Введение

Хронические миелопролиферативные заболевания (ХМПЗ) — это гетерогенная группа заболеваний системы кроветворения. С мутациями в гене JAK2 связано около 95% случаев истинной полицитемии, 60% случаев первичного миелофиброза и 55—60% эссенциальной тромбоцитемии. В то же время на долю мутаций в гене CALR приходится 25—30% эссенциальной тромбоцитемии и 20—30% случаев первичного миелофиброза. Для мутаций в гене MPL эти цифры составляют 5—7 и 7—10%, соответственно [1]. Согласно международным и отечественным клиническим рекомендациям, выявление данных молекулярно-генетических маркеров является обязательным на этапе диагностики ХМПЗ и дифференциальной диагностики схожих по клинической картине заболеваний системы крови [2—4]. На диагностическом этапе важен лишь факт наличия таких мутаций вне зависимости от величины аллельной нагрузки [5]. При этом известно, что терапия JAK2-ингибиторами существенно не меняет аллельную нагрузку JAK2 [6]. Однако в одной из последних работ клиники Mayo была показана важность дискриминации аллельной нагрузки <0,1% от более высоких значений, так как последние чаще приводили к клональной прогрессии, а также большей доле манифестных ХМПЗ [7]. Достаточно узкой областью, где важны количественные результаты анализа мутаций V617F в гене JAK2, W515L/K в гене MPL и в гене CALR, остается мониторинг пациентов после проведения аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. В первую очередь это пациенты с первичным миелофиброзом [8]. Также количественный анализ JAK2 V617F может быть важен для выявления клонального гемопоэза неопределенного потенциала (clonal hematopoiesis of indeterminate potential, CHIP) [9, 10], а предложение снизить пороговое значение CHIP с 2 до 0,1% [7] указывает на необходимость использования чувствительных тест-систем.

Сегодня доминирующей технологией выявления молекулярных маркеров при ХМПЗ является полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ). На рынке РФ представлено несколько тест-систем для выявления мутаций JAK2 V617F и MPL W515L/K, которые используются в большом количестве лабораторий в нашей стране. Многие коммерчески доступные в нашей стране тест-системы для выявления этих маркеров позволяют проводить количественный анализ. Однако в доступной нам литературе не встретилось результатов валидации данных тест-систем на независимых выборках. Более того, известно, что аналитическая чувствительность коммерческих тест-систем, которая приводится в инструкциях производителей, часто определяется на искусственных матрицах и зачастую не соответствует чувствительности при работе с реальными клиническими образцами. С широким внедрением тестирования молекулярных маркеров ХМПЗ в систему оплаты в рамках обязательного медицинского страхования существенно возросла доступность ПЦР-диагностики мутаций JAK2 V617F и MPL W515L/K [11, 12].

Ранее в нашей стране прямое сравнение показателей диагностической эффективности разных тест-систем при различных величинах аллельной нагрузки JAK2 V617F и MPL W515L/K не выполнялось, что и послужило предпосылкой к выполнению данной работы, которая проведена в рамках деятельности Межрегионального Совета по лабораторной диагностике при опухолевых и неопухолевых заболеваниях системы крови Национального гематологического общества [13].

Цель исследования – проанализировать диагностическую эффективность качественного и количественного выявления мутаций V617F в гене JAK2 и W515L/K в гене MPL при использовании коммерчески доступных тест-систем, использующих метод ПЦР-РВ.

Материалы и методы

Исследование проводилось на двух базах: в лаборатории молекулярной биологии, иммунофенотипирования и патоморфологии Областной детской клинической больницы г. Екатеринбурга (далее — лаборатория A) и в микробиологической лаборатории Челябинской областной клинической больницы (г. Челябинск) (далее —лаборатория B). Обе лаборатории проводят исследования мутаций JAK2 V617F и MPL W515L/K более 15 лет, обладают значительным опытом молекулярно-генетической диагностики ХМПЗ и ранее успешно проходили этапы внешней оценки качества, проводимые под эгидой Межрегионального Совета по лабораторной диагностике при опухолевых и неопухолевых заболеваниях системы крови.

