Анализ полиморфизмов генов системы гемостаза и фолатного цикла у пациентов с розацеа

Розацеа — хроническое воспалительное заболевание кожи неустановленной этиологии. Заболевание характеризуется рецидивирующей гиперемией и отеком кожи, эритемой, папулезно-пустулезными высыпаниями, телеангиэктазиями, пустулами или сочетанием этих симптомов. Затяжное течение болезни, склонность к рецидивам, изменение цвета лица, изъязвление кожи и образование рубцов при розацеа оказывают пагубное влияние на физическое, психическое и социальное здоровье пациентов. Патофизиология розацеа до конца не изучена. Как полагают многие авторы, важную роль в развитии заболевания играют наследственность, иммунная дисрегуляция, сосудистая гиперреактивность, хроническое воспаление, инвазия микроорганизмов, а также некоторые факторы окружающей среды [1–7].

В последние годы все большую роль в патогенезе розацеа отводят генетическим факторам. Согласно данным литературы, идентифицированы такие факторы риска развития розацеа, как наследственность, фототип кожи (по Фицпатрику IV фототип) и специфические генетические варианты ApaI G/T, что убедительно свидетельствует о генетической предрасположенности к возникновению данного патологического состояния. Проведенные исследования идентифицировали некоторые гены, связанные с патогенезом розацеа: ген молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 (связанный с барьерной функцией кожи), ген глутатион S-трансфераз θ-1 (GSTT1) и/или глутатион-S-трансферазы μ-1 (GSTM1) и нуклеотид-связывающий домен, богатый лейцином повтор и пириновый домен, содержащий ген рецептора 3 NLRP3 (связанный с иммунными реакциями и воспалением), человеческий лейкоцитарный антиген-DR альфа (HLA-DRA), ген бутирофилиноподобного протеина 2 (BTNL2), гены преобразователей сигналов и активаторов транскрипции (белков STAT), также связанных с функцией иммунной системы [6, 8–10]. Исследования, основанные на изучении семейных, близнецовых и региональных факторов (кельтское и североевропейское происхождение), также свидетельствуют о важном значении генетической предрасположенности к возникновению розацеа. Более того, с 2015 г. результаты генетических исследований, посвященных изучению роли генетических факторов в развитии розацеа, публикуются каждый год. С появлением новых технологий, таких как секвенирование генома, анализ омик, а также других инструментов биоинформатики, количество таких публикаций имеет тенденцию к увеличению. Таким образом, очевидна необходимость проведения дальнейших исследований с целью выявления причинных генов, особое внимание следует уделить изучению их функциональности. Гены свертывающей системы крови и метаболизма фолатов могут дать более полное представление о причинах возникновения и механизмах развития заболевания. Актуальным является также изучение их роли в качестве потенциальных предикторов риска возникновения и степени тяжести розацеа [11–17].

Цель исследования — изучение у пациентов с розацеа полиморфизмов генов системы гемостаза и фолатного цикла.

Исследование проведено на базе научно-диагностического центра Immunogen test при Институте иммунологии и геномики человека АН РУз. Основную группу составили 27 пациентов с установленным диагнозом розацеа различной степени тяжести. В контрольную группу вошли 20 условно здоровых испытуемых без розацеа.

Генотипирование образцов крови проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для приготовления банка ДНК у участников исследования осуществляли забор 3–5 мл венозной крови из локтевой вены с использованием вакутейнеров с антикоагулянтом/консервантом — 15% трикалиевым EDTA (Ethylenediamin-tetraacetik Acid). Кровь для дальнейшей обработки могла сохраняться до 24 ч при температуре 4 °C. Для получения геномной ДНК использовали двухэтапный метод лизиса клеток крови: 1-й этап — получение лизатного концентрата лейкоцитарных клеток, 2-й этап — дальнейшая очистка лизатов лейкоцитарной массы методом спиртово-солевой обработки [18] в модернизированной форме. Концентрацию ДНК доводили до 100 нг/мл. Измерение концентрации ДНК проводили на спектрофотометре NanoDrop Lite («Thermo Fisher Scientific», США). Анализ последовательности ДНК осуществляли методом ПЦР в режиме реального времени с использованием технологии Q-PCR HRM и PCR-детекции электрофорезом на микрочипе. Для типирования полиморфных вариантов изучаемых генов-кандидатов (табл. 1) использованы методы HRM-qPCR (Stratagene M*3005P, «Agilent Technologies», Германия; «DT-Prime», Россия) и микрочиповой PCR-детекции (MCE 202 MultiNA, «Zhimadzu», Япония).

