Введение

Сердечно-сосудистые заболевания, возникшие в результате атеросклероза, в том числе ишемическая болезнь сердца (ИБС) и цереброваскулярная болезнь (ЦВБ), являются ведущими причинами заболеваемости и смертности в развитых и развивающихся странах, на которые приходится значительная часть расходов систем здравоохранения.

Согласно общепринятой концепции атеросклероз представляет собой многофакторный патологический процесс, в основе которого лежат повреждение сосудистой стенки и накопление продуктов окисления липидов [1]. Активация макрофагов запускает процесс сосудистого воспаления [2], происходит формирование фиброзной капсулы атеросклеротической бляшки за счет пролиферации гладкомышечных клеток артерий, что обеспечивает ее стабильность [3]. Участки сосудистого повреждения в рамках атеросклероза прогрессируют со временем, противовоспалительный процесс переключается на воспалительный, что приводит к дестабилизации атеросклеротической бляшки [4]. Различные факторы риска, такие как курение, ожирение, гиперхолестеринемия, генетическая предрасположенность, недостаточный уровень синтеза эндотелиального оксида азота (NO), сахарный диабет ведут к проградиентному развитию атеросклероза [5].

Основным способом понижения риска неблагоприятных сердечно-сосудистых событий при атеросклерозе является модификация факторов риска в первичной профилактике — контроль артериального давления, гиперлипидемии, борьба с курением и ожирением. Активно разрабатываются новые подходы к лечению и новые мишени для терапии, в том числе воздействие на воспалительный процесс. Так, в качестве потенциальных терапевтических агентов рассматривают колхицин [6], агонисты рецепторов интерлейкина-1 (анакинра) [7].

Одно из потенциально значимых направлений поиска новых терапевтических мишеней в лечении атеросклероза — изучение роли регуляторных РНК. Микро-РНК представляют группу эндогенных некодирующих РНК, способных регулировать экспрессию генов.

С момента открытия микро-РНК их роли в патогенезе различных заболеваний было посвящено большое количество исследований [8, 9]. Особенностью молекул микро-РНК является их относительная стабильность в циркулирующей крови и морфологическом материале [10]. В настоящее время опубликован ряд работ, посвященных циркулирующим микро-РНК и их роли в формировании стабильных атеросклеротических бляшек, анализу уровней циркулирующих микро-РНК у пациентов с коронарной болезнью при различной степени риска сердечно-сосудистых осложнений [11]. Однако ввиду сложности исследований работы по анализу микро-РНК в образцах атеросклеротических бляшек, полученных в ходе хирургического вмешательства, представлены в небольшом количестве.

Цель настоящего исследования — изучение экспрессии ряда микро-РНК (miRNAlet7a, miRNA21, miRNA92, miRNA221) в гистологических срезах пораженных атеросклерозом коронарных и сонных артерий. Выбор указанных микро-РНК обусловлен наличием исследований, отражающих их участие в процессах сосудистого воспаления, апоптоза, связью с увеличением уровня липопротеинов очень низкой плотности, снижением эндотелиального синтеза оксида азота и других процессов, приводящих к нарушению эндотелиальной функции и запускающих атеросклеротическое поражение.

Материал и методы

Исследование выполнено на базе Университетской клинической больницы №1 Первого Московского государственного университета им И.М. Сеченова на основании анализа операционного материала сонных и коронарных артерий у пациентов со значимым атеросклеротическим поражением.

В основную группу были включены пациенты с эндартерэктомией из коронарных артерий во время аортокоронарного и маммарокоронарного шунтирования (n=6) и пациенты с произведенной каротидной эндартерэктомией (n=5), у которых во время оперативного вмешательства иссекали фрагмент артерии с бляшкой для последующего гистологического исследования.

Группа контроля сформирована из аутопсийного материала коронарных артерий, собранного от 6 пациентов с атеросклерозом, умерших от несердечных причин.

Далее было проведено гистологическое и молекулярно-генетическое исследование микро-РНК методом гибридизации in situ с помощью LNA зондов. Материал фиксировали нейтральным формалином с буфером, изготавливали парафиновые блоки, делали серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм, которые далее окрашивали гематоксилином и эозином, а неокрашенные срезы использовали для исследования экспрессии микро-РНК методом полимеразной цепной реакции in situ.

