Современные методы определения антагонистической активности микроорганизмов (систематический обзор)

В последние годы наблюдается большой интерес к пробиотическим микроорганизмам, которые при приеме внутрь оказывают благотворное воздействие на здоровье человека. Этот интерес подкрепляется многочисленными исследованиями, демонстрирующими их эффективность в профилактике и лечении различных заболеваний — от дисбиоза кишечника до инфекций мочевыводящих путей. Однако не все бактерии, претендующие на звание пробиотиков, одинаково полезны. Поэтому изучение их антагонистической активности становится особенно актуальным, так как понимание механизмов их действия может способствовать разработке альтернативных методов лечения инфекционных заболеваний [1]. Антагонистическая активность представляет собой важный аспект микробиологии, которая изучает взаимодействия между различными микроорганизмами, в частности способность одних штаммов подавлять или ингибировать рост других. Изучение антагонистических свойств имеет огромное значение в различных областях, включая разработку новых пробиотических препаратов. Для оценки антагонистической активности используются разнообразные методы, каждый из которых обладает своими преимуществами и недостатками.

В настоящее время определение антагонистической активности микроорганизмов проводится in vitro и in vivo. Методы in vitro позволяют быстро и просто исследовать антагонистические свойства большого количества штаммов пробиотических бактерий к условно-патогенным микроорганизмам (УПМ). Они позволяют исключить из дальнейших исследований не представляющие интереса неактивные или малоактивные штаммы микроорганизмов [2, 3]. Антагонистическая активность микроорганизмов — кандидатов в пробиотики может проявляться по-разному. Один из основных механизмов — продукция бактериоцинов (БЦ, вещества белковой природы, содержащие в своей структуре полипептиды, белки, полисахариды, обладающие активностью в отношении одного или нескольких штаммов патогенных микроорганизмов и УПМ). Различные виды бактерий, такие как Lactobacillus и Bifidobacterium, синтезируют широкий спектр БЦ, специфичных к различным патогенам. Методы исследования антагонистической активности микроорганизмов имеют существенное значение в микробиологии и биотехнологии [4].

Существует множество методов для выявления продукции БЦ микроорганизмами. В основу большинства методов положен тот факт, что БЦ обладают выраженной способностью диффундировать в агаровые среды [5]. Действие вещества, оказывающего антимикробный эффект в отношении патогенных микроорганизмов и УПМ, проявляется в виде характерных зон задержки роста микроорганизма [6, 7].

При этом существует необходимость в стандартизации методик, что обеспечит сравнимость получаемых данных и ускорит процесс поиска кандидатов для пробиотических препаратов. Важно учитывать не только метаболическую активность, но и безопасность, а также потенциальную пользу для здоровья человека. На данный момент в РФ существует лишь несколько нормативных документов, регламентирующих исследование, производство и использование: МУ 2.3.2.2789-1 «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов», ТР ТС021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (с изменениями на 14 июля 2021 г.)» [8]. Таким образом, комплексный анализ методологий может способствовать более эффективному выделению микробных штаммов с высоким потенциалом для применения в пробиотических технологиях.

В данном обзоре мы рассмотрим наиболее распространенные методики определения антагонистических свойств микроорганизмов.

Метод двухслойного агара (double layer agar method) на протяжении многих лет остается классическим способом оценки антагонистической активности микроорганизмов. Этот метод позволяет визуально оценить ингибирование роста УПМ и представляет собой простой и доступный инструмент для лабораторных исследований. Метод используется не только для оценки антагонистической активности, но и для выделения и изучения бактериофагов, а также для тестирования штаммов пробиотических препаратов. Суть метода заключается в том, что нижний слой среды готовят с помощью колумбийского агара: 1 мл тестируемого штамма пробиотического препарата добавляют в растворенную охлажденную среду до конечной концентрации 10⁹ клеток по стандарту мутности на 1 мл среды, выливают в чашку Петри по 10 мл и инкубируют 1 ч при температуре 37 °C. Затем на поверхность нижнего слоя наливают 10 мл колумбийского агара. Приготовленный таким образом двухслойный агар оставляют при 37 °C в течение 1 ч. Затем на поверхность верхнего слоя высевают по Голду патогенные микроорганизмы или УПМ в конечной концентрации 10⁹ клеток в соответствии со стандартом мутности по Мак-Фарланду (McF) и инкубируют 24—48 ч при температуре 37 °C. После инкубации подсчитывают количество колоний, выросших в разных секторах питательной среды; количество бактерий в 1 мл суспензии определяют по расчетной таблице для определения количества бактерий в 1 мл жидкости [9]. Несмотря на свою простоту и доступность, классический метод двухслойного агара имеет определенные ограничения, которые могут быть преодолены с помощью более современных подходов к оценке антагонистической активности микроорганизмов.