Таблица 1. Описание исследуемых генов

Исследование уровня гомоцистеина проводили с использованием метода ИХЛА (прибор IMMULITE 2000 Xpi с соответствующими реактивами, «SIEMENS», Германия).

Статистическую обработку выполняли с использованием программы JAMOVI version 1.1.9. Качественные данные представляли в виде абсолютных и относительных показателей, количественные — в виде показателей описательной статистики: среднего значения (mean) и стандартного отклонения (standard deviation). Для определения нормальности распределения признаков использовали тест Шапиро—Уилка, для сравнения групп — непараметрический критерий Манна—Уитни. Для оценки различий относительных величин использовали анализ таблиц сопряженности χ². Выбранный критический уровень значимости составил 5% (0,05).

Возраст пациентов основной группы варьировал от 15 до 64 лет (средний — 39,1±13,6 года). Возраст пациентов контрольной группы колебался от 18 до 40 лет (средний — 35,2±9,1 года). В основной группе женщин было 52%, мужчин — 48%, в контрольной — соответственно 45 и 55%. Частота встречаемости хронического холецистита и уровень гомоцистеина в крови испытуемых у пациентов основной группы были достоверно выше (соответственно p<0,05 и p<0,001), чем в контрольной группе. Клиническая характеристика пациентов и условно здоровых добровольцев представлена в табл. 2.

Таблица 2. Клиническая характеристика основной группы и группы контроля

Примечание. ЭТП — эритематозно-телеангиэктатический подтип; ППП — папулопустулезный подтип.

Структурно в системе гемостаза выделяют плазменное звено (факторы свертывания и образование фибрина — гены F2, F5, F7, F13, FGB) и сосудисто-тромбоцитарное звено (факторы адгезии тромбоцитов к сосудистой стенке, сокращения сосудов, агрегации тромбоцитов, формирования тромба — гены ITGA2, ITGB3, PAI-1). При изучении у пациентов с розацеа полиморфизмов 8 генов свертывающей системы крови (F2: 20210 G>A, F5:1691 G>A, F7:10976 G>A, F13A1:103 G>T, FGB: –455 G>A, ITGA2: 807 C>T, ITGB3: 1565 T>C, PAI-1: –675 5G>4G) получены данные, представленные в табл. 3. При исследовании плазменного звена гемостаза у обследованных пациентов преимущественно выявлены благоприятные аллели G/G. Гетерозиготные и гомозиготные неблагоприятные варианты генов встречались у незначительной части больных.

Таблица 3. Частота встречаемости полиморфных аллелей генов системы гемостаза

В то же время в сосудисто-тромбоцитарном звене у значительной части пациентов обнаружены неблагоприятные варианты генов как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии. Значительная доля неблагоприятных вариантов встречалась в генах ITGB3: 1565 T>C и PAI-1: –675 5G>4G по сравнению с контрольной группой.

ITGA2-α2: 807 C>T rs1126643 – интегрин, рецептор тромбоцитов к коллагену, обеспечивает взаимодействие тромбоцитов с поврежденной стенкой сосудов. Интегрин, ген альфа-2 (ITGA2: 807 C>T), кодирует GP Ia/IIa (гликопротеин Ia/IIa тромбоцитов); среди основных интегриновых рецепторов также известен как интегрин α2β1, расположен на хромосоме 5q23-31. SNP гена ITAG2 изменяет экспрессию GP Ia/IIa C807T. GP Ia/IIa отвечает за адгезию тромбоцитов к коллагену I типа, следовательно, дефицит GP Ia/IIa (приобретенный или врожденный) приводит к нарушению процесса адгезии тромбоцитов. При сравнении основной и контрольной групп статистически значимых различий не выявлено (прослеживалась тенденция к наличию различий, p=0,07).

