Введение
Перед нами стояла задача: выяснить, может ли сократительная функция сердца при чрезмерных нагрузках «до упора», кроме геномных изменений [1], вызвать сердечную патологию, например, при избыточной физической нагрузке. Широко известны случаи внезапной сердечной смерти у спортсменов [2, 3]. Смерть и тяжелое «финишное» состояние, видимо, требуют дополнительных объяснений. Как нам кажется, базисные болезни не могут являться непосредственной причиной смерти [4]. Кризисом жизни вернее считать прекращение или нехватку подачи энергии для генерации обменных процессов в самых уязвимых клетках организма — кардиомиоцитах или нейроцитах. Это требует при исследовании избыточных физических нагрузок первостепенного анализа структурных изменений органелл энергообеспечения кардиомиоцитов — митохондрий, их биоэнергетической емкости [5]. К сожалению, морфологических исследований этой главной органеллы при физических нагрузках недостаточно, особенно при максимальной затрате энергии.
МТХ — это полифункциональные органеллы всех ядерных клеток. Поддержание митохондриальной функции имеет решающее значение для кардиомиоцитов с высокими требованиями к обеспечению энергией [6]. Составляя около 30% от общего объема клетки, митохондрии производят через окислительное фосфорилирование 6 кг аденозинтрифосфата (АТФ) в сутки для поддержания насосной функции сердца [7]. К настоящему времени детально описаны две самостоятельные мембраны митохондрий [8]. Внешняя подобна обычной билипидной клеточной мембране, внутренняя также билипидная, локально связанная с внешней и обеспечивающая главные метаболические процессы, которая образует глубокие инвагинации — кристы [9—11]. Митохондрии вступают в функционально значимые контакты с большинством других органелл клеток [12—14]. Важную роль в деятельности митохондрий и в случае деструктивных изменений кардиомиоцитов играют протеолитические процессы [15, 16]. Белки при лизисе и деструкции отдают большое количество связанной в норме воды [17—19]. Мы предполагаем, что с помощью интеграции физических свойств белков, пептидов, липидов и воды может быть создана молекулярная модель митохондрии. Проанализированы и структурные последствия накопления при мышечных перегрузках убиквитин- и кальпоин-протеолитических систем в кардиомиоцитах [20, 21]. Электронно-микроскопические исследования могут помочь оценить значимость энергообеспечения кардиомиоцитов при максимальных физических нагрузках.
Цель исследования — выявить морфологические изменения мембран митохондрий кардиомиоцитов животных при однократной избыточной (максимальной) физической нагрузке до мышечного отказа.
Материал и методы
Эксперименты проводились на 24 беспородных половозрелых собаках-самцах от 1,5 до 3 лет. Работа проведена в полном соответствии с этическими принципами Совета Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) 1986 г., решением об использовании лабораторных животных №26/12 от 26 декабря 2019 г., а также рекомендациями этического комитета Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, протокол №18/05 от 18 мая 2021 г. на разрешение публикации данного исследования.
Животных содержали в стационарных условиях вивария 14 дней, где они проходили карантин, осмотр ветеринара и соответствующую вакцинацию. Все собаки были здоровы. Их масса составляла в среднем 14,2±0,9 кг. Статистическую обработку результатов выполняли с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel 2003. Вычисляли среднее арифметическое, ошибку среднего арифметического, определяли достоверность различия (p). Средняя частота сердечных сокращений (ЧСС) в естественных условиях до эксперимента составляла 103,8±23,6 уд/мин. После эксперимента средняя ЧСС — 174,5±36,8 уд/мин (p<0,02) (рис. 1, а). ЧСС и концентрация лактата необходимы для представлений экспериментаторов о физиологическом состоянии животного. С целью оценки уровня работоспособности организма регистрировалась продолжительность бега животных. Для биохимических анализов брали кровь (рис. 1, б) из латеральной подкожной вены голени собаки натощак и определяли содержание лактата энзимотическим методом [22]. Средняя концентрация лактата в крови — 6,2±4,01 мг %, после забега — 6,8±3,87 мг % (p<0,4).
Рис. 1. Статистика функционального состояния животных.
а — частота сердечных сокращений на оси абсцисс; синий — до забега и оранжевый — после забега (уд/мин); б — концентрация лактата; синий — перед забегом и оранжевый — после забега, на оси абсцисс (мг %); на оси ординат — номер животного.
