Влияние блокады рецептора IL-7 на продукцию IFN-γ и IL-4 CD4+-клетками памяти у больных вульгарным псориазом

Рецидивирующее течение псориаза свидетельствует о наличии иммунологической памяти при данном заболевании. Впервые об этом заговорили после того, как трансплантация клинически здоровой кожи от пациентов с псориазом мышам с иммунодефицитом привела к развитию клинических и гистологических признаков заболевания у реципиентов [1]. Выявлено, что клинически здоровая кожа при псориазе характеризуется наличием персистирующего воспаления: гены, ассоциированные с функцией Т-лимфоцитов (LCK, TRCb1), и гены провоспалительных цитокинов (IL-17, IL-22, IFN-γ) остаются активными в течение более 3 мес после начала терапии ингибиторами TNF-α [2]. Установлено, что данный процесс поддерживается резидентными клетками памяти (Trm). Trm способны инициировать каскад воспалительных реакций, что приводит к развитию высыпаний в одних и тех же локализациях [3]. O. Gaide и соавт. [4] установили, что резидентные клетки памяти имеют общее происхождение с центральными клетками памяти (Tcm), что указывает на возможность репопуляции пула резидентных клеток памяти кожи за счет центральных Т-клеток памяти.

M. Diani и соавт. [3] в периферической крови больных псориазом выявили прямую корреляционную связь количества CD4⁺CCR6⁺-эффекторных клеток памяти (Tem) с величиной PASI и уровнем С-реактивного белка, а также обратную связь количества CD4⁺CXCR3⁺-эффекторных клеток памяти и CD4⁺CLA⁺-центральных клеток памяти с тяжестью заболевания. Кроме того, выявлена прямая корреляционная связь между количеством CD4⁺CCR4⁺-центральных клеток памяти и величиной PASI и обратная связь между количеством CCR5⁺-центральных клеток памяти и индексом PASI. Эти данные указывают на участие CD4⁺-центральных и CD4⁺-эффекторных клеток памяти в развитии заболевания и его рецидивов, что обусловливает необходимость исследования механизмов регуляции данных клеточных популяций при псориазе [5]. Известно, что основную роль в поддержании популяции CD4⁺-клеток памяти играют IL-7 (в большей степени) и IL-15 (в меньшей степени) [4].

Цель исследования — изучить у пациентов с псориазом влияние блокады IL-7Rα in vitro на продукцию IL-4 и IFN-γ CD4⁺-центральными и CD4⁺-эффекторными клеткам памяти.

Материалом для исследования служила гепаринизированная венозная кровь 8 условно здоровых доноров (контрольная группа, средний возраст 42,0±4,4 года) и 12 пациентов с псориазом (средний возраст 35,6±5,7 года, среднее значение PASI 21,06±5,48).

Критерии исключения из исследования: наличие в анамнезе больных онкологических, гематологических и других аутоиммунных заболеваний, прием системных иммуносупрессивных препаратов в течение 3 мес, предшествовавших проведению исследования. Все участники подписали добровольное информированное согласие о включении в исследование.

Выделение мононуклеаров (МНК) периферической крови осуществляли методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (p=1,082 г/л). Неприлипшие клетки аккуратно собирали и использовали для последующей сортировки на CD4⁺-центральные и CD4⁺-эффекторные клетки памяти. Прилипающую фракцию получали путем культивирования выделенных МНК в чашке Петри в среде RPMI-1640 (ООО «ПанЭко») с добавлением гентамицина (50 мкг/мл), тиенама (25 мкг/мл) и 10% FCS (HyClon, США), в дальнейшем ее именовали полной культуральной средой. Культивирование осуществляли в течение 1 ч во влажной атмосфере с 5% СО₂ при 37°C. Клетки прилипающей фракции собирали с поверхности чашки Петри скребком, подсчитывали цитоз в камере Горяева, затем вносили их в лунки 24-луночных планшетов (TPP, Швейцария) и культивировали в 0,5 мл полной культуральной среды с липополисахаридом (ЛПС) и без него 055:b5 (Sigma, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл. ЛПС использовали в качестве провоспалительного фактора. Время культивирования составляло 18—20 ч, после чего клетки собирали, центрифугировали и вновь вносили в те же лунки. К ним добавляли отсортированные CD4⁺-центральные или CD4⁺-эффекторные клетки памяти в присутствии и в отсутствие IL-7 и моноклональных антител к IL-7Rα, после чего сокультивировали в течение 4 сут. На 3-й день для активации продукции цитокинов к культурам добавляли форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA, 15 нг/мл; Sigma, США) и Ionomycin (2 мкг/мл; Sigma, США), а через 2 ч — блокатор внутриклеточного транспорта Brefeldin A (5 мкг/мл; BioLegend, США), затем инкубировали 20 ч для накопления цитокинов. На 4-й день клетки снимали, отмывали забуференным физиологическим раствором (PBS+EDTA), метили моноклональными антителами к поверхностным антигенам CD4, CD45RO, CCR7 (BioLegend, США). После этого их фиксировали и пермеабилизировали, используя набор Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm, США), и метили моноклональными антителами к IL-4 и IFN-γ (BioLegend, США).

