Введение

Сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (СНсФВ) — тяжелое социально значимое хроническое заболевание с неблагоприятным прогнозом. Широкая распространенность СНсФВ и отсутствие эффективных методов лечения диктуют необходимость анализа патогенеза заболевания и разработки новых подходов к его лечению [1]. Проявления СНсФВ крайне гетерогенны, и на сегодняшний день ни одна из животных моделей не способна в полной мере воспроизвести патофизиологическое многообразие заболевания у человека и, как правило, учитывает только один из его аспектов. Обычно при разработке животных моделей СНсФВ акцент делается на воссоздание какого-либо одного патогенетического механизма (например, СНсФВ на фоне метаболического синдрома, гипертонической природы, а также как результат ускоренного старения), что затрудняет имитацию многочисленных сопутствующих заболеваний, связанных с СНсФВ [2].

Метаболические нарушения и пожилой возраст — основные факторы риска СНсФВ. Из доступных в РФ моделей СНсФВ мыши db/db считаются одной из наиболее адекватных моделей кардиометаболических нарушений. Мутация в гене, кодирующем длинную изоформу лептинового рецептора, приводит к нарушению лептинового сигналинга в гипоталамусе и, как следствие, к гиперфагии и ожирению [3]. В возрасте 6—8 недель у таких мышей на фоне ожирения развиваются и прогрессируют гипергликемия и гиперинсулинемия [2]. Фенотип включает метаболические нарушения (инсулинорезистентность, гипергликемия, дислипидемия), артериальную гипертензию с развитием гипертрофии миокарда и диастолической дисфункции левого желудочка (ЛЖ), увеличение левого предсердия, которые манифестируют у таких мышей уже в молодом возрасте [4, 5]. Гистологический анализ ткани сердца продемонстрировал гипертрофию кардиомиоцитов и выраженный интерстициальный и периваскулярный фиброз с увеличением содержания коллагена, что характерно для миокарда пациентов с СНсФВ [6, 7].

Ключевым патогенетическим звеном в развитии СНсФВ является хронический воспалительный процесс с привлечением и активацией иммунных клеток, что в конечном итоге приводит к фиброзу и потере эластических свойств миокарда. Одним из ранних событий в развитии СНсФВ является повышение выработки клетками миокарда хемотаксических цитокинов, в частности, моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1), и рекрутирование моноцитов из кровотока. Доказано, что подавление активности МСР-1 предупреждает ремоделирование миокарда ЛЖ и развитие сердечной недостаточности [8]. В НМИЦ кардиологии имени академика Е.И. Чазова ранее был разработан противовоспалительный препарат «Инграмон», представляющий собой 12-членный пептидный фрагмент (65—76) МСР-1 человека и являющийся его антагонистом. Проведены доклинические и клинические исследования препарата, показавшие его безопасность и эффективность у животных и человека [9]. С целью получения препарата с пролонгированным действием, приемлемого для лечения пациентов в амбулаторных условиях (в виде формы для подкожного или внутримышечного введения с медленным высвобождением препарата из депо), Инграмон был заключен в микрокапсулы из биоразлагаемого полимера [10].

Цель исследования — изучить структурно-функциональные характеристики миокарда мышей с ожирением db/db разного возраста и оценить влияние противовоспалительного препарата «Инграмон-депо» на состояние миокарда ЛЖ.

Материалы и методы

Исследование выполнено в соответствии с правилами Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Strasbourg, 18.III.1986) и ГОСТ Р 53434—2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Протокол исследования до начала работы (закупки животных) был одобрен комиссией по биоэтике, созданной на базе НИИЭК ФГБУ «НМИЦК имени академика Е.И. Чазова (решение комиссии от 21.02.24, рег.номер ЛКИ/13.02.24).

Мыши линии С57bl/6 были предоставлены биоклиникой ФГБУ «НМИЦК имени академика Е.И. Чазова» МЗ РФ, BKS.CgDock7m+/+LeprdbJ (db/db) получены из SPF-вивария ИЦиГ СО РАН.

Мышам db/db с 4-х месяцев подкожно 1 раз в 2 недели вводили Инграмон-депо, 30 мг/кг (1200 мкг/мышь) — опытная группа (8 самок и 8 самцов) или плацебо — группа контроля (8 самок и 8 самцов).