Контрольные материалы (КМ)

Для изготовления КМ для детекции мутации V617F в гене JAK2 использовали ДНК, выделенную из клеточной линии UKE-1, в которой обе аллели JAK2 несут мутацию V617F. Для дальнейших расчетов аллельную нагрузку (АН) в ДНК из UKE-1 принимали за 100%. Контрольные образцы для детекции мутаций W515L и W515K в гене MPL изготавливали из ДНК пациентов, у которых данные мутации были верифицированы методами ПЦР-РВ и секвенирования по Сэнгеру.

Для выделения ДНК использовали наборы для колоночного выделения ДНК HiPure DNA Blood DNA Mini kit (Magen, Китай). Концентрацию ДНК определяли флуориметрическим методом на приборе Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием набора Qubit dsDNA BR Assay (Invitrogen, Сингапур). Необходимую аллельную нагрузку (АН) всех образцов рассчитывали теоретически и приводили к ожидаемым значениям с помощью растворителя – ДНК здоровых доноров. Для JAK2 V617F полученные (наблюдаемые) значения АН детектировали с помощью цифровой капельной ПЦР (цПЦР) на приборе QX-200 (Bio-rad, США) с использованием ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) (Bio-rad, США) и набора праймеров и двух зондов ddPCRMutation Assay: JAK2p.V617F c.1849G>T (Assay ID dHsaMDV27944642, Bio-rad, США) для количественной оценки аллелей дикого и мутантного типов. АН для мутации MPL W515L определяли методом цПЦР с использованием коммерчески доступных праймеров ddPCRMutation Assay: MPL p.W515L c.1544G>T(Assay ID dHsaCP2500572, Bio-rad, США), а для MPL W515L использовали цПЦР с самостоятельно подобранными праймерами и двумя зондами (ДНК-синтез, Россия). Во всех случаях АН рассчитывали, как отношение числа копий мутантной аллели к сумме аллелей дикого и мутантного типов, выраженное в процентах. Во избежание случайной ошибки все разведения КМ в ходе цПЦР тестировали в 5 повторах, и наблюдаемые значения представляли как среднее ± стандартное отклонение. В табл. 1 указана характеристика КМ, которые были подготовлены для настоящего исследования.

Таблица 1. Характеристики КМ

Примечание. *расчетное (теоретическое) значение при подготовке; ** фактическое значение, представленное в виде среднее±стандартное отклонение, результат измерения организатором в 5 повторах методом цПЦР.

Наблюдаемая АН считалась целевой для дальнейшего тестирования методом ПЦР-РВ. Всего было подготовлено 9 типов контрольных образцов: по три уровня АН для трех исследуемых мутаций, каждая из которых была в 5 повторах. К 45 позитивным образцам было добавлено 18 негативных образцов. Таким образом, каждая лаборатория получила по 63 образца, которым предварительно были присвоены случайные цифровые коды. Концентрация ДНК в каждом образце была 20 нг/мкл, объем — 50 мкл.

Использованные тест-системы

В рамках исследования централизованно были закуплены 4 коммерчески доступных тест-системы для выявления мутации V617F в гене JAK2: JAK2 V617F-тест (ООО «Генотехнология», Москва), «Миелоскрин» (ООО «Формула гена», Красноярск), JAK2 MutaPrime RQ Kit (ООО «Иноген», Санкт-Петербург) и JAK2 V617F (ЗАО «Синтол», Москва) и 3 тест-системы для выявления мутаций в гене MPL: MPL W515L/K-тест (ООО «Генотехнология», Москва), «Миелоскрин» (ООО «Формула гена», Красноярск), MPL W515 MutaPrime R Kit (ООО «Иноген», Санкт-Петербург). Выбор именно этих тест-систем был связан с ранее полученным позитивным опытом сравнительного анализа качественного и количественного выявления мутаций JAK2 V617F и MPL W515L/K в рамках предыдущих раундов внешней оценки качества.

Необходимо отметить, что в разных наборах расчет количественных показателей производился по-разному. Наборы производства ООО «Геотехнология» комплектуются плазмидной ДНК в разведениях от 10² до 10⁶, отдельно для аллели дикого типа и мутантной аллели, по которым строятся калибровочные кривые, а расчет производится по формуле:

.

где CNmut – это количество копий аллеля с мутацией, CNwt — количество копий аллеля дикого типа (без мутации).