Метод точечного анализа, также известный как метод точечного посева, представляет собой современное решение для оценки антагонистической активности микроорганизмов и является одним из наиболее распространенных методов в микробиологии. В рамках данного метода было предложено три модификации, каждая из которых имеет свои особенности и преимущества.

Принцип первой модификации заключается в следующем: на застывший агар шпателем засевается индикаторная культура в виде «газона». Затем на уже засеянную среду наносятся аликвоты исследуемых штаммов тест-культур (например, лактобацилл или бесклеточных супернатантов с бактериоцинами в различных разведениях). Этот подход позволяет визуально оценить антагонистическую активность тестируемых штаммов.

Вторая модификация метода включает точечный антимикробный анализ на агаре и состоит из следующих этапов: приготовление диффузионного агара (типа Мюллера—Хинтона) для тест-культур; нанесение аликвот в разных разведениях исследуемой тест-культуры на подготовленную среду; инкубация агара для образования пятен; смешивание суспензии индикаторного микроорганизма с мягким питательным агаром (0,7%) и заливка в чашки Петри с пятнами; инкубация чашек Петри в аэробных или анаэробных условиях с последующим определением зон задержки роста. Наличие прозрачной зоны >1 мм вокруг пятна с тест-культурой считается положительным тестом.

Третья модификация представляет собой точечный антимикробный анализ на газоне с лунками. В чашке Петри с диффузионным или питательным агаром просверливают лунки диаметром 6—7 мм. Дно каждой лунки заполняют агаром. В лунки пипеткой вносят разные разведения исследуемой тест-культуры. Чашки оставляют при комнатной температуре, затем чашки инкубируют в течение 3 ч при температуре 37 °C, после чего покрывают 0,7% питательным агаром, смешанным с индикаторной культурой, и инкубируют при температуре 37 °C в течение 24—48 ч [10]. В отличие от классического метода двухслойного агара данный метод позволяет более точно и быстро оценивать влияние различных тест-культур с пробиотической активностью на рост патогенных микроорганизмов и УПМ. При этом тест-культуры наносятся точечно на поверхность предварительно засеянного агара, что значительно упрощает процесс подсчета и анализа. Точечный анализ также позволяет легко варьировать условия эксперимента, например путем изменения плотности посева или состава среды. Это дает возможность оценить антагонистическую активность в широком диапазоне условий, что особенно актуально для исследования различных пробиотических штаммов. Кроме того, данный метод отличается высокой воспроизводимостью результатов и может быть автоматизирован, что делает его незаменимым инструментом в современных лабораторных условиях. Таким образом, внедрение метода точечного анализа в практику лабораторных исследований способствует более детальному пониманию механизмов действия пробиотиков и их потенциального применения в борьбе с инфекциями.

Метод отсроченного антагонизма на плотных питательных средах представляет собой еще один альтернативный подход для оценки антагонистической активности микроорганизмов, основанный на способности одного микроорганизма подавлять рост другого. Сначала в чашку Петри на поверхность плотной питательной среды петлей засевают «уколом» или spot-тестом (капля жидкой культуры) исследуемые штаммы. После инкубирования в течение 24—48 ч в оптимальных условиях культивирования тест-культуры выросшие бактерии заливают тонким слоем 0,7% агара (около 4 мл), в который предварительно вносят 0,1 мл суточной индикаторной культуры. Результаты учитывают через 24 ч инкубирования при условиях оптимальных для роста индикаторных бактерий по зоне задержки роста. Если после «укола» петлей макроколонии различаются по размеру, то при учете результатов используют коэффициент ингибиции роста индикатора, который вычисляют по формуле: k=Дз/Дк, где Дз — диаметр зоны роста индикаторного штамма (мм), Дк — диаметр колонии штамма-продуцента (мм). Учет результатов проводят следующим образом: k=1–2,0 — низкая степень антибактериальной активности; k=2,1–4 — средняя степень; k=4,1–6,0 — высокая степень; при коэффициенте >5 штамм считали суперпродуцентом [11].