Трансторакальную эхокардиографию (ЭхоКГ) выполняли на аппарате VEVO1100 (Visualsonics, Toronto, Canada), оснащенном линейным датчиком с частотой 30 Мгц с максимальной глубиной лоцирования 13 мм с частотой кадров 235 в секунду. Наркотизированных животных (смесь тилетамина/золазепама 40 мкг/кг и ксилазина гидрохлорида 5 мг/кг, в/б) фиксировали в положении на спине. Исследование выполняли при ЧСС 330—390 уд/мин. Левую половину грудной клетки (область контакта датчика с телом животного) освобождали от волосяного покрова с помощью депиляционного крема. Поверхность тела животного обрабатывали гелем для ультразвукового исследования. Измерения производили в условиях закрытой грудной клетки и спонтанного дыхания по общепринятым методикам в одномерном М- и двухмерном В-модальных режимах [11]. Относительную толщину стенок (ОТС) рассчитывали как:

,

где ОТС — относительная толщина стенок, КДР ЛЖ — конечно-диастолический размер левого желудочка, ТМЖП — толщина межжелудочковой перегородки, ТЗС — толщина задней стенки левого желудочка.

Масса миокарда ЛЖ (ММ ЛЖ) и ее индекс (к весу тела) (иММ ЛЖ) рассчитывалась по следующей формуле:

ММ ЛЖ=1,05·[(ТМЖП+КДР ЛЖ+ТЗС ЛЖ)³—(КДР ЛЖ)³],

где ММ ЛЖ (г) — масса миокарда левого желудочка, КДР — конечно-диастолический размер левого желудочка, ТМЖП — толщина межжелудочковой перегородки, ТЗС — толщина задней стенки левого желудочка; коэффициент 1,05 отражает специфическую плотность миокарда ЛЖ (кубическая формула).

Диастолическую функцию ЛЖ оценивали по измерению скоростей допплеровского спектра трансмитрального диастолического потока (Е, А) в импульсно-волновом допплеровском режиме. Миокардиальный индекс (индекс Tei, или индекс производительности миокарда ЛЖ, —эхокардиографический показатель относительной количественной оценки систолической и диастолической функции ЛЖ) измеряли по графику допплеровского спектра трансмитрального диастолического и трансаортального систолического потоков по формулам:

,

где ВИВС — время изоволюмического сокращения, ВИВР — время изоволюмического расслабления.

Оценку эхокардиографических показателей проводили, как минимум, по трем последовательным сердечным циклам. Все измерения выполняли в соответствии с рекомендациями по оценке физиологии сердца у мышей [12].

У всех животных после эвтаназии углекислым газом сердца были извлечены, разрезаны на несколько кусочков и зафиксированы 10% раствором забуференного формалина или заморожены в жидком азоте. Гистологический анализ миокарда ЛЖ проводили на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином-эозином и трихромом по Массону. Подсчет некротизированных клеток проводили на трех гистологических срезах каждого сердца (с шагом в 1—1,5 мм от верхушки сердца), окрашенных гематоксилин-эозином. Количество пораженной ткани оценивали (в %). Криостатные срезы миокарда ЛЖ окрашивали кроличьими поликлональными антителами DF2789 (Affinity, Китай) против антигена макрофагов F4/80. Для визуализации использовали антитела козы к иммуноглобулинам кролика, меченые Cy5 (Servicebio, Китай). Подсчет количества макрофагов на 1 мм² ткани ЛЖ проводили на трех гистологических срезах каждого сердца.

Статистическая обработка данных выполнялась с применением программного пакета MedCalc 20.104. Для описательной статистики количественных переменных использовались медиана и 25й—75й перцентили, для качественных — частота и доля (в %). Для количественных независимых переменных сравнение осуществлялось при помощи критерия Краскелла—Уоллиса для множественных сравнений и U-критерия Манна—Уитни для двух категорий. Для парных независимых сравнений после применения критерия Краскела—Уоллиса применялся тест Данна. Для количественных зависимых переменных применялся W-критерий Уилкоксона для двух категорий. Для сравнения частотных показателей между группами применялся критерий χ² для множественных категорий и критерий Фишера для двух групп. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Исследование проводили мышам db/db в возрасте 4-х (n=4), 6-ти (n=8), 8-ми (n=8) и 12-ти мес (n=5), мышам C57bl/6 — в возрасте 3-х (n=6) и 12-ти (n=9) мес. С возрастом вес мышей C57bl/6 постепенно увеличивался (рис. 1).

Рис. 1. Динамика веса мышей линий C57bl/6 и db/db.

