Изменение экспрессии генов, участвующих в патогенезе псориатического процесса, под воздействием интерференционного тока

Псориаз — хроническое рецидивирующее заболевание кожи, обусловленное ускорением процесса пролиферации кератиноцитов и характеризующееся многообразием клинических проявлений.

Первоначально псориаз рассматривался как моногенное аутосомно-рецессивное заболевание [1, 2]. Однако в дальнейшем было выявлено, что псориаз является типичным комплексным заболеванием — мультигенным и мультифакторным с гетерогенной генетической наследуемостью. Для проявления болезни необходимо взаимодействие генов как друг с другом, так и с окружающей средой [3]. При семейном анализе и генотипировании больных псориазом было выяснено, что разные фенотипы болезни имеют разные локусы [4, 5].

Локусы, связанные с псориазом, локализованы, по крайней мере, на 8 различных хромосомах и обозначаются как PSORS (Psoriasis Sensitivity) PSORS1—PSORS9 [6]. В пределах каждой из этих областей картирован целый ряд генов-кандидатов [7].

Подобно другим аутоиммунным заболеваниям псориаз имеет строгую генетическую основу. Об этом свидетельствуют результаты семейного и близнецового анализа [3, 8, 9].

Так как данная патология обусловлена «разрегулированной» работой генетического аппарата, то эффективным методом в разработке подходов для диагностики, лечения и создания лекарственных препаратов является поиск критических звеньев патологических процессов, а именно генов-кандидатов и соответствующих белковых продуктов.

Ранее на основании результатов биоинформационного анализа было выдвинуто предположение о возможной ключевой роли белков компонентов транскрипционного фактора AP-1 в развитии псориатического процесса [10, 11].

Транскрипционный фактор АР-1 (Activating protein 1) вовлечен в регуляцию ряда важнейших процессов — морфогенетическую клеточную пролиферацию, дифференцировку, трансформацию, апоптоз, в ответ на ряд внеклеточных факторов и различных сигнальных молекул, включая ростовые и паракринные факторы, цитокины, онкогены, опухолевые промоторы, химические канцерогены, пептидные гормоны, нейротрансмиттеры [12].

Активация AP-1 происходит в экстремальных для клеток условиях: при тепловом шоке, гипоксии, в присутствии ксенобиотиков и токсинов, а также при изменении осмотического давления [13]. В свою очередь AP-1 контролирует многие десятки генов, которые вовлечены в процессы пролиферации, морфогенеза, апоптоза и дифференцировки, а также защиту клеток от повреждающих внешних воздействий. Многие из зависимых от AP-1 генов кодируют другие транскрипционные факторы, цитокины и их рецепторы, а также ферменты, отвечающие за метаболизм межклеточных сигнальных молекул. Контролируя экспрессию этих генов, AP-1 принимает участие в регуляторных процессах, необходимых для выполнения своих специфических функций клетками иммунной, эндокринной, нервной, кровеносной и других физиологических систем [14, 15].

AP-1 — общее обозначение обширной группы парных белковых комплексов с разным субъединичным составом. Образующие AP-1 мономеры входят в семейства ДНК-связывающих белков — Jun, Fos и ATF, которые относятся к подсемейству транскрипционных факторов bZIP (basic region leucine zipper).

В семейство Jun входят белки c-Jun, JunB и JunD, а также v-Jun, продукт онкогена вируса ASV17 («ju-nana» по-японски означает 17). По сравнению с другими субъединицами наибольшее число димеров AP-1 образуется при участии c-Jun, который создает стабильные парные комплексы со всеми белками семейств Jun и Fos и большинством белков семейств ATF и Maf.

В семейство Fos входят вирусный онкобелок v-Fos (Finkel osteogenic sarcoma virus) и четыре клеточных белка: c-Fos, FosB, Fra1 и Fra2 [16, 17]. Представители семейства Fos в отличие от белков семейства Jun не способны к образованию гомодимерных и гетеродимерных комплексов, состоящих только из белков этого семейства [18].

