Введение

Устойчивость к противомикробным препаратам — серьезная глобальная социальная, экономическая и медицинская проблема. Механизмы формирования антимикробной резистентности объединяются в несколько принципиальных направлений, и одно из основных — ферментативный гидролиз антибиотиков. К настоящему времени описано >1000 β-лактамаз, различающихся по субстратной специфичности, чувствительности к действию ингибиторов, локализации генов, отвечающих за их продукцию. Карбапенемазы — ферменты из группы бета-лактамаз, проявляющие способность гидролизовать карбапенемные антибиотики.

По данным литературы, 3 вида составляют >80% всех резистентных к карбапенемам нозокомиальных штаммов грамотрицательных палочек: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii и Klebsiella pneumoniae [1].

Результаты проведенного в России многоцентрового эпидемиологического исследования свидетельствуют о значимом увеличении частоты устойчивости P. aeruginosa к меропенему (p=0,0001) и продукции карбапенемаз групп blaVIM (p=0,0001) и blaGES-5 (p=0,0032). Резистентность к меропенему проявляли 55,5% штаммов P. aeruginosa [2]. Результаты этого исследования свидетельствуют о чрезвычайно высокой распространенности резистентности к большинству антибиотиков, включая карбапенемы, у нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp. [3]. Согласно результатам данного исследования, устойчивость к меропенему проявляли 77,1% изолятов A. baumannii. У 76,2% изолятов A. baumannii выявлено наличие генов приобретенных карбапенемаз молекулярного класса D, относящихся к группам blaOXA-24/40 (57,5%), blaOXA-23 (18,4%) и blaOXA-58 (0,1%). У 0,2% штаммов выявлено одновременное наличие генов blaOXA-24/40 и blaOXA-23-подобных бета-лактамаз. В связи с этим выбор антибиотиков для эмпирической терапии является крайне затруднительным и требует проведения регулярного локального мониторинга чувствительности в каждом стационаре.

В России продукция карбапенемаз чаще остальных представителей семейства Enterobacteriaceae выявляется у K. pneumoniae (26,5%). Следует отметить, что доля нозокомиальных изолятов энтеробактерий, продуцирующих карбапенемазы, статистически значимо увеличилась с 7,8% в 2013—2014 гг. до 14,4% в 2015—2016 гг. (p=0,0001). В 2015—2016 гг. доля продуцентов карбапенемаз blaOXA-48 составила 11,4%, в основном среди изолятов K. pneumoniae [4].

В отношении карбапенемаз доказана возможность их прямой антропозоонозной или зооантропонозной передачи в домашних хозяйствах, через продукты питания. Происходит постепенная колонизация объектов дикой природы (контакт со сточными водами, хранилища навоза, свалки и др.). Перелетные птицы могут выступать в качестве резервуаров и переносчиков карбапенемаз типов blaNDM, blaOXA-48, blaIMP, blaVIM-1 и blaKPC-2, распространяя их за пределы границ ферм, зон проживания, стран или даже континентов [5]. Рост резистентности к карбапенемам среди нозокомиальных штаммов неферментирующих грамотрицательных бактерий и семейства Enterobacteriaceae отмечается во всем мире. Гены, кодирующие карбапенемазы, входят в состав мобильных генетических элементов (плазмиды, транспозоны), что способствует их быстрому распространению в госпитальной среде [6]. В связи с этим признается необходимость проведения постоянного мониторинга чувствительности этих бактерий к карбапенемам, что позволит контролировать целесообразность назначения той или иной антибиотикотерапии инфекций [7, 8].

Цель исследования — определить распространенность в онкологическом стационаре нозокомиальных штаммов грамотрицательных бактерий, устойчивых к карбапенемам; сопоставить результаты генотипирования карбапенемаз P. aeruginosa, A. baumannii и K. pneumoniae, выделенных в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» МЗ РФ, с результатами тестирования на продукцию металлобеталактамаз методом Etests MBL IP/IPI.