* — p<0,05. Данные представлены как медиана и межквартильный размах.

Мыши db/db уже с 4 мес весили в 2 раза больше, чем мыши C57bl/6, и достигали максимального веса к 6-му мес жизни; далее существенной динамики веса у db/db-мышей с возрастом не отмечено. Сравнительная динамика веса в зависимости от пола у мышей db/db показала значимый прирост веса у самок, в то время как у самцов существенной возрастной динамики веса не наблюдалось (рис. 2).

Рис. 2. Динамика веса мышей db/db в зависимости от пола.

Данные представлены как медиана и межквартильный размах.

При анализе структурных параметров сердца у мышей обеих линий по данным ЭхоКГ (табл. 1) были получены следующие результаты. У мышей линии C57bl/6 зарегистрировано увеличение передне-заднего размера левого предсердия к 12 мес без существенных изменений его индексированного размера. При исходно большем размере левого предсердия у db/db-мышей в 4 мес дальнейших возрастных изменений этого параметра не отмечено; индексированный на вес мыши размер левого предсердия был больше у db/db-мышей в 12 мес, по сравнению с 6- и 8-месячными. У C57bl/6 и db/db-мышей с возрастом увеличивалась абсолютная ММ ЛЖ, для db/db-мышей также отмечено увеличение индексированной на вес ММ ЛЖ. При сравнении индекса относительной толщины стенки ЛЖ отмечалась тенденция к его увеличению у db/db-мышей старшего возраста (p=0,07 по сравнению с 4-месячными). У мышей линии C57bl/6 этот параметр с возрастом не менялся. Существенной возрастной динамики конечно-диастолических размеров и объемов ЛЖ не отмечалось.

Таблица 1. Структурно-функциональные характеристики сердца мышей линий db/db и C57bl/6 различного возраста по данным ЭхоКГ

Примечание. ЛЖ — левый желудочек, ЛП — левое предсердие, ММ — масса миокарда, иММ — индекс массы миокарда, ОТС — индекс относительной толщины стенок, ** — p<0,05, * — p<0,05 по сравнению с мышами db/db 4 мес, # — p<0,05 по сравнению с мышами db/db 6 мес, ## — p<0,05 по сравнению с мышами db/db 8 мес.

При анализе функциональных показателей сердца (см. табл. 1) у мышей линии C57bl/6 в возрасте 12 мес отмечалось незначительное снижение трансмитрального соотношения Е/А, обусловленное возрастным замедлением скоростей пиков Е и А. У мышей db/db существенной динамики трансмитрального соотношения Е/А не наблюдалось. Не было выявлено различий по значениям индекса Tei.

По сравнению с группой Плацебо на фоне введения Инграмона-депо db/db-мышам к возрасту 6 и 8 мес существенной динамики структурно-функциональных показателей сердца по данным ЭхоКГ не обнаружено (табл. 2). Введение препарата не влияло на вес мышей в 6 и 8 мес.

Таблица 2. Структурно-функциональные характеристики сердца мышей db/db на фоне введения Инграмона-депо или Плацебо в возрасте 6 и 8 мес по данным ЭхоКГ

Примечание. ЛЖ — левый желудочек, ЛП — левое предсердие, ММ — масса миокарда, иММ — индекс массы миокарда, ОТС — индекс относительной толщины стенок.

Масса сердца у db/db-мышей с возрастом не менялась (6 мес — 149,5 (134,0;166,0) мг, 8 мес — 142,5 (130,0;152,5) мг, 12 мес — 142,0 (124,7;151,0) мг, p=0,529) и к 12 мес была несколько ниже, чем у мышей C57bl/6 — 160,0 (147,7;194,3) мг, p=0,117). Масса сердца мышей, которым вводили Инграмон-депо, не отличалась от таковой в группе Плацебо (6 мес — 147,0 (138,5;157,5) мг против 149,5 (134,0;166,0) мг соответственно, p=0,793, 8 мес — 145,0 (127,5;160,0) мг против 142,5 (130,0;152,5) мг соответственно, p=0,715).