ITGB3-β: 31565 rs5918 — интегрин, рецептор тромбоцитов к фибриногену, участвует в агрегации и адгезии тромбоцитов к субэндотелиальным структурам. Интегрин-β3 ITGB3: 1565 T>C (распространенный полиморфизм в ITGB3), известный как человеческий тромбоцитарный антиген 1 (HPA-1b, PlA2 или rs5918), возникает из-за замены одного нуклеотида в положении 1565 в экзоне 2 ITGB3, что приводит к замене лейцина (PlA1) на пролин (PlA2) в остатке 33. SNP ранее был изучен как наследственный фактор риска острого коронарного синдрома, исследовали также его влияние на функцию тромбоцитов. Полиморфизм потенциально может влиять на активность комплекса GPIIb/IIIa и ассоциироваться с тромбозом. GPIIb/IIIa считается рецептором контакта тромбоцитов с тромбоцитами, играющим важную роль в их агрегации, а его SNP связаны с гиперреактивностью тромбоцитов. Как известно, увеличение агрегационных свойств тромбоцитов тесно связано с состоянием сосудистой стенки. Участие тромбоцитов в системе гемостаза при розацеа определяется их ангиотрофической функцией (способностью поддерживать нормальную структуру и функцию микрососудов, их устойчивость к повреждающим воздействиям, а также способностью поддерживать спазм поврежденных сосудов путем секреции вазоактивных веществ, например серотонина, норадреналина и др.). При сравнении основной группы с контрольной в гене ITGB3: 1565 T>C выявлены статистически значимые различия в генотипе T/C (p<0,05).

Ингибитор активатора плазминогена типа 1 (PAI-1: –675 5G>4G), также известный как ингибитор белковой серпинпептидазы, ветвь E, член 1 (SERPINE1), принадлежит к суперсемейству ингибиторов сериновых протеаз. Он играет важную роль в регуляции фибринолитической системы, быстро ингибирует активатор плазминогена тканевого типа (tPA) и активатор плазминогена урокиназного типа (uPA), который не может расщеплять плазминоген с образованием плазмина. Ген, кодирующий PAI-1, имеет несколько полиморфных локусов, среди которых наиболее хорошо изучен инсерционно-делеционный полиморфизм 4G/5G, содержащий либо 4, либо 5 (4G/5G) гуаниновых оснований на 675 PAI-1 промоторе. Различные варианты гена PAI-1 изменяют уровень белка ингибитора активатора плазминогена PAI-1, что приводит к снижению фибринолитической активности плазмы. В ряде исследований изучены ассоциации между PAI-1 4G/5G полиморфизмом и риском развития атопического дерматита, метаболического синдрома и другой патологии. Согласно полученным нами данным, у обследованных пациентов в 70% случаев наблюдались варианты гена PAI-1: –675 5G>4G. Выявлены статистически значимые различия с контрольной группой в гомозиготном варианте 4G/4G (p<0,05), что позволяет сделать предположение о снижении у этих пациентов фибринолитической активности плазмы.

Частота встречаемости полиморфных аллелей генов метаболизма фолатов представлена в табл. 4. Гены ферментов фолатного цикла отвечают за активность ферментов реакций метилирования, которые ответственны за многие ферментативные превращения. Ген MTHFR, кодирующий метилентетрагидрофолатредуктазу, — один из ключевых ферментов фолатного цикла, расположен в позиции 1p36.3. Два наиболее распространенных полиморфизма гена MTHFR — 1298 A>C (rs1801131) и 677 C>T (rs1801133) связаны со снижением активности фермента.