Материал и методы

Для идентификации чистой культуры микроорганизмов применяли масс-спектрометрический анализ белковой фракции микробной клетки на приборе MALDI-TOF Microflex LT («Biotyper, Bruker Daltonics», Германия). Идентификация проводилась в соответствии с инструкцией производителей прибора. Таксономическая структура нозокомиальных штаммов грамотрицательных палочек анализировалась с исключением повторов (использована программа статистического анализа микробиологических анализаторов Vitek-2 и Walk-Away). Оценку чувствительности к антимикробным препаратам осуществляли на микробиологических анализаторах Microscan Walk Away 40/96+ Plus («Siemens», Германия) и Vitek 2 («BioMerieux», Франция), используя критерии EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Version 9.0, valid from 2019-01-01). Антибиотикочувствительность проанализирована за период 2017—2019 гг. Наличие генов приобретенных карбапенемаз определяли с помощью ПЦР в реальном времени, генотипирование проводилось в рамках многоцентровых эпидемиологических исследований МАРАФОН и APEx сотрудниками НИИ антимикробной химиотерапии ФГБОУ ВО «СГМУ» Минздрава России, Смоленск, Россия. Всего с этой целью было исследовано 160 штаммов грамотрицательных палочек, выделенных из различных биоматериалов онкологических больных ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» МЗ РФ. С ноября 2017 г. по апрель 2018 г. исследовано 122 штамма (для A. baumannii определяли генотипы blaVIM, blaIMP, blaNDM, blaOXA-23, blaOXA-40, blaOXA-58; для P. aeruginosa определяли генотипы blaVIM, blaIMP, blaNDM и blaGES 5-like; для K. pneumoniae определяли генотипы blaVIM, blaIMP, blaNDM, blaOXA-48, blaKPC. С января по июнь 2019 г. исследовано 38 штаммов (для A. baumannii определяли генотипы blaVIM, blaIMP, blaNDM, blaOXA-23, blaOXA-40, blaOXA-58, blaOXA-51; для P. aeruginosa определяли генотипы blaVIM, blaIMP, blaNDM и blaGES 5-like; для K. pneumoniae определяли генотипы blaVIM, blaIMP, blaNDM, blaOXA-48, blaKPC.

Отбор штаммов для фенотипического определения способности к продукции карбапенемаз осуществлялся в соответствии с нормативными документами [9, 10].

Для скрининга на наличие металлобеталактамаз (MBL) P. aeruginosa и A. baumannii использовали градиентные полоски Etests MBL IP/IPI в соответствии с инструкциями производителя (E-tests MBL IP/IPI, для определения металлобеталактамаз P. aeruginosa и A. baumannii MBL IP/IPI, «BioMerieux», Франция). Etests MBL IP/IPI содержат повышенные концентрации имипенема (IP) на одном конце и имипенема в комбинации с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (IPI) на другом. ЭДТА хелатирует ионы цинка, необходимые MBL для гидролиза имипенема и меропенема, тем самым ингибируя активность MBL. Снижение минимальной подавляющей концентрации (МПК) имипенема в присутствии ЭДТА, более или равное 8-кратному (IP/IPI ≥8), интерпретируется как указание на активность MBL (рис. 1, 2).

Рис. 1. A. baumannii, среда Мюллера—Хинтона, Etests MBL IP/IPI — положительный результат: МПК IP>256 мкг/мл, МПК IPI=2 мкг/мл.

Рис. 2. P. aeruginosa, среда Мюллера—Хинтона, Etests MBL IP/IPI — положительный результат: МПК IP=16 мкг/мл, МПК IPI=1 мкг/мл.

Статистическая обработка результатов: различия между характеристиками оценивали с помощью точного критерия Фишера, статистически значимыми считали различия при степени вероятности безошибочного прогноза 95% (p<0,05).

Результаты и обсуждение

С 01.12.18 по 30.11.19 проанализирована таксономическая структура 1048 нозокомиальных штаммов грамотрицательных палочек, и 81,1% (850/1048) штаммов составили 4 вида: E. coli (26,2%), A. baumannii (22,0%), K. pneumoniae (18,6%) и P. aeruginosa (14,0%).