При морфологическом анализе миокарда ЛЖ мышей db/db обеих групп в возрасте 8 и 12 мес были выявлены патоморфологические признаки диабетической кардиомиопатии. В тканях наблюдался периваскулярный и стромальный отек, множественные очаги коагуляционного некроза, встречались участки волнообразной деформации кардиомиоцитов. Стенки сосудов миокарда были частично гиалинизированы, отмечено пристеночное расположение элементов крови, что может свидетельствовать о риске тромбообразования, в микроциркуляторном русле наблюдался стаз и сладж эритроцитов. На клеточном уровне были видны ярко выраженные признаки дистрофии кардиомиоцитов: вакуольная дистрофия цитоплазмы, глыбчатый распад цитоплазмы клеток, присутствовали ядра, находящиеся на разных стадиях развития некроза — кариопикноза, кариорексиса, кариолизиса. Отмечалась гипертрофия части кардиомиоцитов (рис. 3).

Рис. 3. Патоморфологические изменения в миокарде ЛЖ мышей db/db.

а — сегментарная гиалинизация стенки сосуда и периваскулярный отек; б — волнообразная деформация кардиомиоцитов; в — дегенеративные изменения ядер при некрозе на стадиях кариопикноза (1), кариорексиса (2), кариолизиса (3); г — гипертрофированный кардиомиоцит с гиперхромным ядром и перинуклеарным просветлением (4), вакуольная дистрофия цитоплазмы (5); д — эритростаз и сладж-феномен в венуле; е — элементы крови, адгезировавшие к стенке гиалинизированного сосуда. Здесь и в рис.5,6: ЛЖ — левый желудочек. Окраска гематоксилин-эозином. а, б — увеличение ×400, в—е — увеличение ×630.

Слабо выраженный периваскулярный и стромальный фиброз, соответствующий возрастной норме, присутствовал как у мышей линии db/db, так и у контрольных мышей линии C57bl/6. Сравнение данных количественной оценки морфологических признаков между группами показало различия в некротических изменениях. В группе Инграмон-депо доля некротизированных клеток была достоверно ниже (рис. 4, 5).

Рис. 4. Доля некротизированных клеток на гистологических срезах миокарда мышей db/db из групп Плацебо и Инграмон-депо.

Данные представлены как медиана и межквартильный размах.

Рис. 5. Репрезентативные гистологические срезы миокарда ЛЖ мышей db/db.

а — группа Плацебо; б — группа Инграмон-депо. Стрелками указаны очаги коагуляционного некроза. Окраска гематоксилин-эозином, ув. ×100.

В тканях сердца присутствовали единичные макрофаги, их количество не отличалось в группах Плацебо и Инграмон-депо и составило 5 (3;7) и 4 (2;7) на 1 мм² ЛЖ (рис. 6).

Рис. 6. Макрофаги в миокарде ЛЖ у мышей db/db в возрасте 12 мес.

а — группа Плацебо; б — группа Инграмон-депо. Слева — окраска антителами против F4/80 (красное свечение); по центру — окраска ядер красителем DAPI (синее свечение), справа — наложение каналов. Ув. ×40.

Обсуждение

В настоящей работе нами выполнен анализ динамики веса, структурно-функциональных характеристик миокарда у мышей db/db разного возраста с использованием ультразвукового и морфологического исследования сердца с целью оценки соответствия критериям СНсФВ у человека. В исследуемой модели проведены пилотные исследования оценки эффективности противовоспалительной терапии препаратом «Инграмон-депо».

Мыши db/db характеризовались быстрым развитием ожирения. Анализ динамики веса показал, что мыши db/db уже с 4 мес весили в 2 раза больше, чем мыши линии C57bl/6, и достигали максимального веса к 6-му мес жизни; отмечен более значимый прирост веса у самок db/db. Наблюдаемое статистически незначимое некоторое снижение веса у db/db-мышей к 12-му мес жизни, вероятно, обусловлено ускоренным развитием возрастной кахексии, характерной для этих животных. Введение Инграмона-депо не оказало влияния на динамику веса животных.

По данным ЭхоКГ, у мышей линии C57bl/6 отмечалось возрастное расширение левого предсердия — увеличение передне-заднего размера. Существенных возрастных изменений этого параметра у db/db-мышей не наблюдалось, хотя его медиана в целом была несколько выше уже с раннего возраста. У мышей C57bl/6 с возрастом увеличивались конечно-диастолические размер и объем ЛЖ, отражающие естественное (возрастное) ремоделирование ЛЖ без существенного изменения его сократимости. Отмечено увеличение абсолютной массы миокарда ЛЖ у мышей обеих линий. Изменения трансмитрального диастолического потока у C57bl/6-мышей включали обусловленное возрастным замедлением наполнения ЛЖ снижение соотношения Е/А к 12 мес. У мышей db/db уже с раннего возраста регистрировались более низкие значения (практически в 2 раза) трансмитрального соотношения Е/А (без существенной дальнейшей динамики), что однозначно свидетельствует о замедлении расслабления ЛЖ. Введение противоспалительного препарата «Инграмон-депо» не влияло на структурно-функциональные характеристики миокарда ЛЖ по данным ЭхоКГ.