Набор производства ЗАО «Синтол» нормализует количество копий мутантной аллели JAK2 на количество копий контрольного гена FCGR, проводя расчет согласно стандартному линейному уравнению y=β₁x+β₀, где у – АН V617F, а коэффициенты β₀ и β₁ рассчитываются исходя из x=∆Ct=Ct_V617F –Ct_FCGR калибраторов с известной АН. Набор от производителя ООО «Формула гена» предлагает формулу расчета, исходя из пороговых циклов аллелей дикого и мутантного типов:

.

В наборе JAK2 MutaPrime RQ Kit от ООО «Иноген» использованы четыре ДНК-калибратора в разном соотношении аллелей дикого и мутантного типов для построения калибровочной кривой. Набор MPL W515 MutaPrime R Kit этого же производителя предлагает формулу расчета, исходя из пороговых циклов аллелей дикого и мутантного типов:

.

Тестирование в лабораториях-участниках

Использованные приборы для детекции включали Rotor-Gene Q (Qiagen GmbH, Малайзия) и LightCycler 96 (Roche, Швейцария) для лабораторий A и B соответственно.

Статистический анализ данных

Вместе с пробами и тестами участникам был направлен сопроводительный бланк в формате MS Excel, в который они вносили первичные данные, включавшие марку амплификатора, полученную АН, формулу для расчета АН, использовавшуюся тест-систему. Сопроводительный бланк служил основным источником первичных данных и был впоследствии обработан в программном обеспечении для анализа данных R [14].

Для анализа номинативных данных использовали показатели специфичности —доля истинно негативных значений среди всех негативных, чувствительности – доля истинно позитивных значений среди всех позитивных и точности — доля истинных значений теста (чувствительность + специфичность) среди всех значений. Доверительные интервалы для биномиального распределения рассчитывали с помощью функции binconf из пакета Hmisc. Для детекции различий по вышеуказанным показателям как между тестами, так и между разными АН использовали тест МакНемара.

Для анализа количественных данных строили смешанные или обычные линейные модели, в которых оценивали отношение зависимой переменной (y, наблюдаемая АН у участника) к независимой (x, АН по данным цПЦР) с использованием попарных тестов – исследуемый тест против цПЦР. В качестве случайного эффекта использовали лабораторию-участника (A или B). Приоритезацию моделей проводили путем выбора той, дисперсия которой была лучше описана. Для сравнения дисперсий моделей использовали дисперсионный анализ ANOVA с использованием одноименной функции в R. Качество простых линейных моделей оценивали с помощью теста Global Validation of Linear Models Assumptions из одноименного пакета gvlma [15]. Диагностику смешанных моделей проводили с помощью отдельных тестов на линейность, нормальность распределения остатков, гомоскедастичность (постоянство дисперсии), отсутствие выбросов, нормальность случайных эффектов и мультиколлинеарность с помощью пакетов Performance и See [16,17]. В случае несоответствия распределений указанных параметров ожидаемым использовали робастные линейные модели и сэндвич оценки из пакетов MASS и sandwich [18, 19]. Для оценки фиксированных эффектов сравнивали достоверность различий коэффициентов β₁ (угол наклона кривой) и β₀ (У-пересечение) от 1 и 0, соответственно. Подробная схема анализа представлена на рис. 1. В случае перекрытия доверительным интервалом (ДИ) единицы для коэффициента β₁ делали вывод об отсутствии пропорциональной систематической ошибки теста. Если ДИ коэффициента β₀ не включал ноль, фиксировали наличие постоянной систематической ошибки. Иерархия выбора моделей выглядела следующим образом:

Рис. 1. Схема иерархии и диагностики линейных моделей для оценки тестов.

β0 и β1 коэффициенты регрессии, anova (analysis of variance) — сравнение описанной дисперсии у двух моделей, gvlma (Global Validation of Linear Models Assumptions) — оценка допущений модели, bootstrap — моделирование из случайной выборки с заданным средним и стандартным отклонением.

1) Обычная модель (y=β₀+β₁x+ где є — случайная ошибка);

2) Модель со случайным эффектом β0 (y=(β₀+u₀)+β₁x+є, где u₀ – случайный β₀ для лаборатории);

3) Модель со случайными β₁ и β₀ (y=(β₀+u₀)+(β₁+u₁)x+є, где u₁ — случайный β₁ для лаборатории).

