружающей среды в целом. Кроме того, опасность могут представлять и различные цитотоксические и химические вещества, CO₂ и жидкий азот, используемые в лабораториях in vitro.

Несмотря на сложности и возможные риски, исследования in vitro клеточных культур являются уникальным и перспективным направлением регенеративной и трансплантационной медицины. При этом терапия стволовыми клетками, помимо этических противоречий, вызывает большие проблемы биобезопасности: подавление противоопухолевого ответа с последующим ростом опухолей и метастазированием, способность дифференцироваться в клетки других тканей и т.д. Таким образом, все исследования с использованием клеточных культур должны быть направлены на постоянный мониторинг и наблюдение за возможностью возникновения риска заражения человека и окружающей среды.

Финансирование. Работа выполнена в рамках выполнения государственного задания по теме НИР №0545-2019-0007 «Молекулярные механизмы образования устойчивых некультивируемых форм бактерий».

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

The author declare no conflicts of interest.