Таблица 4. Частота встречаемости полиморфных аллелей генов метаболизма фолатов

При изучении распределения аллелей генов 1298 A>C MTHFR (rs1801131) и 677C>T MTHFR (rs1801133) при различных подтипах розацеа была выявлена связь между частотой встречаемости неблагоприятных аллелей этих генов и тяжестью течения заболевания. При этом неблагоприятный аллель C гена 1298 A>C MTHFR (rs1801131) и неблагоприятный аллель T гена 677C>T MTHFR (rs1801133) чаще встречались при папулопустулезном подтипе розацеа.

Однонуклеотидные замены (SNP) rs1801131 (1298A>C) и rs1801133 (677C>T) в гене MTHFR приводят к образованию термолабильной формы метилентетрагидрофолатредуктазы, снижению ее активности и, как следствие, к повышению уровня гомоцистеина в крови и снижению синтеза метионина. Гомоцистеин представляет собой серосодержащую аминокислоту, образующуюся в результате метаболизма метионина. Гомоцистеин конвертируется в метионин с участием в качестве кофакторов витамина B₁₂ и фолиевой кислоты. В метаболическом цикле синтеза гомоцистеина недостаток этих витаминсодержащих кофакторов приводит к повышению уровня гомоцистеина. Гипергомоцистеинемия связана с различной системной патологией, в том числе с сердечно-сосудистыми, цереброваскулярными и психоневрологическими заболеваниями. В ряде исследований выявлены потенциальные механизмы, с помощью которых гомоцистеин может способствовать развитию эндотелиальной дисфункции, включая активацию тромбоцитов. Многие исследования продемонстрировали повышенную частоту выявления гипергомоцистеинемии у больных с различными воспалительными заболеваниями кожи, включая акне, витилиго, псориаз и гнойный гидраденит. Накопление гомоцистеина обусловливает повреждение эндотелия сосудов. Гомоцистеин оказывает одновременно атерогенное и тромбоваскулярное действие, а также дает нейротоксический эффект. В нашем исследовании уровень гомоцистеина в крови пациентов с розацеа оказался достоверно выше (p<0,001), чем в крови условно здоровых добровольцев (см. табл. 2).

При изучении полиморфизмов генов системы гемостаза и генов фолатного цикла мы получили данные, позволяющие предположить наличие участия нарушений тромбоцитарного звена гемостаза и метаболизма фолиевой кислоты в патогенезе розацеа. Более частая встречаемость вариантов генов ITGB3: 1565 и PAI-1: –675 в основной группе свидетельствует о нарушениях у больных розацеа функции свертывающей системы, в частности агрегации тромбоцитов и фибринолитической активности, что может приводить к травматизации мелких сосудов (за счет нарушения ангиотрофической функции тромбоцитов и гиперкоагуляции). В результате при локальном воспалении развиваются нарушения микроциркуляции. Выявленные нами варианты генов метаболизма фолатов ассоциируются с повышенным уровнем гомоцистеина в крови, что также способствует травматизации эндотелия сосудов.

Розацеа относится к полиэтиологическим (мультифакторным) заболеваниям с участием в его патогенезе различных патологических механизмов. Основной причиной, обусловливающей возникновение розацеа, является генетическая предрасположенность к развитию заболевания, которая приводит к формированию лимфатической васкулопатии. Реализации наследственности способствуют различные экзогенные и эндогенные триггеры. В результате проведенного исследования выявлены гены, предположительно участвующие в механизмах развития розацеа, а также влияющие на тяжесть течения заболевания. В частности, обнаружены неблагоприятные варианты генов тромбоцитарного звена — ITGB3: 1565 T>C rs5918 и PAI-1: –675 5G>4G rs1799889, а также генов фолатного обмена — MTHFR: 1298 A>C rs1801131 и MTHFR: 677C>T rs1801133. Выявленные локусы обеспечивают специфичность воспалительных механизмов, развивающихся при розацеа, и определяют потенциальные пути терапии. Кроме того, в нашем исследовании у пациентов с розацеа выявлен повышенный уровень гомоцистеина в крови, накопление которого способствует повреждению эндотелия сосудов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.