Данные визуализировали с использованием столбчатых диаграмм и графиков линейной регрессии для номинативных и количественных данных соответственно. Смещение тестов визуализировали с помощью графиков Бланд-Альтмана, в которых попарно оценивали каждый тест против цПЦР. Доверительные интервалы (95% ДИ) для смещения, верхнего (ВПС) и нижнего пределов согласия (НПС) тестов считали по методу, описанному Giavarina и соавт. [20]. Коэффициенты вариации (КВ) визуализировали с помощью точечных диаграмм. Для множественных сравнений использовали поправку Холма. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты

Качественный анализ выявления мутации JAK2 V617F

Чувствительность тестов при анализе мутации JAK2 V617F изображена на рис. 2. Формальные различия между тестами отсутствовали, однако была связь между АН и чувствительностью. Так, с уменьшением АН был заметен значимый тренд (p=0,023) на снижение чувствительности: при АН 40 и 8% чувствительность составляла 100% (95% ДИ: 91,2%; 100,0%), однако в подгруппе с АН 2% она снизилась до 82,5% (95% ДИ: 67,2%; 92,7%) (7 — не выявлено/33 — выявлено). Наибольший вклад в снижение чувствительности при АН 2% продемонстрировала тест-система производства ООО «Генотехнология» (4 (3 в одной и 1 проба в другой лаборатории)) — не выявлено/6 — выявлено, p=0,26), другие тесты показали одинаковый результат (1 — не выявлено/9 — выявлено, p=1,0). Общая чувствительность теста ООО «Генотехнология» составила 86,7 (95% ДИ: 69,3%; 96,2%), в то время как для других тестов этот показатель был 96,7% (95% ДИ: 82,8%; 99,9%). При этом все тесты не выявили различий как при попарном анализе, так и на разных АН. Все тесты показали 100% специфичность: не выявлено ни одного ложно-позитивного результата. Таким образом, точность всех тестов JAK2 V617F соответствовала чувствительности.

Рис. 2. Чувствительность тестов при выявлении разных АН мутации V617F в гене JAK2 в двух лабораториях.

Ось Y — доля случаев; ось X — исследованные тест-системы.

Количественный анализ определения АН JAK2 V617F

На рис. 3а и 3б изображены линейные графики, отражающие отношение каждого теста методу цПЦР, обозначенному пунктирной линией. Графики представлены как в общем формате (пулированные данные), так и с разделением по лабораториям. Очевидно, что разные лаборатории при применении одинаковых тестов демонстрировали разные тенденции, особенно это было наглядно с использованием тест–системы производства ООО «Иноген» (рис. 3б). В связи с этим, в дальнейшем акцент был сделан на попарных сравнениях каждого теста с цПЦР, чтобы выявить наиболее сопоставимый. Мы использовали подход с применением иерархии линейных моделей и диагностики их качества, который детально описан в разделе «Материалы и методы». Конечной целью такого подхода было надежно оценить, насколько достоверно коэффициенты β₁ и β₀ отличны от 1 и 0, соответственно, и, таким образом, сделать вывод о наличии и степени пропорциональной и постоянной систематической ошибках. Необходимо отметить, что ни один из тестов не продемонстрировал постоянной систематической ошибки, т.е. коэффициенты β₀ всех тестов значимо не отличались от 0. При этом, большинство тестов показали наличие различной степени пропорциональной ошибки – отличие коэффициента β₁ от 1. ДИ для коэффициентов и характеристики моделей указаны в табл. 2.

Рис. 3. Количественные характеристики тестов мутации V617F в гене JAK2.

а — общий линейный график; б — линейные графики отдельно по лабораториям-участникам A и B; ось Y — данные исследуемых тест-систем; черная пунктирная линия и ось X — данные цПЦР; в — коэффициент вариации тестов для детекции мутации V617F в гене JAK2; ось Y — коэффициент вариации; ось X — величина аллельной нагрузки для конкретного типа мутации; красные пунктирные линии — пороговые уровни КВ 10 и 30%.

Таблица 2. Таблица сравнения тестов JAK2 V617F

Примечание. Здесь и в табл. 3, 4: КВ – коэффициент вариации; ВПС-верхний предел согласия; НПС-нижний предел согласия.