В табл. 1 представлены данные по резистентности in vitro к карбапенемам основных грамотрицательных палочек — возбудителей нозокомиальных инфекционных осложнений у взрослых онкологических пациентов за 3 года (2017—2019 гг.).

Таблица 1. Резистентность in vitro к карбапенемам основных нозокомиальных возбудителей инфекционных осложнений у взрослых в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина

Примечание. * — количество штаммов резистентных и с умеренной резистентностью (область технической неопределенности).

В общей сложности более ¹/₂ основных возбудителей in vitro обладает резистентностью к карбапенемам, и лидером является A. baumannii. Следует заметить, что для A. baumannii уровень резистентности к обеим карбапенемам очень высок в течение всех анализируемых лет. Несколько ниже уровень резистентности для K. pneumoniae и P. aeruginosa. Для E. coli резистентность к карбапенемам наиболее низкая, причем отмечается тенденция к ее снижению.

По сводным данным за 2017—2019 гг., резистентность основных видов грамотрицательных палочек к имипенему статистически значимо выше по сравнению с меропенемом (57,3% против 52,0% соответственно, p<0,01). Хотя отдельно ни для A. baumannii, ни для P. aeruginosa и K. pneumoniae статистически значимых различий по резистентности к имипенему и меропенему не выявлено (рис. 3).

Рис. 3. Резистентность основных возбудителей к меропенему и имипенему.

KP — K. pneumoniae, PA — P. aeruginosa, AB — A. baumannii, EC — E. coli.

Анализ ежегодной резистентности основных возбудителей выявил некоторые особенности (рис. 4, 5).

Рис. 4. Динамика резистентности основных возбудителей к меропенему.

КР — K. pneumoniae, PA — P. aeruginosa, AB — A. baumannii.

Рис. 5. Динамика резистентности основных возбудителей к имипенему.

КР — K. pneumoniae, PA — P. aeruginosa, AB — A. baumannii.

Анализ резистентности к карбапенемам по каждому году показал, что для A. baumannii никаких изменений не выявлено, и доля резистентных штаммов к обоим препаратам высока в течение всего периода наблюдений. Кроме того, можно предположить, что ведущим механизмом резистентности для A. baumannii является способность микроорганизма к продукции карбапенемаз класса D (blaOXA). Пояснения к данной позиции изложены ниже.

Иная ситуация в отношении P. aeruginosa. В 2019 г. резистентность к обоим препаратам снизилась и была примерно на одном уровне. При этом статистически значимых различий в резистентности к меропенему не отмечалось, тогда как к имипенему выявлено статистически значимое снижение резистентности в 2019 г. по сравнению с предыдущими годами (40,7% против 58,7% соответственно, p<0,01). Штаммы, резистентные к имипенему, но чувствительные к другим карбапенемам, чаще всего имеют механизм резистентности, обусловленный нарушением проницаемости пориновых каналов. Резистентность же к меропенему при сохранении чувствительности к другим карбапенемам чаще всего связана с ускоренным выведением антибиотика из бактериальной клетки (эффлюкс). Считается, что сложность регуляторных механизмов обеспечивает гибкость реакции P. aeruginosa, которая проявляется в ее способности быстро приобретать и быстро утрачивать резистентность в зависимости от условий окружающей среды [11]. Для K. pneumoniae в отношении меропенема отмечена тенденция к снижению резистентности в 2019 г. Другая ситуация для имипенема — выявлено статистически значимое повышение резистентности в 2019 г. по сравнению с предыдущими годами (60,3% против 48,5% соответственно, p<0,02). Можно предположить, что это обусловлено нарушением проницаемости пориновых каналов. Согласно ранее проведенным нами исследованиям, параллельно с продукцией карбапенемаз у P. aeruginosa и K. pneumoniae наблюдалось нарушение проницаемости для карбапенемов в 100 и 91,4% случаев соответственно. Кроме того, у части штаммов наблюдалось только нарушение проницаемости карбапенемов, без способности к продукции карбапенемаз. Сочетание продукции карбапенемаз с нарушением проницаемости делает нецелесообразным использование высоких доз и продолжительных инфузий карбапенемов, а требует лечения с использованием новейших ингибитор-защищенных цефалоспоринов [12].