Была проведена сравнительная характеристика экспрессии. Срезы образцов ткани толщиной 4 мкм, фиксированных формалином и залитых парафином, депарафинизировали в ксилоле по 5 мин дважды и гидратировали в 100, 95 и 80% этаноле. Затем их промывали в дистиллированной воде. Антигенную демаскировку проводили с помощью 20-минутной температурной обработки при 90 °C в буферном растворе трис-ЭДТА (pH 9,0). На этапе гибридизации использовали меченые биотином зонды LNA 20 нмоль/мкл для обнаружения miRNA21, miRNA92, miRNA221 и miRNAlet7a, а также буфер miRNA ISH (кат. N.339450, Qiagen). Для отрицательного контроля не добавляли зонд в смесь для гибридизации. Срезы тканей покрывали 100 мкл смеси для гибридизации и покровным стеклом, помещали в гибридизатор. Реакцию гибридизации проводили в течение 18 ч при 37n °C. Затем препараты промывали в стеклянной банке Коплина, содержащей 50 мл 2xSSC (раствор цитрата натрия) при 57 °C в течение 2 мин, в 50 мл 2xSSC при комнатной температуре в течение 5 мин, в 50 мл 0,2xSSC при 37 °C в течение 10 мин и в 50 мл 0,2xSSC при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем срезы промывали фосфатно-солевым буфером PBST при комнатной температуре в течение 5 мин. Для выявления LNA зондов, связавшихся с микро-РНК, применяли авидин/биотиновую систему (набор VECTASTAIN ELITE ABC-HRP, PK-6100, VectorLaboratories), окрашивание диаминобензидином (DAB) и контрастирование гематоксилином. После проведенных реакций срезы заключили в канадский бальзам и исследовали на световом микроскопе.

К признакам нестабильности атеросклеротической бляшки отнесли наличие крупного липидного ядра, эксцентрично расположенного, представленного атеронекротическим детритом с большим содержанием липидов, кристаллов холестерина и скоплением пенистых клеток по периферии. Фиброзная бляшка истончена и изъязвлена, инфильтрирована воспалительными клетками (макрофаги и Т-лимфоциты), представлена тонкими коллагеновыми волокнами с нарушенной архитектоникой. К признакам нестабильности также относятся видимые зоны некроза коллагеновых волокон, окруженные большим количеством пенистых клеток, и участки обызвествления. Периферические и центральные разрывы покрышек, которые сочетаются с выходом атероматозных масс в просвет артерии, пристеночным или обтурирующим тромбозом коронарных артерий и кровоизлиянием в подлежащие структуры, также характерны для нестабильных бляшек. Стабильные атеросклеротические бляшки (САБ) характеризовались небольшим скоплением атероматозных масс (липидно-белкового детрита или липидного ядра), окруженного соединительной тканью, богатой коллагеновыми и эластическими волокнами, которые формируют каркас атеросклеротической бляшки. САБ имеет ровную и гладкую покрышку и плотно прилежит к клеточной стенке без ее истончения на всем протяжении бляшки.

В исследовании были изучены коронарные и сонные артерии. Коронарные артерии относятся к артериям мышечного типа и имеют соответствующее гистологическое строение: внутренняя эластическая мембрана развита, средняя оболочка содержит 10—40 плотно упакованных слоев гладких мышечных клеток. Каротидные артерии относятся к артериям эластического типа, их особенность в том, что толщина стенки артерий составляет примерно 15% диаметра их просвета. Внутренняя оболочка представлена эндотелием и подэндотелиальным слоем.

Был проведен сравнительный анализ экспрессии исследуемых микро-РНК в каротидных и коронарных бляшках. Также проводили оценку ассоциаций микро-РНК со стабильностью или нестабильностью атеросклеротической бляшки.

Для оценки экспрессии микро-РНК в тканях была выработана полуколичественная шкала: 1 балл — около 5% окрашенных клеток (эндотелий, макрофаги, гладкомышечные клетки), 0,5 балла — 2%, 0,1 балл — единичные окрашенные клетки (менее 1%).