На рис. 3в представлены данные анализа коэффициента вариации (КВ) тестов с разделением как по величине АН, так и по лабораториям-участникам. На графике пунктирными линиями указаны условные уровни качества — способности тестов устойчиво измерять уровень аналита с КВ: <10% — отлично, 10—30% —хорошо, >30% —не рекомендуется количественный учет. Из рис. 3в видно, что большинство тестов расположились в зонах <10% и 10—30%. Исключение составила тест-система ООО «Иноген», однако их вариация могла быть связана с лабораторией. Также тест от ООО «Генотехнология» демонстрировал наибольшую вариацию в зоне низкой АН (2%) у обеих лабораторий-участников. Для усреднения значений КВ мы пулировали значения как по лаборатории, так и по АН. Средние значения КВ и их ДИ представлены в табл. 2.

На рис. 4 представлены данные попарного сравнения смещения тестов против референса (цПЦР) методом Бланда-Альтмана. Так, наименьшее смещение и наибольший уровень согласия (наименьшая разница между пределами) продемонстрировали тесты производителей ООО «Генотехнология» и ООО «Формула гена». При этом тест ООО «Генотехнология» показал смещение в зону занижения значений, а ООО «Формула гена» («Миелоскрин»), наоборот завышения. С другой стороны, тесты производителей ООО «Синтол» и ООО «Иноген» показали смещение в зону высоких значений и были значительно менее согласованы (большая разница между пределами) с цПЦР. При этом тест ООО «Иноген» показал рассогласованные результаты между лабораториями. Характеристики анализа (Смещение, Верхний/нижний пределы согласия) представлены в табл. 2.

Рис. 4. Оценка смещения тестов, детектирующих V617F в гене JAK2 относительно цПЦР, методом Бланда-Альтмана.

Черная линия — среднее смещение; красные пунктирные линии — верхний и нижний пределы согласия тестов; закрашенные области — 95% доверительные интервалы; ось X — аллельная нагрузка целевого значения (цПЦР); ось Y — разность аллельных нагрузок тест-систем и целевого значения (цПЦР).

Интегральная оценка тестов для количественного определения АН JAK2 V617F

Так как конечной целью настоящего исследования было провести прямое сравнение тест-систем по показателям точности и по количественным характеристикам, то на заключительном этапе анализа была проведена интеграция всех показателей (см. табл. 2). Мы использовали следующие показатели: точность, коэффициент β₁, характеристику модели, КВ и показатели смещения по методу Бланда-Альтмана.

Качественный анализ выявления мутаций MPL W515L/K

Показатели чувствительности, специфичности и точности составили 100% (95%ДИ: 88,4—100,0%) для всех тестов, детектирующих обе мутации W515L/K в гене MPL.

Количественный анализ определения АН MPL W515L

На рис. 5а и 5б представлены линейные графики тестов относительно цПЦР. В анализе приняли участие только тесты от производителей ООО «Иноген» и ООО «Генотехнология», так как только эти два, согласно инструкции, предоставляли возможность количественной оценки АН мутации MPL W515L. Тест «Миелоскрин» (ООО «Формула гена») предназначен только для качественного учета этой мутации.

Рис. 5. Взаимосвязи между результатами отдельных тестов, выявляющих мутации W515L в гене MPL и цПЦР.

а – общий линейный график; б – линейные графики отдельно по лабораториям-участникам А и В; ось Y — данные исследуемых тест-систем; черная пунктирная линия и ось X — данные цПЦР; в – коэффициент вариации тестов для детекции мутации W515L в гене MPL; ось Y — коэффициент вариации; ось X — величина аллельной нагрузки для конкретного типа мутации; красные пунктирные линии — пороговые уровни КВ 10 и 30%.

При попарных сравнениях каждой тест-системы с цПЦР были выявлены различия как в коэффициентах β₁, так и β₀ для обеих тест-систем. При этом значимые отличия коэффициента β₀ были зафиксированы только у теста ООО «Генотехнология». Средние значения и ДИ коэффициентов представлены в табл. 3.

Таблица 3. Таблица сравнения тестов W515L в гене MPL

Из рис. 5в видно, что КВ для обеих сравниваемых тест-систем, независимо от лабораторий-участников, расположились в зонах <10% и 10—30%. Также наблюдалось некоторое увеличение КВ с увеличением АН в зоне относительно высоких значений АН (45%), но в большей степени для лаборатории-участника B. Усредненные значения КВ составили 9,4 и 14,1% для тест-систем производства ООО «Иноген» и ООО «Генотехнология».