Популяции CD4⁺-центральных (CD4⁺45RO⁺ CCR7⁺) и CD4⁺-эффекторных (CD4⁺45RO⁺CCR7^–) клеток памяти получали методом магнитной сортировки, используя частицы, колонки и необходимое оборудование компании Miltenyi Biotec (США). CD4⁺45RO⁺CCR7^–-клетки получали с помощью негативной магнитной сортировки, CD4⁺45RO⁺ CCR7⁺-клетки получали в 2 этапа: сначала негативной сортировкой CD4⁺45RO⁺-клеток, затем позитивной сортировкой из них CCR7⁺-клеток. Чистота сортировки для CD4⁺-центральных клеток памяти в среднем составила 84±5%, для CD4⁺-эффекторных клеток памяти — 77±6,8%. Перед сокультивированием с прилипающей фракцией отсортированные клетки окрашивали витальным красителем CFSE (4 мкМ; Molecular Probes, США), чтобы оценить пролиферативный ответ клеток на IL-7. Избыток красителя удаляли путем добавления эквивалентного объема FCS и последующей отмывки.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 6.0 с применением методов непараметрической статистики (таких как критерий Манна—Уитни, парный критерий Уилкоксона, коэффициент корреляции Пирсона). Различия между группами считали статистически значимыми при p<0,05.

Связывание моноклональных антител с IL-7Rα достоверно снижало число пролиферирующих CD4⁺-Tcm и CD4⁺-Tem клеток как в присутствии, так и в отсутствие действия провоспалительного фактора до значений, сопоставимых с клетками культуры без стимуляции, как в группе условно здоровых доноров, так и у пациентов с вульгарным псориазом (рис. 1).

Рис. 1. Пролиферация CD4⁺-центральных (а) и CD4⁺-эффекторных (б) клеток памяти периферической крови пациентов с псориазом.

Здесь и на рис. 2: контроль — культуры клеток без стимуляции IL-7, МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 — культуры клеток, стимулированые IL-7, МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 + анти-CD127 — культуры клеток, стимулированные IL-7, с добавлением моноклональных антител к α-цепи рецептора IL-7 (CD127), МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 + ЛПС — культуры клеток, стимулированные IL-7, МНК предобработаны ЛПС; IL-7 + ЛПС + анти-CD127 — культуры клеток, стимулированные IL-7, с добавлением моноклональных антител к α-цепи рецептора IL-7 (CD127), МНК предобработаны ЛПС; * — достоверное снижение пролиферации клеток по сравнению с культурами без добавления моноклональных антител к α-цепи рецептора IL-7, p<0,05.

В контрольной группе IL-7 способствовал достоверно большей продукции IFN-γ Tcm-клетками по сравнению с культурами без стимуляции IL-7. Однако блокада антителами IL-7Rα не оказывала влияния на уровень продукции IFN-γ Tcm-клетками и Tem-клетками in vitro. Достоверных различий по внутриклеточному содержанию IL-4 в обеих исследуемых субпопуляциях клеток во всех вариантах культур не выявлено. Мы ввели индекс соотношения цитокинов Th1/Th2 как частное от числа IFN-γ-позитивных клеток к числу IL-4-позитивных клеток. Блокада IL-7/IL-7Rα сигнального пути in vitro в условиях действия провоспалительного фактора способствовала снижению величины индекса Th1/Th2 в Tem-клетках относительно клеток, стимулированных IL-7. То есть в условиях воспаления in vitro воздействие антителами IL-7Rα приводило к смещению цитокинового баланса в сторону Th2 (см. таблицу).