Для сравнения экспрессии микро-РНК в коронарных и каротидных артериях использовали U-критерий Манна—Уитни. В качестве зависимой переменной рассматривали артериальную локализацию, а независимых переменных — уровни экспрессии различных видов микро-РНК в эндотелии, гладких мышечных клетках (ГМК) и макрофагах (МФ). Для каждой пары микро-РНК/тип клетки у каждого исследуемого пациента были определен процент окрашенных клеток, и в зависимости от него проставлено значение по следующему правилу: 10% окрашенных клеток — 1 балл, от 1 до 5% — 0,5 балла, менее 1% окрашенных клеток — 0,1 балл.

Результаты

В исследование включены 17 человек — 11 больных в основной группе и 6 в группе контроля. В контрольной группе рассматривали стабильные клинически незначимые атеросклеротические бляшки, забранные в процессе аутопсии. Критерии, характеризующие основную группу пациентов, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Характеристики пациентов

Примечание. ИБС — ишемическая болезнь сердца, ПИКС — постинфарктный кардиосклероз, ОНМК — острое нарушение мозгового кровообращения, ПКА — правая коронарная артерия, ПМЖВ — передняя межжелудочковая ветвь, ТИА — транзиторная ишемическая атака, ОВ — огибающая ветвь, ИМА — интермедиарная артерия, ВТК — ветвь тупого края.

На первом этапе проводили гистологический анализ экспрессии miRNA21, miRNA92, miRNA221 и miRNAlet7 в каротидных и коронарных бляшках.

В результате оценки характеристик атеросклеротического поражения в препаратах коронарных артерий (n=4) были описаны атеросклеротические бляшки с признаками нестабильности, в одном препарате — САБ. В препаратах сонных артерий в двух образцах были описаны стабильные бляшки, в четырех — нестабильные (рис. 1, 2 см. на цв. вклейке). При оценке морфологии сосудов из контрольных образцов (n=6) были выявлены только САБ различного размера, имеющие липидные ядра, цельные, без кальцинатов, в окружении правильно ориентированных эластических и коллагеновых волокон. Корреляций морфологического строения стабильных и нестабильных атеросклеротических бляшек с полом, возрастом и типом сосуда не выявлено.

Рис. 1. Анализ микроРНК.

а — микроРНК 21 в атеросклеротических бляшках каротидных и коронарных артерий (иммунопероксидазная реакция), ×400, окраска гематоксилином и эозином; б — микроРНК 92, ×400, окраска гематоксилином и эозином; в — микроРНК 92 в атеросклеротических бляшках каротидных и коронарных артерий (иммунопероксидазная реакция), ×400, окраска гематоксилином и эозином; г — микроРНК 92 в атеросклеротических бляшках каротидных и коронарных артерий (иммунопероксидазная реакция), ×100, окраска гематоксилином и эозином; д — микроРНК 221 в атеросклеротических бляшках каротидных и коронарных артерий (иммунопероксидазная реакция), ×400, окраска гематоксилином и эозином; е — микроРНК let 7 в эндотелии атеросклеротических бляшек каротидных и коронарных артерий (иммунопероксидазная реакция), окраска гематоксилином и эозином; ж — группа контроля, отсутствие экспрессии микроРНК (нет окрашивания), окраска гематоксилином и эозином; з — микроРНК 21 в атеросклеротических бляшках каротидных и коронарных артерий (иммунопероксидазная реакция), ×400, окраска гематоксилином и эозином.

Рис. 2. Гистологический анализ нестабильных бляшек. Окраска гемотоксилином и эозином.

На следующем этапе был проведен анализ ассоциаций экспрессии miRNA21, miRNA92, miRNA221 и miRNAlet7 в атеросклеротических бляшках с признаками стабильности и нестабильности, в том числе в зависимости от локализации в каротидных или коронарных артериях. Выявлено наличие miRNAlet7a у 9 пациентов основной группы. Экспрессии miRNAlet7a у пациентов группы контроля не было. Экспрессия miRNA21 обнаружена у 8 пациентов. В группе контроля miRNA21 отсутствует.