На рис. 6 отображены графики Бланда-Альтмана для тестов, детектирующих MPL W515L. Из графиков видно, что тест ООО «Генотехнология» демонстрировал практически одинаковое смещение с тестом ООО «Иноген», завышая значения. Однако был более согласован как с цПЦР, так и между лабораториями в сравнении с конкурентом. Количественные характеристики вывода по методу Бланда-Альтмана для обоих тестов представлены в табл. 3.

Рис. 6. Оценка смещения тестов, детектирующих W515L в гене MPL относительно цПЦР, методом Блэнд-Альтмана.

Черная линия — среднее смещение; красные пунктирные линии — верхний и нижний пределы согласия тестов; закрашенные области — 95% доверительные интервалы; ось X — аллельная нагрузка целевого значения (цПЦР); ось Y — разность аллельных нагрузок тест-систем и целевого значения (цПЦР).

Интегральная оценка тестов для количественного определения АН MPL W515L

Так как точность всех тестов составила 100% (95% ДИ: 88,4—100,0%), то этот показатель не учитывался при прямом сравнении тест-систем для выявления MPL W515L. При этом была применена дополнительная метрика, а именно отклонение коэффициента β₀ от 0, как показатель постоянной систематической ошибки. В табл. 3 отражены сравниваемые характеристики для обоих тестов.

Количественный анализ определения АН MPL W515K

На рис. 7а и 7б представлены линейные графики тестов. Как и в случае тестов MPL W515L, в количественном анализе приняли участие только тест-системы от производителей ООО «Иноген» и ООО «Генотехнология». Тест-система производителя ООО «Формула гена» предназначена только для качественного учета мутации.

Рис. 7. Линейные графики различных тестов, выявляющих мутации W515K в гене MPL относительно цПЦР.

а — общий линейный график; б — линейные графики отдельно по лабораториям-участникам А и В; ось Y — данные исследуемых тест-систем; черная пунктирная линия и ось X — данные цПЦР; в — коэффициент вариации тестов для детекции мутации W515K в гене MPL; ось Y — коэффициент вариации; ось X — величина аллельной нагрузки для конкретного типа мутации; красные пунктирные линии — пороговые уровни КВ 10 и 30%.

При анализе вывода линейных моделей при попарных сравнениях каждой тест-системы с цПЦР были выявлены различия как в коэффициентах β₁, так и β₀, однако в этот раз они распределились по обоим тестам. Так для тест-системы ООО «Генотехнология» ДИ β₀ не пересек 0 и составил 38,76 (95% ДИ 26,8; 50,7). При этом ДИ коэффициента β₁ для тест-системы ООО «Иноген» не пересек 1 и составил 1,45 (95% ДИ 1,24; 1,66).

На рис. 7в изображены точечные диаграммы КВ для тест-систем для количественного определения MPL W515K при разных величинах АН. Из рис. 7в видно, что практически все КВ расположились в зонах <10% и 10—30%. Исключение составил результат набора ООО «Генотехнология» при АН 10%. КВ составил 41,6%, однако такой результат демонстрировала только одна лаборатория-участник. КВ другой лаборатории при сходной АН составил 10,1%. Усредненные значения КВ составили 8,9% (95% ДИ 4,3%; 13,5%) и 13,5% (95% ДИ 0%; 28,1%) для тест-систем ООО «Иноген» и ООО «Генотехнология» соответственно.

На рис. 8 изображены график Бланда-Альтмана для тест-систем, детектирующих W515K в гене MPL. Смещение и пределы согласия наборов от производителей ООО «Генотехнология» и ООО «Иноген» демонстрировали сходный с W515L характер: большая согласованность теста ООО «Генотехнология» как с цПЦР, так и внутри лабораторий. Однако среднее смещение у теста ООО «Генотехнология» было выше, чем у конкурента, тем не менее сама его величина была в два раза больше, чем при детекции W515L. Детальные характеристики представлены в табл. 4.

Рис. 8. Оценка смещения тестов, детектирующих W515K в гене MPL относительно цПЦР, методом Бланда-Альтмана.

Черная линия — среднее смещение; красные пунктирные линии — верхний и нижний пределы согласия тестов; закрашенные области — 95% доверительные интервалы; ось X — аллельная нагрузка целевого значения (цПЦР); ось Y — разность аллельных нагрузок тест-систем и целевого значения (цПЦР).