Факторы семейства ATF были выявлены как клеточные белки, имеющие участок связывания в промоторе ранних генов ряда аденовирусов. Участок связывания ATF с ДНК идентичен таковому фактора CREB (обнаружен по участию в активации зависимых от cAMP генов). Также близки и первичные структуры ATF и CREB. Семейство факторов ATF/CREB можно разделить на 6 основных групп: CREB (также входят CREM иATF-1), ATF-2 (также входит CREBP-1), ATF-3, ATF-4, ATF-6, B-ATF. Все эти белки связываются в виде димерных комплексов [19].

Показано, что Jun: Fos и Jun:ATF транскрипционные факторы являются димерными комплексами с вариабельной композицией и различной активностью и выполняют разную роль в онкогенезе [20]. Таким образом, АР-1 представляет собой гетерогенный набор димерных белков, состоящих из членов Jun, Fos и ATF семейств, с небольшими различиями в специфичности последовательностей для отдельных АР-1 димеров [21].

Гены JUNB, JUND, cJUN, cFOS, FOSL2 и ATF4 имеют наибольшее значение в патогенезе псориатического процесса, и именно по изменению их экспрессии можно судить о степени воздействия того или иного метода лечения на псориатический процесс, а также корректировать терапию в зависимости от этих изменений [11].

Существует множество способов лечения псориаза, а в последнее время в терапии ограниченных форм псориаза более широко стали применяться физиотерапевтические методы. Ввиду исключительной безопасности, отсутствия побочных эффектов, аллергических реакций возможно эффективное использование этих методов в качестве монотерапии [22].

Одним из наиболее значимых направлений физиотерапии псориаза является использование интерференционных токов, используемых в коммерчески доступном аппарате Псориамед (Физиомед). Интерференционный ток (ИФТ) представляет собой наиболее простой тип амплитудно-модулируемого переменного тока. Он обычно генерируется при совмещении («интерференции») двух гармонических колебаний токов с различной (слабо различающейся) частотой, чаще всего около 4 кГц. Благодаря низкому волновому сопротивлению кожи в диапазоне кГц, ИФТ не вызывают повреждения кожи в виде ожога или перегревания. Механизм действия интерференционными токами обусловливается активацией процесса вторичной опосредованной передачи сигнала в клетках. Под воздействием интерференционных токов увеличивается концентрация циклического АМФ и, соответственно, соотношение цАМФ/цГМФ [14]. В клетках, пораженных псориазом, концентрация цАМФ и отношение цАМФ/цГМФ молекул уменьшены; исходя из этого повышение концентрации цАМФ или воздействие на отношение цАМФ/цГМФ (относительно нормальных значений на участке со здоровой кожей) в процессе процедуры может способствовать исчезновению псориатической гиперпролиферации. Следует отметить, что эффект воздействия интерференционными токами проявляется еще в стимуляции микроциркуляции, а также изменения уровня интерлейкинов [23, 24].

Специальные интерференционные токи преодолевают защитный барьер кожи, не раздражая и не повреждая ее, и воздействуют на пораженные участки. Выраженный антипсориатический эффект достигается благодаря нормализации процесса сегментации (при чрезмерной пролиферации), а также противовоспалительному и противоотечному эффектам. Механизм развития ответа при воздействии интерференционных токов на клеточную мембрану можно представить в виде схемы (рис. 1) [23, 25].

Воздействие стимулирующими токами проводится либо под водой, либо при помощи специальных электродов.

Пациентам проводили лечение с помощью аппарата воздействия интерференционными токами Псориамед. Каждому пациенту было предоставлено индивидуальное оборудование и были даны инструкции по проведению лечения: 2 раза в день по 5 мин утром и вечером. Обе процедуры должны были проводиться с интервалом не менее 8 ч. Для определения эффективности терапии до и после лечения у пациентов исследовали биоптаты кожи с участков, подвергшихся воздействию интерференционными токами. Все пациенты прошли стандартное обучение по использованию предоставленного оборудования.

Аппарат применяли в группе из 10 пациентов мужского пола в возрасте от 22 до 60 лет с диагнозом вульгарный бляшечный псориаз. Длительность заболевания варьировала от 2 мес до 35 лет. Площадь поражения кожи составляла от 8 до 20%. В данной группе местная и системная терапии, включая УФ-воздействие, были прекращены за месяц до начала терапии. Тяжесть псориаза оценивали по шкале PASI и отдельно по 4-балльной шкале — субъективные ощущения (зуд, боль, чувство напряженности). В течение всего срока лечения пациентам проводили стандартную терапию псориаза с использованием дезинтоксикационных и успокоительных препаратов, местную терапию не назначали. Максимальная длительность терапии составляла 3 мес.