Экспрессия miRNA92 выявлена у 8 пациентов основной группы. В группе контроля экспрессии miRNA92 не выявлено. Экспрессия miRNA221 обнаружена у 8 пациентов основной группы, в группе контроля экспрессии miRNA92 не было. В табл. 2 представлена экспрессия анализируемых микро-РНК у группы контроля и пациентов с атеросклеротическими бляшками коронарных и каротидных артерий.

Таблица 2. Характеристики пациентов основной группы

Примечание. КА — коронарная артерия, ИБС — ишемическая болезнь сердца, ПИКС — постинфарктный кардиосклероз, ГБ — гипертоническая болезнь, ОНМК — острое нарушение мозгового кровообращения, ПКА — правая коронарная артерия, АКШ — аортокоронарное шунтирование, ПМЖВ — передняя межжелудочковая ветвь, ОВ — огибающая ветвь, ЧКВ — чрескожное коронарное вмешательство.

При сравнении экспрессии в коронарных и каротидных бляшках, а также в группе контроля были получены следующие данные: экспрессия miRNAlet7a наблюдалась в 80% (n=4) препаратов каротидных бляшек. В случае коронарных бляшек экспрессия miRNAlet7a была выявлена в 83% (n=5) препаратов. Экспрессия miRNA21 обнаружена в 80% (n=4) препаратов каротидных бляшек, тогда как в коронарных бляшках экспрессия miRNA21 составила 67% (n=4). Экспрессия miRNA92 выявлена в 4 (80%) образцах каротидных бляшек. В образцах коронарных бляшек miRNA92 обнаружена в 67% случаях (n=4). miRNA221 был найден в 80% (n=4) образцов каротидных бляшек и 67% (n=4) образцов коронарных бляшек. В группе контроля экспрессии изучаемых нами микро-РНК не выявлено.

На следующем этапе были сопоставлены стабильные и нестабильные бляшки при объединении каротидных и коронарных образцов. Экспрессия miRNAlet7a выявлена в 8 нестабильных бляшках и 1 стабильной бляшке. miRNA21 экспрессировалась во всех образцах нестабильных бляшках каротидных и коронарных артерий, в стабильных бляшках отсутствовала. Наличие экспрессии miRNA92 и miRNA221 также наблюдалось во всех образцах нестабильных бляшек, а экспрессия в стабильных бляшках отсутствовала.

Для проверки взаимосвязи экспрессии нескольких видов микро-РНК в различных клетках с локализацией в артериях была рассчитана разница в средней окрашенности клеток между группами с коронарной и каротидной локализацией бляшек для каждой пары микро-РНК/тип клетки.

На основании теста Манна—Уитни было выяснено, что для экспрессии miRNA221 в гладкомышечных клетках рассчитанное значение статистики больше критического значения при уровне значимости <0,05. Это показывает значимую взаимосвязь между экспрессией miRNA221 в гладкомышечных клетках и локализацией бляшек в коронарных артериях. В бляшках коронарных артерий выявлено достоверно более выраженное окрашивание miRNA221 в гладкомышечных клетках по сравнению с каротидными артериями (p<0,05) (рис. 3). В то же время медиана окрашенности препаратов гладкомышечных коронарных и каротидных артерий значимо не отличалась для остальных микро-РНК и составила 0,5.

Рис. 3. Сравнение экспрессии miRNAlet7a, miRNA21, miRNA92, miRNA221 каротидных и коронарных бляшек в основной группе (а) и экспрессии miRNAlet7a, miRNA21, miRNA92, miRNA22 в группах стабильных и нестабильных бляшек (б).

Также была выявлена закономерность экспрессии всех анализируемых микро-РНК только в нестабильных бляшках. Медиана окрашенности препаратов гладкомышечных клеток коронарных и каротидных артерий значимо не отличалась для остальных микро-РНК и составила 0,5.

Обсуждение

Ряд работ продемонстрировал роль miR-92a-3p в активации воспаления, пролиферации и регенерации эндотелиальных клеток во время атерогенеза [12]. Микро-РНК 21, 92a совместно с макрофагами опосредуют процессы хронического воспаления в атеросклеротических повреждениях сосудов, переключая противовоспалительные каскады на провоспалительные [13]. Микро-РНК 21 запускает пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток, активируя сигнальные пути протеинкиназы B [14, 15] и киназ, регулируемых внеклеточными сигналами Akt/ERK, и усугубляет атеросклероз [16]. Микро-РНК 92 также влияет на функцию гладкомышечных клеток через связывание с KLF4, что может иметь приложение в диагностике и лечении при сосудистых рестенозах, атеросклеротическом повреждении и других пролиферативных сосудистых заболеваниях [16].