В рамках настоящего исследования были использованы результаты молекулярно-генетического тестирования 160 штаммов, полученных при культуральном исследовании биоматериалов онкологических больных с инфекционными осложнениями, собранных с ноября 2017 г. по июнь 2019 г. в НМИЦ онкологии (A. baumannii 48 штаммов, P. aeruginosa 38 штаммов, K. pneumoniae 47 штаммов, прочие грамотрицательные палочки 26 штаммов). Способность продуцировать карбапенемазы была выявлена в целом у 118 (73,8%) штаммов. 52,6% (20/38) штаммов P. aeruginosa обладали способностью вырабатывать карбапенемазы (17 штаммов — blaVIM, 3 штамма — blaGES 5-like). Все штаммы P. aeruginosa с карбапенемазной активностью были устойчивы к меропенему. 100% (48/48) штаммов A. baumannii обладали способностью вырабатывать карбапенемазы (34 штамма — blaOXA-23, 12 штаммов — blaOXA-23+blaOXA-51 и по одному штамму — blaOXA-23+blaOXA-40 и blaOXA-40+blaOXA-51. Все штаммы A. baumannii с карбапенемазной активностью были устойчивы к меропенему. 93,6% (44/47) штаммов K. pneumoniae обладали способностью вырабатывать карбапенемазы (42 штамма — blaOXA-48, по одному штамму — blaKPC и по одному штамму — blaNDM). В отличие от неферментирующих грамотрицательных палочек (A. baumannii и P. aeruginosa) из 44 штаммов K. pneumoniae с карбапенемазной активностью только 38,6% (17/44) были расценены как устойчивые к меропенему, у 40,9% (18/44) штаммов регистрировалась умеренная резистентность (область технической неопределенности) и 20,5% (9/44) штаммов были чувствительны к меропенему по результатам тестирования in vitro (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение способности к продукции карбапенемаз с активностью против меропенема in vitro (период коллекции штаммов — ноябрь 2017 — июнь 2019)

Примечание. Ч* — чувствительность, У/Р** — умеренная резистентность (область технической неопределенности), Р*** — резистентность.

Высокие или низкие значения МПК карбапенемов не обязательно отражают продукцию карбапенемаз, так как существуют и другие механизмы, такие как снижение проницаемости внешних структур (потеря пориновых каналов) или усиленный отток антибиотика из бактериальной клетки (эффлюкс), хромосомные механизмы развития резистентности. Различия между резистентностью к карбапенемам, опосредованной карбапенемазами, и резистентностью, обусловленной другими механизмами, важны для осуществления инфекционного контроля. Новые пограничные значения МПК для карбапенемов позволяют классифицировать большинство штаммов — продуцентов карбапенемаз как «резистентные» к карбапенемам. В то же время российские и зарубежные Рекомендации предлагают осуществлять отбор штаммов семейства Enterobacteriaceae с пониженной чувствительностью и резистентных к карбапенемам при МПК для меропенема >0,125 мкг/мл или диаметре зоны задержки роста <28 мм. В этот диапазон попадает и часть штаммов, которые расцениваются согласно существующим критериям как штаммы, чувствительные к меропенему. В нашем исследовании таких изолятов K. pneumoniae оказалось 20,5% (9/44) (см. табл. 2). Следовательно, необходимо очень тщательно осуществлять отбор штаммов энтеробактерий для определения карбапенемазной активности. Напротив, в отношении Pseudomonas spp. и Acinetobacter spp., согласно последним Рекомендациям, отбор штаммов для выявления карбапенемаз предлагается проводить только у всех нечувствительных к карбапенемам изолятов, что важно в целях получения эпидемиологических данных и осуществления инфекционного контроля в конкретном стационаре [9, 10]. Результаты нашего исследования полностью согласуются с этими рекомендациями, поскольку все изоляты P. aeruginosa и A. baumannii, у которых была подтверждена молекулярно-генетическим методом способность к продукции карбапенемаз, были в 100% случаев устойчивы к карбапенемам.