Метод перпендикулярных «штрихов» используется для более детального анализа взаимодействия между штаммом-антагонистом и условно-патогенным микроорганизмом. В процессе проведения эксперимента на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри полоской наносится исследуемая тест-культура, обладающая пробиотической активностью, затем перпендикулярно к ней от края чашки подсевают штрихами выбранные УПМ (индикаторные культуры), которые распределяются в виде параллельных штрихов на одной среде. Этот метод позволяет одновременно проверить чувствительность большого количества УПМ к антибактериальной субстанции любого штамма-антагониста [12].

Метод дискового диффузионного теста часто применяется для оценки антибиотикорезистентности, но его можно адаптировать для изучения штаммов — кандидатов в пробиотики.

Существуют 2 модификации этого метода:

1) метод диффузии в лунку агара. Для этого в чашке Петри с диффузионным или питательным агаром, на которую газоном засевают потенциально пробиотическую культуру, стерильным пробочным сверлом вырезают лунки диаметром 6—7 мм и в них пипеткой вносят аликвоты различных разведений (как правило, с двукратным шагом) культуральной жидкости (КЖ) или супернатантов тест-культуры. Перед внесением в лунки КЖ чашки хорошо подсушивают, затем инкубируют в течение 24—48 ч и измеряют зону ингибирования роста индикаторного штамма;

2) анализ на бумажных дисках. В этом случае диски, пропитанные КЖ, помещаются на агар, что позволяет визуализировать зоны ингибирования и легче сравнивать эффекты различных штаммов. Использование этих методов открывает новые горизонты в исследовании антагонистической активности и позволяет более глубоко понять механизмы действия пробиотиков. После инкубации зону ингибирования оценивают по образованию прозрачной зоны вокруг бумажного диска [10].

Метод микротитровальных планшетов представляет собой еще одно эффективное решение для оценки антагонистической активности потенциально пробиотических культур. В протоколе применения метода исследуемые суточные агаровые культуры штаммов-продуцентов засевают петлей в жидкий питательный бульон и инкубируют в течение 48 ч при температуре 37 °C. Затем КЖ разводят в среде или буфере. Для этого в стерильные пробирки разливают по 2 мл питательного бульона. В первую пробирку при помощи стерильной пипетки вносят 2 мл КЖ, получая разведение 1:2. Тщательно перемешивают на шейкере и стерильной пипеткой переносят 2 мл раствора в бульон из первой пробирки во вторую, содержавшую первоначально 2 мл бульона, для получения разведения 1:4. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не будет приготовлен весь необходимый ряд разведений. Далее в каждую лунку планшета переносят по 100 мкл КЖ. Индикаторный штамм оптической плотностью 0,5 McF вносят в лунки планшета. Образец КЖ и индикаторный штамм смешивают в каждой лунке и инкубируют при 37 °C. Ингибирование роста индикаторного штамма определяется путем измерения оптической плотности в различных временных точках с помощью фотометра при длине волны 620 нм [13]. Применение метода микротитровальных планшетов значительно ускоряет процесс скрининга пробиотических штаммов. Ключевым преимуществом метода является возможность автоматизации исследований с применением автоматических иммунологических ридеров. Существуют системы, которые могут одновременно обрабатывать большое количество образцов, что минимизирует вероятность ошибок и увеличивает воспроизводимость результатов. Это особенно актуально для лабораторий, занимающихся массовыми тестированиями [14].

Метод микротитровальных планшетов, наряду с другими методами, такими как точечный анализ и отсроченный антагонизм, способствует лучшему пониманию природы пробиотиков и их влияния на патогенные микроорганизмы, открывая новые горизонты в области микробиологии и медицины.

Метод кокультивирования является достаточно многообещающим подходом к исследованию антагонистических свойств микроорганизмов. При исследовании данным методом в пробирках с жидкой питательной средой делают двукратные разведения бесклеточной, стерилизованной хлороформом КЖ, в которой предполагается наличие бактериоцина (БЦ). После чего в пробирки добавляют определенное количество индикаторного штамма (конечная концентрация около 1×10⁴ кл/мл). О наличии и степени антагонистической активности КЖ судят по угнетению роста индикаторного штамма по сравнению с контролем (суспензия выращенного тест-штамма без БЦ-содержащей КЖ). Активность можно установить по снижению оптической плотности в пробирках, содержащих БЦ. Последняя пробирка с подавлением роста индикатора считается титром БЦ и оценивается по разведению или в условных единицах, реципрокных (обратных числу) разведения. В отличие от других методов данный подход предполагает одновременное выращивание и взаимодействие пробиотических и условно-патогенных культур на одной питательной среде. Это дает возможность исследовать их взаимодействие в динамике, выявлять взаимные влияния и механизмы антагонизма в естественных условиях. Одним из преимуществ кокультивирования является возможность более точного моделирования микробиома, что позволяет лучше понять, как пробиотики могут подавлять рост УПМ [15].