Сопоставимые данные можно получить в забеге «до отказа», как в нашем эксперименте. Необходимо отметить значительную вариабельность регистрируемых параметров у отдельных животных (см. рис. 1), что свидетельствует о различном исходном состоянии адаптационно-функционального резерва экспериментальных животных. Поэтому анализ функциональных параметров проводился таким образом, что за 100% принималось функциональное фоновое значение показателя, а все последующие изменения рассчитывались в процентах от этого фона. Однократная предельная двигательная нагрузка вызывает резкое усиление инотропной и хронотропной функций сердца. Степень прироста частоты колебаний в пределах от 28 до 183% относительно фоновых значений. Аритмия не отмечалась. Заметно участие вспомогательных мышц: пасть раскрыта, язык синюшен. Концентрация молочной кислоты после физической нагрузки увеличивалась у всех в 3,5 раза, кроме 2 собак, и колебалась неравномерно.
1-я группа (12 собак) вначале использовалась как контрольная, а затем получала однократную избыточную двигательную нагрузку — бег на тредмиле со скоростью 15 км/ч до предела сил по K. Arakawa. Нарастание частоты сердцебиений превосходит динамику дыхательных экскурсий. Растет кислородный долг. В дыхании принимают участие вспомогательные мышцы. Бег становится неустойчивым. Животные пытаются тормозить ленту тредмила, отказываясь выполнять нагрузку. Сразу после забега и окончания физиологических исследований одной собаки (примерно 7 мин) она выводилась из эксперимента с соблюдением правил гуманного обращения с животными. Сердце выделяли у собаки под внутривенным наркозом (30 мг/кг барбитурата натрия) и при управляемом дыхании.
Образцы ткани сразу же подвергали глутар-осмиевой фиксации при температуре 4 °C, которая сочетает преимущества обоих фиксаторов [23]. Использовали 2,5% раствор глутарового альдегида (glutaraldehyde, Acros Organics, США), приготовленного на 0,1 М какодилатном буфере, pH 7,4 и 1% раствор OsO4 (Osmium tetroxide, Sigma-Aldrich, Германия). Материал ориентировали и заключали в эпон. Миокард идентифицировали на серийных полутонких срезах, приготовленных на ультрамикротоме UC7 Leica Microsystems (Австрия), окрашенных крезиловым фиолетовым и основным фуксином. Ультратонкие срезы контрастировали 4% водным раствором уранилацетата, 0,4% цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI, Нидерланды) с видеокамерой Mega View III. Хотя электронная микроскопия не является строго гистохимическим методом, общеизвестно, что она служит четким маркером, в основном липидных мембран, а также мембранных и других белков и полипротеинов.
Результаты
Структурная гетерогенность митохондрий кардиомиоцитов в контроле. На препаратах кардиомиоцитов правого предсердия одиночные МТХ в контроле обычно имеют удлиненную, эллипсовидную форму, продольно ориентированы между пучками и окружены светлой цитоплазмой. Имеются и одиночные шаровидные МТХ малого размера. Это, видимо, поперечные срезы тех же органелл. В норме встречаются и одиночные митохондрии с деформированными кристами. Мембраны митохондрий часто плохо дифференцируются и выглядят как широкие, расплывчатые, нечеткие контуры в отличие от мембран нервных волокон этих же препаратов (рис. 2).
Рис. 2. Особенности мембран и продольная ориентация субсарколеммальных митохондрий в сократительном кардиомиоците.
1 — митохондрии; 2 — миофибриллы; 3 — сарколемма; 4 — пучок безмиелиновых нервных волокон; 5 — нейролемма; 6 — наружная мембрана митохондрии. Ув. а — 25 000; б, в — 50 000.
У основания крист особенно велико скопление белковых молекул, которые делают контуры этого участка внутренней мембраны размытыми. Иногда прослеживаются агрегаты между наружной и внутренней мембраной. Постепенно образуется «крыша» кристы (рис. 2, а), которая, видимо, имеет важное функциональное значение, так как перекрывает ее полость. Можно предположить, что это лишь временное восстановление фрагмента внутренней мембраны, признак какого-то функционального процесса кристы. Область у основания открытой кристы оказывается самой неустойчивой структурой (locus minoris resistencia) (рис. 3, в, д—ж). Именно здесь впервые удается наблюдать формирование мембранных полусферических петель варикозностей (см. рис. 3, в), которые отделяются от внутренней мембраны. При локальном сближении и точечном слиянии внутренних поверхностей мембран крист в нескольких соседних участках образуется цепочка варикозностей (см. рис. 3, ж). Это приводит к неотмеченному ранее временному точечному соединению гидрофильных слоев противоположных мембран кристы, как это бывает при образовании щелевых или плотных межклеточных контактов (см. рис. 3, в, е). Варикозная деформация предполагает не только локальное слияние двух билипидных слоев, но и перераспределение белкового матрикса внутри кристы. Альтерация белок-липидных взаимоотношений при нормальном функционировании миоцитов, видимо, свидетельствует о каких-то морфо-физиологических процессах, включая синтез белка аденозинтрифосфотазы.
Рис. 3. Морфологическая кинетика мембран и межмембранного пространства крист.