Забор биоптатов кожи из пораженного участка больного псориазом проводили под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника. Образцы пораженной кожи быстро замораживали в жидком азоте. Время от начала процедуры забора биоптатов до замораживания не превышало 15 с.

РНК выделяли с использованием китов компании Qiagen. Для контроля отсутствия примеси ДНК в образце РНК использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на фрагмент гена JUND без обратной транскрипции.

Для контроля выделения РНК и обратной транскрипции, а также нормализации количества РНК в образцах проводили ПЦР с праймерами на «ген домашнего хозяйства» GAPDH.

ПЦР проводили в реальном времени (Real-Time PCR, ПЦР-РВ) с использованием меченных флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, в частности TaqMan и Beacon. Праймеры и пробы были произведены фирмой «ДНК-Синтез». Амплификацию проводили в ПЦР-амплификаторе (Bio-Rad, iQ4), используя программу «two step» или «three step». Концентрацию плазмиды измеряли на спектрофотометре Eppendorf.

Экспрессию генов-мишеней нормализовали на ген домашнего хозяйства GAPDH. График представлен на рис. 2.

В качестве стандартов использовали серию из 4 десятикратных разбавлений.

Для учета результатов использовали данные реакции со следующими параметрами:

— эффективность ПЦР не менее 95%;

— коэффициент корреляции не менее 0,9;

— наклон кривой (slope) –3,4±0,2.

Для подтверждения статистической достоверности данных ПЦР в реальном времени использовали метод 2^-ΔΔCT [26].

Максимальное значение индекса PASI в данной группе до начала лечения составило 11,4, минимальное — 1,8. После завершения лечения у всех пациентов наблюдалась полная ремиссия. Максимальный срок лечения составил 2 мес (6 человек), минимальный — 1 мес (4 человека). Данные по снижению индекса PASI и субъективных ощущений представлены в табл. 1 и 2.

Анализ уровней экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора AP1. На рис. 3

Видно, что экспрессия генов в пораженной коже больных до лечения интерференционными токами уменьшена в несколько раз.

После лечения интерференционными токами уровень экспрессии у разных пациентов изменяется по-разному: у одних уровень экспрессии генов приближается к норме, т.е. к уровню в непораженной коже, у других значительно увеличивается по отношению к норме, а у отдельных пациентов лишь незначительно изменяется.

На рис. 4 и 5

У пациента № 10 уровень экспрессии почти всех генов в пораженной коже по сравнению с непораженной до лечения интерференционными токами был понижен в 10 раз. Исключение составил ген FOSL2, уровень экспрессии которого был понижен в 1,5 раза. Однако после лечения уровень экспрессии всех генов в пораженной части кожи значительно повысился по отношению к непораженным участкам кожи от 1,5 до 10 раз.

В пробах кожи пациента № 4, затронутой псориазом, экспрессия всех анализированных генов была понижена, особенно ярко это наблюдалось на уровне транскрипции генов cFOS, JUND. Лечение привело к повышению уровню экспрессии, но только экспрессия гена JUND в пробах кожи, затронутой псориазом, осталась пониженной в сравнении с уровнем экспрессии в пробах, не подвергавшихся видимому поражению. Уровень экспрессии остальных исследуемых генов оказался выше уровня экспрессии их в пробах кожи, не затронутой видимой патологической деформацией. При этом экспрессия гена ATF4 стала выше точки отсчета в 11 раз, а гена FOSL2 — в 8 раз.

Результаты исследования показали, что уровень экспрессии изучаемых генов в пораженной псориазом коже стабильно отличается от уровня экспрессии в непораженной коже как до лечения интерференционными токами, так и после него. Показано также изменение уровня экспрессии в сторону увеличения в пораженной псориазом коже после лечения по отношению к уровню экспрессии в пораженной коже до лечения, что полностью соответствовало клиническим результатам лечения. Полученные результаты могут свидетельствовать об эффективности применения интерференционных токов при псориатическом поражении кожи.