В качестве одного из фенотипических методов определения способности грамотрицательных палочек к продукции металлокарбапенемаз был использован Etests MBL IP/IPI. С 3 декабря 2018 г. по 6 июня 2019 г. протестировано 54 штамма (28 P. aeruginosa, 26 A. baumannii), из них у 20 штаммов (8 P. aeruginosa, 12 A. baumannii) было проведено генотипирование. Для P. aeruginosa в 3 (37,5%) случаях из 8 способность к продукции карбапенемаз молекулярно-генетическим методом не подтвердилась, хотя Etests MBL IP/IPI на металлобеталактамазы были положительные. Для остальных 5 штаммов результаты Etests MBL IP/IPI подтвердились при генотипировании — была выявлена способность к продукции металлобеталактамаз blaVIM. Все 12 штаммов A. baumannii по результатам Etests MBL IP/IPI были способны вырабатывать металлобеталактамазы, но генотипирование не обнаружило генов карбапенемаз класса B, причем все протестированные штаммы имели сразу 2 гена, ответственные за продукцию карбапенемаз, но не класса B, а класса D — blaOXA23 и blaOXA51 (табл. 3).

Таблица 3. Etests MBL IP/IPI для определения металлобеталактамаз P. aeruginosa и A. baumannii и генотипы (период коллекции штаммов декабрь 2018 г. — июнь 2019 г.)

По данным литературы от 2002 г., метод Etests имеет чувствительность 94% и специфичность 95% [13]. За 17 лет ситуация изменилась. Опубликованы сообщения о ложноположительных результатах с использованием Etests MBL IP/IPI в присутствии карбапенемаз типа blaOXA. Одно из объяснений аномальных результатов, полученных с помощью полосок Etests MBL IP/IPI, может исходить из данных, представленных F. Danel и соавт. [14]. Некоторые карбапенемазы типа blaOXA (например, blaOXA-10 и blaOXA-14 у грамотрицательных бактерий семейства Enterobacterales или blaOXA-23-подобные у A. baumannii) существуют в высокоактивных димерных и менее активных мономерных формах. Исследованы факторы, влияющие на состояние олигомеризации β-лактамаз класса D blaOXA-10 и blaOXA-14. Было обнаружено, что оба фермента существуют в виде равновесной смеси мономера и димера. Димерная форма стабилизирована катионами двухвалентного металла. Способность различных ионов металлов стабилизировать димер находилась в следующем порядке: Cd 2+>Cu>2+>Zn>2+>Co>2+>Ni>2+>Mn>2+>Ca>2+>Mg>2+. Ионы металлов оказали глубокое влияние на термическую стабильность белкового комплекса. Равновесие между мономером и димером зависит от pH, и оптимум для образования димера смещается от pH 6,0 в отсутствие двухвалентных катионов до pH 7,5 при насыщающих концентрациях. Активность β-лактамазы увеличивалась примерно в 2 раза в присутствии насыщающих концентраций ионов цинка и кадмия. Реакция с β-лактамами вызывала сдвиг равновесия в сторону образования мономера, а значит и явную инактивацию, но двухвалентные катионы защищали от этого эффекта [15]. Анализ полученных данных секвенирования показал, что гены blaOXA идентичны blaOXA-23. Таким образом, вполне вероятно, что продукция blaOXA-23 является основным механизмом устойчивости к карбапенемам для изолятов A. baumannii, поскольку этот фермент обеспечивает высокий уровень резистентности к имипенему и меропенему (МПК >32 мкг/мл). Вопрос о том, требует ли blaOXA-23 полной активации димеризации, не был проверен. Однако тот факт, что этот фермент существует в двух формах, объясняет наблюдения о том, что группа ферментов blaOXA-23—27 имеет слабую активность против карбапенемов, но обладает in vitro высокой устойчивостью к имипенему (МПК 16—32 мкг/мл) и меропенему (МПК 32—>128 мкг/мл). В присутствии хелатора металла, ЭДТА, ферменты типа blaOXA переходят в менее активное мономерное состояние с сопутствующим снижением активности карбапенемазы. Таким образом, 8—64-кратное снижение МПК IP/IPI, наблюдаемое при использовании Etests MBL IP/IPI, может указывать на превращение blaOXA-23 в менее активную мономерную форму, а не на активность MBL, и для проверки этой гипотезы необходима дальнейшая работа. Эти данные предполагают, что результаты, полученные с помощью Etests MBL IP/IPI, следует интерпретировать с осторожностью, особенно когда тестируемым микроорганизмом является A. baumannii и, возможно, другие патогенные микроорганизмы, включая P. aeruginosa, которые, как известно, содержат оксациллиназы. В этих случаях может потребоваться проведение ПЦР для выявления генов типа MBL и OXA [16].