Также метод позволяет выявлять синергетические эффекты между различными пробиотическими штаммами, что открывает перспективы для разработки комбинированных пробиотических препаратов. В дополнение кокультивирование может быть использовано для изучения влияния внешних факторов, таких как температура, pH и состав окружающей среды, на антагонистическую активность. Это может привести к значительным находкам в области оптимизации условий для использования пробиотиков в медицинской практике и пищевой промышленности [10].

В методе двухэтапного культивирования создается комбинированная система культивирования (КСК), которую конструируют следующим образом: в чашку Петри диаметром 90 мм заливают питательную среду (например, MRS-агар), застывший агар рассекают стерильным скальпелем строго по диаметру чашки, после чего одну из двух половинок агаровой пластинки удаляют. Освободившееся пространство заливают расплавленным агаром необходимого типа до уровня, заданного толщиной пластинки агара. Тип агара, использовавшегося для такой заливки, определяется питательными потребностями «жертвы»: для анаэробных микроорганизмов — колумбийский агар с 5% дефибринированной бараньей кровью и добавками для роста клостридий; для полирезистентных УПМ из группы ESCAPE-патогенов применяют триптиказо-соевый агар (TSA). На первом этапе культивирования 100 мкл суспензию потенциально пробиотических культур с оптической плотностью 1,0 McF равномерно рассевают строго по поверхности MRS-агара, соответствующей ¹/₂ площади КСК, после чего посевы инкубируют при 37 °C в течение 48 ч в атмосферной среде, обогащенной углекислым газом. Через 48 ч инкубации к выросшему потенциальному штамму-антагонисту по поверхности второй, остававшейся незасеянной, половине КСК равномерно засевают 100 мкл суспензии «жертвы» с оптической плотностью 1,0 McF, после чего посевы инкубируют 48 ч в анаэробных условиях [16]. Наличие зоны задержки роста культуры той или иной «жертвы» расценивают в качестве свидетельства наличия направленной относительно нее антагонистической активности того или иного «хищника». Результат оценивают по зонам задержки роста: от 25 до ≥40 мм — высокая антагонистическая активность; 25—15 мм — средняя; 5—15 мм — низкая; ≤5 мм — антагонизм отсутствует. Метод позволяет обеспечить адекватные условия роста микроорганизмов с различными типами дыхания и потребностями в питательной среде.

Для более глубокого понимания антимикробных свойств штаммов — кандидатов в пробиотики применяются молекулярно-генетические методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование ДНК. Они позволяют идентифицировать гены, отвечающие за синтез антимикробных веществ (БЦ), и оценить их экспрессию. Это дает возможность понять механизмы антимикробного действия на уровне ДНК и РНК. Секвенирование геномов пробиотических штаммов выявляет потенциал синтеза различных антимикробных соединений, расширяя понимание их функциональности.

БЦ, вырабатываемые лактобациллами, представляют собой сложные молекулы, обладающие антимикробной активностью. Гены, отвечающие за выработку БЦ у лактобацилл, разнообразны и специфичны для каждого типа БЦ.

В данном систематическом обзоре рассмотрим ключевые гены, ответственные за выработку различных БЦ у лактобацилл.

Низин: ген nisA (лидерный пептид). Гены nisB, nisC, nisP участвуют в посттрансляционной модификации и процессинге предшественника низина. Гены nisT, nisE, nisF, nisG участвуют в транспортировке и иммунитете.

Лантибиотики: структурный ген lanA. Гены, ответственные за модификацию (lanB, lanC, lanM, lanD и lanJ), процессинг (lanP и lanT), транспорт (lanT), иммунитет (lanI, lanEFG и lanH) и регуляцию (lanR, lanK, lanQ и lanX), локализованы рядом со структурным геном [17].

Pediocin PA-1 представляет собой БЦ класса IIa, продуцируемый Pediococcus acidilactici. Гены pedB, pedC, pedD участвуют в модификации, транспортировке и иммунитете.

Lactacin F — это антибактериальное вещество, относящееся к группе БЦ, которое продуцируется бактериями рода Lactobacillus, представляет важные молекулы, помогающие пробиотическим бактериям защищаться от конкурирующих микроорганизмов. Этот БЦ состоит из двух полипептидов, кодируемых генами lafA и lafX, которые вместе формируют активный комплекс. Гены lafI и lafF играют важную роль в защите от собственного действия БЦ и способствуют его эффективной транспортировке, обеспечивая иммунитет продуцента [18].