Влияние блокады IL-7/IL-7Rα сигнального пути на продукцию IL-4 и IFN-γ CD4⁺-центральными и CD4⁺-эффекторными клетками памяти в контрольной группе и в модели воспаления invitro (медианы и интерквартильный размах — 25—75-й процентили)

Примечание. Контроль — культуры клеток без стимуляции IL-7, МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 — культуры клеток, стимулированые IL-7, МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 + анти-CD127 — культуры клеток, стимулированные IL-7, с добавлением моноклональных антител к α-цепи рецептора IL-7 (CD127), МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 + ЛПС — культуры клеток, стимулированные IL-7, МНК предобработаны ЛПС; IL-7 + ЛПС + анти-CD127 — культуры клеток, стимулированные IL-7, с добавлением моноклональных антител к α-цепи рецептора IL-7 (CD127), МНК предобработаны ЛПС. * — достоверные различия по сравнению с контролем без стимуляции IL-7 и ЛПС, p<0,05; ** — достоверные различия по сравнению с клетками, стимулированными IL-7, с предобработкой ЛПС прилипающей фракции МНК, p<0,05.

Эффекторные клетки памяти у пациентов с псориазом характеризовались достоверно меньшим внутриклеточным содержанием IFN-γ по сравнению с клетками контрольной группы. Значимых различий в продукции IL-4 CD4⁺-клетками памяти у пациентов с псориазом и у условно здоровых доноров не выявлено. При псориазе IL-7 не оказывал значимого влияния на продукцию исследуемых цитокинов. Блокада IL-7Rα в условиях действия ЛПС приводила к снижению количества эффекторных клеток памяти, продуцирующих как IFN-γ, так и IL-4, по сравнению с клетками, культивированными в условиях действия провоспалительного фактора, но без блокады сигнального пути IL-7. На центральные клетки памяти, а также на величину Th1/Th2 блокада рецептора IL-7 статистически значимого влияния не оказывала (рис. 2).

Рис. 2. Блокада α-цепи рецептора IL-7 достоверно снижает количество CD4⁺-эффекторных клеток памяти, продуцирующих IL-4 и IFN-γ, в условиях действия провоспалительных факторов.

При проведении корреляционного анализа выявлена обратная корреляционная связь между продукцией IL-4 CD4⁺-эффекторными клетками памяти и тяжестью течения псориаза (значением PASI) (рис. 3).

Рис. 3. Обратная корреляционная связь между количеством CD4⁺-эффекторных клеток памяти, продуцирующих IL-4, и значением PASI.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что блокада in vitro в течение 6 дней IL-7/IL-7Rα сигнального пути с помощью моноклональных антител к CD127 эффективно подавляет пролиферацию CD4⁺-центральных и CD4⁺-эффекторных клеток памяти у условно здоровых доноров и у пациентов с псориазом при стимуляции IL-7 как в присутствии, так и в отсутствие провоспалительного фактора. Блокада IL-7Rα препятствует связыванию IL-7 с рецептором, предотвращая димеризацию и транслокацию в ядро активатора транскрипции STAT-5, который регулирует экспрессию генов, ответственных за пролиферацию Т-клеток. Можно предположить, что связывание с CD127 увеличивает активность ингибитора клеточного цикла p27^kip1 [6], а также активирует сигнальный путь PI3K/Akt, что также снижает скорость пролиферации Т-клеток [7]. Таким образом, анти-CD127-антитела оказывают блокирующее (не активирующее) действие на рецептор IL-7. Аналогичные данные получены при исследовании действия анти-IL-Rα-антител на клетки памяти у приматов [8]. В исследовании на мышах с сахарным диабетом 1-го типа показано отсутствие влияния блокады IL-7/IL-7RΑ сигнального пути на пролиферацию Т-клеток памяти. Это объяснялось тем, что при постоянной стимуляции Т-клеток аутоантигенами невозможно снизить пролиферацию Т-лимфоцитов. При этом введение анти-CD127 пациентам с сахарным диабетом 1-го типа приводило к снижению количества CD4⁺-наивных Т-лимфоцитов, а также эффекторных и центральных клеток памяти по сравнению с группой плацебо [9].