Заключение

Основные виды грамотрицательных палочек, которые выделены от онкологических больных при инфекционных осложнениях в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина», составили 81,1%. Это E. coli (26,2%), A. baumannii (22,0%), K. pneumoniae (18,6%) и P. aeruginosa (14,0%). В целом более ¹/₂ основных возбудителей in vitro обладает резистентностью к карбапенемам, и лидером является A. baumannii. Для A. baumannii уровень резистентности к обеим карбапенемам очень высок в течение всех анализируемых лет. Несколько ниже уровень резистентности для K. pneumoniae и P. aeruginosa. Для E. coli резистентность к карбапенемам наиболее низкая. Для P. aeruginosa при генотипировании была выявлена способность к продукции главным образом металлобеталактамаз blaVIM, для A. baumannii — blaOXA23+blaOXA51, для K. pneumoniae — в основном blaOXA-48, причем 20,5% изолятов K. pneumoniae с карбапенемазной активностью были расценены по результатам тестирования как чувствительные к карбапенемам in vitro. Наш опыт тестирования штаммов P. aeruginosa и A. baumannii на продукцию металлокарбапенемаз с использованием Etests MBL IP/IPI показал, что результаты, полученные с помощью Etests MBL IP/IPI, следует интерпретировать с осторожностью, так как у 37,5% штаммов P. aeruginosa не было обнаружено карбапенемаз класса B, а у 100% протестированных штаммов A. baumannii генотипирование не обнаружило генов карбапенемаз класса B, причем все протестированные штаммы имели сразу 2 гена, ответственные за продукцию карбапенемаз, но не класса B, а класса D — blaOXA23 и blaOXA51. В нашем исследовании в отношении A. baumannii в 100% случаев был получен ложноположительный результат с использованием Etests MBL IP/IPI в присутствии карбапенемаз типа blaOXA.

Таким образом, для адекватной антибактериальной терапии инфекций, вызванных карбапенем-нечувствительными штаммами грамотрицательных палочек, необходимо проводить расшифровку механизмов устойчивости основных нозокомиальных патогенов к карбапенемам при помощи как фенотипических, так и молекулярно-генетических методов.

Благодарности. Авторы статьи выражают благодарность коллективу НИИ антимикробной химиотерапии ФГБОУ ВО «СГМУ» Минздрава России (Смоленск, Россия) за возможность использовать результаты генотипирования штаммов, собранных в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, в рамках многоцентровых эпидемиологических исследований МАРАФОН и APEx.

Авторы подтверждают, что статья или ее части ранее не были опубликованы.

Участие авторов:

Багирова Н.С. — идея исследования, техническое выполнение лабораторных исследований, написание текста статьи, анализ результатов, статистическая обработка результатов, подборка литературы по теме исследования

Петухова И.Н. — разработка критериев включения/исключения штаммов, правка текста статьи

Григорьевская З.В. — подборка литературы по теме исследования

Дмитриева Н.В. — подборка литературы по теме исследования

Терещенко И.В. — подборка литературы по теме исследования, техническое выполнение лабораторных исследований

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.