Plantaricin — это группа БЦ, вырабатываемых определенными штаммами бактерий Lactiplantibacillus plantarum. Гены — plnA, plnE, plnF (ответственные за синтез компонентов плантарицина), plnG (регулирует экспрессию генов плантарицина), plnH (защищает организм от воздействия собственного БЦ), plnABCD, plnEFI, plnJKLR, plnMNOP, plnGHSTUV (опероны) [19].

Reuterin обладает антимикробной активностью и продуцируется некоторыми штаммами Limosilactobacillus reuteri в кишечнике животных и человека. Ген gldA кодирует фермент глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу, который играет центральную роль в синтезе реутерина. Ген gldA катализирует реакцию, в результате которой глицеральдегид-3-фосфат преобразуется в глицеральдегид, что является ключевым этапом в биосинтезе реутерина [20].

Sakacin — БЦ, который продуцируется определенными штаммами Latilactobacillus sakei [21]. Гены — sakA, sakB (компоненты БЦ), sakC, sakD (иммунитет).

Методы изучения антагонистической активности бактерий играют важную роль в микробиологии и биомедицине. Каждый из существующих методов имеет уникальные характеристики и область применения, начиная от традиционного метода двухслойного агара и заканчивая современными методами, такими как микротитрование и совместное культивирование. Выбор конкретного метода зависит от целей исследования, доступного оборудования и характеристик исследуемых микроорганизмов. Часто для получения более полной картины антагонистической активности применяют комбинацию нескольких методов.

Применение современных методов, таких как точечный анализ, отсроченный антагонизм и кокультивирование, открывает новые возможности для детального понимания механизмов действия пробиотических штаммов микроорганизмов и их потенциального применения в борьбе с инфекциями, а также для разработки новых эффективных пробиотических препаратов. Рассмотренные методы определения антагонистических свойств микроорганизмов демонстрируют разнообразие подходов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

Преимуществами классического метода двухслойного агара являются простота выполнения, доступность материалов и возможность визуальной оценки ингибирования роста микроорганизмов, но к недостаткам относятся ограниченная точность, субъективность при подсчете колоний, сложность стандартизации и невозможность точной оценки степени антагонизма. Метод точечного анализа позволяет более точно и быстро оценить антагонистическую активность по сравнению с классическим методом, варьировать условия эксперимента (плотность засева, состав среды), но требует определенных навыков и опыта. Метод отсроченного антагонизма позволяет количественно оценить антибактериальную активность с использованием коэффициента ингибиции роста, но он более трудоемкий и требует соблюдения точных сроков инкубации. Другие методы, такие как метод перпендикулярных «штрихов», диско-диффузионный метод и метод микротитрования, также имеют свои преимущества и недостатки. Метод перпендикулярных «штрихов» подходит для одновременной проверки чувствительности большого количества УПМ к потенциально пробиотическому штамму. Диско-диффузионный тест прост в выполнении и позволяет оценить чувствительность к разным концентрациям веществ, но результаты зависят от диффузии вещества в агаре. Метод микротитровальных планшетов автоматизирован, обеспечивает точную и объективную оценку влияния концентраций тест-культур, однако требует специального оборудования и программного обеспечения. Метод кокультивирования требует моделирования естественных условий взаимодействия микроорганизмов и позволяет изучать динамику взаимодействия и синергический эффект, но сложен в интерпретации результатов. В этом методе необходимо оптимизировать условия культивирования для каждого штамма.

Методы фенотипической оценки антагонистической активности являются важным инструментом для скрининга новых штаммов — кандидатов в пробиотики, однако обнаруженная высокая активность требует дополнительного подтверждения и углубленного изучения молекулярно-генетическими методами для всесторонней характеристики штамма.

Дальнейшие исследования в области разработки новых и усовершенствования существующих методов определения антагонизма микроорганизмов являются важной задачей для развития биотехнологии и медицины.

Внешнее финансирование. Исследование выполнено в рамках государственного задания №1023022000100-9 по теме «Разработка и внедрение методов лечения и профилактики воспалительных заболеваний кишечника и антибиотико-ассоциированной диареи на основе применения аутотрансплантации аутоштаммов пациентов с пробиотической активностью».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Мелкумян А.Р.

Сбор и обработка материала — Чистякова Д.А., Шафикова А.А.

Написание текста — Чистякова Д.А., Мелкумян А.Р.

Редактирование — Мелкумян А.Р.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.