IFN-γ — цитокин иммунного ответа по типу Th1, играет важную роль во врожденном и приобретенном иммунном ответе против вирусов, внутриклеточных микрорганизмов, а также опухолевых клеток. В здоровой коже IFN-γ способствует задержке пролиферации кератиноцитов [10]. При псориазе данный цитокин является связующим звеном между Т-лимфоцитами и кератиноцитами, усиливает миграцию Т-клеток в псориатические очаги [11]. Он индуцирует синтез антиапоптотического белка BCLx и усиливает экспрессию антиапоптотических ферментов и катепсина D в коже, что способствует усилению пролиферации кератиноцитов [12]. N.O. Kurtovic и E.K. Halilovic показали, что уровень IFN-γ в сыворотке крови у пациентов с псориазом выше, чем у здоровых доноров [13], а его содержание в псориатических очагах в 10 раз выше, чем у здоровых добровольцев [14]. Кроме того, у больных псориазом установлена прямая корреляционная связь между содержанием IFN-γ в периферической крови и значением PASI [15]. В нашем исследовании установлено достоверно более низкое количество IFN-γ-продуцирующих CD4⁺-эффекторных клеток памяти у пациентов с псориазом по сравнению с группой контроля. Можно предположить, что эффекторные клетки, продуцирующие IFN-γ при псориазе, участвуют в репопуляции резидентных клеток памяти, что обусловливает их низкое количество в периферической крови.

IL-4 способствует дифференцировке наивных Т-лимфоцитов в Th2-клетки [16]. Мы выявили обратную корреляционную связь между количеством CD4⁺-эффекторных клеток памяти, продуцирующих IL-4, и тяжестью псориаза, что свидетельствует о важной роли IL-4 в развитии псориатического воспаления. IL-4 ингибирует ассоциированные с развитием псориатических высыпаний IL-8, IL-19, β-дефензины [17], а также снижает экспрессию IL-17А [18] и продукцию IL-17F [19]. Он действует непосредственно на кератиноциты, ингибируя секрецию ими IL-1β и IL-6 в псориатических очагах [20]. S.E. Jacob и соавт. [15] показали, что содержание Th2-цитокинов (IL-10) в сыворотке крови пациентов с псориазом ниже, чем в сыворотке здоровых доноров, а уровень IL-4 и IL-5 не отличается от показателей здоровых доноров. M. Hahn и K. Ghoreschi [21] установили, что экспрессия IL-4 в коже пациентов с псориазом снижена или отсутствует. Интересно отметить, что терапия псориаза топическими аналогами витамина D₃ приводила к снижению продукции Т-клетками IL-17А и к увеличению продукции IL-4 [22], а лечение псориаза препаратом IL-4 сопровождалось снижением величины PASI на 50% и более [17]. В нашем исследовании блокада IL-7Rα не приводила к снижению количества CD4⁺-клеток памяти, продуцирующих IL-4.

Согласно полученным результатам, у пациентов с псориазом блокада IL-7Rα не приводила к сдвигу баланса Th1/Th2, что можно объяснить наличием иных механизмов регуляции. При этом в условиях действия провоспалительных факторов (ЛПС) регистрировалось снижение количества CD4⁺-Tem, продуцирующих одновременно IL-4 и IFN-γ.

Полученные данные позволяют предположить, что блокада IL-7Rα CD4⁺-клеток памяти позволит увеличить длительность ремиссии у пациентов с псориазом благодаря снижению пролиферации клеток, уменьшению количества продуцентов IL-4 и IFN-γ и отсутствию влияния на Th2-звено.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.А. Блинова, В.А. Козлов

Сбор и обработка материала: А.В. Колерова, Е.А. Блинова

Статистическая обработка данных: А.В. Колерова, Е.А. Блинова

Написание текста: А.В. Колерова

Редактирование: А.В. Колерова, Е.А. Блинова, И.Г. Сергеева

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study: E.A. Blinova, V.A. Kozlov

Collecting and interpreting the data: A.V. Kolerova, E.A. Blinova

Statistical analysis: A.V. Kolerova, E.A. Blinova

Drafting the manuscript: A.V. Kolerova

Revising the manuscript: A.V. Kolerova, E.A. Blinova, I.G. Sergeeva