Таблица 4. Таблица сравнения тестов W515K в гене MPL

Интегральная оценка тестов для количественного определения АН MPL W515K

В табл. 4 отражены показатели для обоих тестов. Из табл. 4 видно, что основной вклад в смещение теста Mutaprime (ООО «Иноген») от цПЦР вносил коэффициент β₁, в то время как тест от «Генотехнология», наоборот, отличался от цПЦР за счет коэффициента β₀. Таким образом, коэффициенты β₁ и β₀ продемонстрировали зеркальный характер для обоих тестов. Интересно, что разница в коэффициентах вариации между обоими тестами, детектирующими как W515L, так и W515K была практически идентичной и составила 4,60 и 4,63% соответственно.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы предприняли попытку прямого сравнительного исследования коммерчески доступных и широко представленных на рынке РФ тест-систем для детекции мутаций V617F и W515L/K в генах JAK2 и MPL. В данный анализ мы сознательно не включали мутации в гене CALR, так как для их выявления необходимо использовать ПЦР с детекцией методом фрагментного анализа или секвенирование по Сэнгеру [1, 21], а имеющиеся на российском рынке тест-системы пропускают все неканонические варианты [21, 22] за исключением делеции 52 нуклеотидов (тип 1) и вставки 5 нуклеотидов (тип 2), встречающихся в 60 и 32% случаев соответственно [23]. Более того, в ходе предыдущего раунда межлабораторных сличительных испытаний было показано, что участники для выявления данного маркера не использовали коммерческие тест-системы, предпочитая им тесты, разработанные в лабораториях (LDT-laboratory-developed test). Таким образом, мы сосредоточились на точковых мутациях, надежно выявляемых методом ПЦР-РВ.

Другая особенность настоящего исследования — это значительная гетерогенность АН разных мутаций, предоставленных участникам контрольных материалов. Так, разброс АН мутации V617F составил 2—40%, а АН мутаций W515L/K 10—45%. С одной стороны, мы преследовали цель — выявить, насколько надежно тесты детектируют низкие значения АН. Однако в ходе предыдущих раундов межлабораторных сличительных испытаний мы установили значительные трудности с выявлением АН ниже 10% для тест-систем, детектирующих мутации в гене MPL. Для наборов, детектирующих JAK2 V617F, такая проблема была выражена значительно меньше. Результаты текущего раунда показали, что все тесты надежно выявляли АН ≥10%, однако тесты, детектирующие мутации JAK2, демонстрировали некоторые сложности при выявлении 2% АН для JAK2 V617F. В большей степени эта проблема была выражена для тест-системы производителя ООО «Генотехнология». Так тест-системы данного производителя показали четыре ложнонегативных результата (4/10), в то время как другие тест-системы демонстрировали один ложнонегатиный результат (1/10) каждая.

В исследовании участвовали две независимые лаборатории. Мы хотели, чтобы это позволило приблизить анализ к реальной лабораторной практике. Поэтому при оценке результатов мы столкнулись с очевидными трудностями: разные лаборатории предоставили очень разные значения и характер систематических ошибок. Учитывая тот факт, что обе лаборатории использовали идентичный подход к обработке данных: использование одинаковых формул расчета, рекомендованных производителем, контрольных генов или калибровочных кривых, предполагаем, что есть несколько причин наблюдаемых различий. Среди них могут быть как ошибки пипетирования, так и влияние разных приборов и программного обеспечения для анализа. Для учета роли этих факторов мы разработали гармонизированный подход с иерархией выбора линейных моделей. Тем не менее значительная разница между лабораториями не только является ограничением настоящего исследования, но и ставит вопрос валидности таких данных. Особенно такая разница была заметна для тестов производителя ООО «Иноген» (см. рис. 3б, 5б, 7б). Так, при анализе V617F в гене JAK2 коэффициент β₁ формально не отличался от 1 (табл. 2). При этом лаборатория A показывала завышенные, а лаборатория B, наоборот, заниженные данные (см. рис. 3б). Это согласуется с результатами попарного анализа тестов по методу Бланда–Альтмана. Все тесты производителя ООО «Иноген» показали гетерогенную картину смещения: одна лаборатория завышала, а другая занижала результаты относительно среднего смещения. Так, для тестов, детектирующих V617F, лаборатория A располагалась ниже усредненного смещения, а лаборатория B, наоборот, выше (см. рис. 4). При этом для тестов, детектирующих W515L/K, картина была зеркальной (см. рис. 6 и рис. 8). Также заслуживает внимания то, что при анализе образцов с мутацией MPL W515L в лаборатории B три различные АН этой мутации (10, 20 и 45%) были выданы практически идентичными друг другу в диапазоне 40–45% (см. рис. 5б). Являются ли причиной этого особенности тест-системы или технические нюансы пипетирования заслуживает отдельного изучения. Очевидно, что ценность такого заключения, будь оно выдано в реальности, была бы сомнительной, особенно в контексте мониторинга минимальной остаточной болезни в случае трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Однако в нашей стране такое лечение для больных ХМПЗ является скорее исключением и поэтому основное внимание следует фокусировать на чувствительности. Для всех тест-систем, детектирующих полиморфизмы в гене MPL, была абсолютная чувствительность, разумеется, если не учитывать тот факт, что контрольные образцы были изготовлены от 10%.