Апоптоз, опосредованный микро-РНК, сопровождается воспалительной инфильтрацией и ведет к формированию неоинтимы [17]. Такие изменения эндотелиального слоя ведут к нарушению стабильности бляшки и могут быть ассоциированы с дальнейшими клиническими осложнениями [18]. Показана роль микро-РНК семейства let-7 miRNA в регулировании воспалительного процесса и апоптоза. Усиленная экспрессия let-7c повышала апоптоз эндотелиальных клеток, когда ингибирование микро-РНК let-7c снижало гибель клеток путем апоптоза с участием липопротеинов очень низкой плотности [19]. Однако в некоторых работах отмечалось, что уровни микро-РНК let-7 снижались в каротидных бляшках у больных сахарным диабетом 2 типа [20]. Опубликованы также сведения, показывающие, что снижение уровня микро-РНК группы let‐7 снижает апоптоз в эндотелиальных клетках аорты [21]. Таким образом, можно предположить, что выявление экспрессии let-7а указывает на активацию процессов апоптоза.

Экспрессия miR-221-p значительно повышается в мононуклеарных клетках и тромбоцитах у пациентов с инфарктом миокарда без подъема сегмента ST, в то время как у пациентов с инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST уровень микро-РНК 221 остается неизменным [22].

Отмечают, что микро-РНК могут участвовать в развитии нарушений метаболизма и способствовать формированию метаболического синдрома, возникновение которого также может сопровождаться сигнальными путями с участием тех же микро-РНК [23]. Изменения уровней микро-РНК 122-5p, 126, 197 и других ассоциированы с основными неблагоприятными сердечно-сосудистыми событиями у пациентов с ИБС [24, 25]. Исследование M. Parahuleva и соавт. [21] с использованием микрочипов и биоинформационного анализа показало, что экспрессия микро-РНК 21, 92 и let‐7 более выражена у пациентов с атеросклерозом, что в очередной раз подчеркивает потенциал микро-РНК как маркеров диагностики атеросклероза в будущем.

Микро-РНК 21 задают пролиферацию гладкомышечных клеток [26, 27], что может нарушать стабильность атеросклеротической бляшки. К примеру, фармакологические и генетические ингибиторы miR-21 снижают формирование неоинтимы в венозных трансплантатах и участках поврежденного баллоном эндотелия каротидных артерий [26]. Эти наблюдения способствовали разработке покрытия стентов ингибиторами микро-РНК 21 [27]. Тем не менее, некоторые авторы показывают, что пролиферация гладкомышечных клеток может также стабилизировать атеросклеротическую бляшку. К примеру, пролиферативные эффекты микро-РНК 21, моделируемые в гладкомышечных клетках, снижают риск формирования аневризмы брюшного отдела аорты [27].

Согласно наблюдениям J. Koroleva и соавт. [27] экспрессия микро-РНК 221 снижается в нестабильной атеросклеротической бляшке сонной артерии непосредственно во время надрыва.

Свидетельств, показывающих влияние miRNAlet7a и miRNAl92 на стабильность атеросклеротической бляшки, недостаточно.

Ограничения исследования

Настоящее исследование проводили на небольшой выборке, что является типичным для пилотных исследований микро-РНК. Результаты требуют валидизации на более крупной выборке пациентов.

Заключение

По данным исследования выявлена повышенная экспрессия ряда микро-РНК в нестабильных атеросклеротических бляшках как при коронарном, так и при каротидном атеросклерозе. Однако экспрессия микро-РНК 221 характерна преимущественно для коронарного поражения, что может служить дополнительным маркером, обусловливающим значимость вмешательства в коронарном русле.

Благодарность

Данная работа была выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственной поддержки создания и развития исследовательских центров мирового уровня «Цифровой биодизайн и персонализированное здравоохранение» №075-15-2022-304.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.