При взвешивании сердец после эвтаназии животных масса сердца у db/db-мышей не менялась с возрастом и была несколько ниже в 12 мес, чем у C57bl/6-мышей. Инграмон-депо не влиял на массу сердца у db/db. Гистологический анализ сердец позволил выявить картину диабетической кардиомиопатии, о чем свидетельствовали наличие групп гипертрофированных кардиомиоцитов, вакуольная дистрофия цитоплазмы, дегенеративные изменения ядер, гиалинизация сосудов миокарда, сладж эритроцитов в микроциркуляторном русле как один из признаков нарушения регионарной гемодинамики. Несмотря на то что выраженных признаков воспаления и фиброза в миокарде мы не обнаружили у животных обоего пола, полученные данные могут свидетельствовать о начальных стадиях развития СНсФВ на фоне метаболического синдрома. Похожие изменения в миокарде описаны у крыс с сахарным диабетом [13], такие же изменения наблюдаются у пациентов с диабетической кардиомиопатией [14].

Эффективность подходов, направленных на подавление системного воспаления и воспалительных процессов в миокарде для замедления развития фиброза при СНсФВ, является предметом дискуссий. В ранних исследованиях на животных моделях гипертрофии миокарда подавление активности МСР-1 приводило к замедлению развития фибротических изменений в миокарде ЛЖ и улучшению его диастолической функции [15, 16]. Исследования с использованием мышей с метаболическими нарушениями (на высокожировой диете, с генетически обусловленным ожирением и др.) показывают, что перспективные на сегодняшний день препараты для лечения СНсФВ, в частности, глифлозины и агонисты глюкагон-подобного пептида 1, обладают противовоспалительным действием. Так, данные гистологического анализа свидетельствуют об уменьшении степени гипертрофии кардиомиоцитов, снижении воспалительной инфильтрации миокарда и выраженности интерстициального и периваскулярного фиброза на фоне введения животным этих препаратов [17, 18]. В нашем исследовании мы обнаружили, что хроническое введение db/db-мышам Инграмона в депо-форме обладает кардиопротективным действием: доля кардиомиоцитов с признаками повреждения и некроза снижалась. Мы предполагаем, что, подавляя активность МСР-1, Инграмон способствует снижению уровня системного воспаления, которое вызывает дополнительное повреждение кардиомиоцитов. Механизм действия препарата требует дальнейшего изучения. На следующем этапе будет оценен уровень воспалительных цитокинов в крови животных, степень воспалительной инфильтрации жировой ткани и состояние других органов на фоне введения препарата «Инграмон-депо».

Заключение

У мышей db/db и линии C57bl/6 выявлены возраст-ассоциированные структурно-функциональные изменения миокарда, свидетельствующие о развитии диастолической дисфункции левого желудочка. Данные гистологического исследования могут свидетельствовать о начальных стадиях развития СНсФВ у мышей линии db/db на фоне метаболического синдрома. Введение препарата «Инграмон-депо» ассоциировалось с уменьшением выраженности некротических изменений в миокарде.

Участие авторов. Радюхина Н.В. — планирование исследования, гистологическое и иммунофлуоресцентное исследование препаратов миокарда; Филатова А.Ю. — планирование исследования, проведение ультразвукового исследования сердца, статистический анализ данных, написание статьи; Огурцова Е.С. — проведение ультразвукового исследования сердца; Арефьева Т.И. — планирование исследования, руководство исследованием, написание статьи; Сидорова М.В. — планирование исследования, контроль введения препарата Инграмон-депо; Курилина Э.В. — гистологическое и иммунофлуоресцентное исследование препаратов миокарда

Ограничения исследования. Отсутствие данных по концентрации глюкозы в крови у мышей db/db (выбор соответствующей мышиной модели произведен на основании литературных данных).

Финансирование. Работа выполнена в рамках темы государственного задания (регистрационный номер НИР 124013000813-3).

Financing. The study was performed as a part of the State Task from the Ministry of Health of the Russian Federation (research project registration number 124013000813-3).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.