В качестве опций для вероятного решения возникших трудностей в будущем при планировании следующего межлабораторного сличительного испытания могут быть рассмотрены включение большего числа участников-лабораторий, использование одинаковых амплификаторов для ПЦР-РВ в разных лабораториях-участниках, сравнительный анализ разных амплификаторов в рамках одной или нескольких лабораторий.

Несмотря на то что мы разделили количественный анализ тестов на конкретные метрики: β₁, β₀, КВ, смещение и пределы согласия, мы сознательно ушли от какой-либо рейтинговой системы оценки тестов. Вместо этого мы предоставляем читателю подробные оригинальные данные. Например, при анализе JAK2 V617F очевидно, что большинство тестов завышали результаты, демонстрируя различную степень пропорциональной систематической ошибки, однако, тест-система ООО «Синтол», напротив, пропорционально занижала результат. При попарном анализе тест-систем ООО «Синтол» против ООО «Формула гена» видно, что коэффициенты β₁ для них составили 0,85 и 1,19 соответственно. Так, формально оба теста имели практически одинаковую ошибку, однако ее направление было зеркальным. В сравнение с коэффициентом β₁ коэффициент β₀ и КВ, выглядят более однозначными метриками, тем более что при анализе мутаций в гене MPL они были значительно завышены только у тест-системы производства ООО «Генотехнология». С другой стороны, все тесты ООО «Генотехнология», согласно методу Бланда–Альтмана, показали наибольшую согласованность с цПЦР, продемонстрировав примерно одинаковое смещение. Тогда как пределы согласованности тестов ООО «Иноген» были значительно выше.

Заключение

Подводя итог, хочется отметить, что, когда мы разрабатывали дизайн настоящего исследования, мы старались учесть множество переменных, чтобы в конечном итоге получить ответ на вопрос: какой тест лучше всего подходит для анализа частых мутаций в генах JAK2 и MPL. Однако на практике мы столкнулись с трудностями в интерпретации данных, которые, по-видимому, также отражают реальную действительность. Тем не менее мы предприняли попытку гармонизировать вывод, используя одинаковый алгоритм анализа для всех тест-систем. Таким образом, предоставив читателю всю полноту данных, которые указаны как на рисунках, так и в таблицах, мы бы не хотели дискриминировать какого-либо производителя, вместо этого мы поддерживаем самостоятельное решение о выборе теста.

Участие авторов

Пономарев Александр Игоревич — идея исследования, написание черновика статьи, статистическая обработка результатов.

Цаур Григорий Анатольевич — идея исследования, статистическая обработка результатов, правка текста статьи, литература по теме исследования.

Шмунк Ирина Васильевна — анализ результатов, правка текста статьи.

Цыганко Елена Владимировна — технологическое ассистирование, сбор и курация данных, правка текста статьи.

Мухачева Татьяна Александровна — технологическое ассистирование, сбор и курация данных, правка текста статьи.

Савельев Леонид Иосифович — идея исследования, статистическая обработка результатов, правка текста статьи.

Фечина Лариса Геннадьевна — руководство исследованием, поиск и предоставление ресурсов, правка текста статьи.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.