а — открытая полость кристы; б, д — «крыша», перекрывающая ее полость; в, е — отделение крист от внутренней мембраны; г — локальное слияние мембран крист после физической нагрузки; ж — варикозная деформация крист; 1 — булавовидные терминали крист; 2 — варикозности кристы; 3 — локальное слияние противоположных мембран кристы; 4, 5 — закрытая и открытая полости крист; 6 — наружная мембрана митохондрии; 7 — сужение матрикса между наружной и внутренней мембранами кристы. Ув. 55 000.
Структурные изменения кардиомиоцитов после избыточной физической нагрузки. На электронно-микроскопических снимках правого предсердия после предварительного бега у собак, прежде всего, выявляется деструкция (протеолиз) саркомеров, с нарушением четкой геометрической картины дисков и массивное обводнение структур кардиомиоцитов.
Как известно, в связи с денатурацией протеинов выделяется масса свободной воды. Возникает резко выраженное разрыхление и расщепление мышечных пучков. Саркоплазма сильно обводнена (рис. 4), частично превратилась в бульон протеиновых компонентов, которые обладают свойствами поверхностно-активных веществ, существенно влияющих на структуру и функцию клеток, плотное контактирование мембран и фрагментацию крист при избыточной физической нагрузке.
Рис. 4. Резкое обводнение саркоплазмы, протеолиз и расщепление пучков миофибрилл под влиянием предельной физической нагрузки.
1 — жидкая фракция саркоплазмы; 2 — расщепленные пучки миофибрилл и нарушение кристаллической упорядоченности миозиновых и актиновых белков; 3 — блэб митохондрии с отработанным матриксом; 4 — лизосомы; 5 — наружная мембрана кардиомиоцита; 6 — Ув. 16 000.
Под влиянием поверхностного натяжения обводненного матрикса МТХ кардиомиоцитов меняют свою форму с эллипсоидной на шаровидную (рис. 5). После забега сферических митохондрий в препаратах становится на 20% больше, чем эллипсоидных в норме, а в некоторых участках они составляют почти 100%.
Рис. 5. Изменение митохондрий после предельной физической нагрузки животного.
а — сферическая деформация митохондрий; б — слияние мембранных стенок крист и демаскирование их материалом лизированного матрикса. 1 — наружная мембрана митохондрий после протеолиза; 2 — контакт мембранных стенок крист; 3 — сферическая деформация митохондрий и их заполнение разрушенным матриксом; 4 — адгезия органелл агрегатами лизированного матрикса. Ув. а — 40 000; б — 55 000.
Большинство МТХ окружены жидкой фазой саркоплазмы и группируются в агрегаты, иногда очень крупные. Появляются блэбы МТХ с отработанным матриксом, который приобретает темный цвет и маскирует кристы. Процесс деградации миофибрилл происходит одновременно с депротеинизацией МТХ. Отмечается появление лизосом (см. рис. 4). У отдельных органелл в связи с протеолизом теперь хорошо различимы обе МТХ-мембраны (рис. 5, б). Вполне естественно, что протеолиз охватывает и белковые молекулы кристы. Разрушение этих протеинов приводит к постепенному тотальному сближению наружных гидрофильных слоев билипидных мембран крист и их слиянию, напоминающему щелевые и плотные контакты (gap junction, tight junction) наружных клеточных мембран. Возможно, это важный момент в работе МТХ, так как липидные слои при разрушении специфических белков нормальных крист и матрицы МТХ наверняка не могут выполнять функцию энергообеспечения, синтеза АТФ. В этом, вероятно, состоит основная причина «инвалидизации» кардиомиоцитов.
Обсуждение
Электронно-микроскопические исследования МТХ в норме и после избыточной физической нагрузки выявляют обширные структурные преобразования митохондрий кардиомиоцитов. Так как для МТХ характерна полифункциональность, их структурные компоненты должны обладать даже в норме значительным разнообразием. Поэтому, возможно, описанные в работе не отмеченные ранее морфо-физиологические видоизменения крист МТХ в норме отражают кинетику взаимосвязанных физиологических процессов.
Как известно, запасов АТФ в организме практически нет [24]. Реакции АТФ осуществляются цепочкой из 5 белковых респираторных суперкомплексов в стенках крист и матриксе между ними. Эта цепь респирасом − ангстремный транспортный путь протонов [25]. Естественно предположить, что даже столь малые геометрические модификации взаиморасположения молекул липидов и белков, в кристах не могут не сказаться на активности синтетических процессов. Мы же, кроме точечных и локальных слияний билипидных слоев крист с вытеснением белков между ними, обнаружили также отделение крист от внутренней мембраны МТХ с появлением объемных изменений матрикса органеллы. Структурные изменения МТХ кардиомиоцитов, перенесших резкое увеличение активности при избыточной физической нагрузке, можно считать сходными с патологическими. Большое количество МТХ оказывается либо полностью лишенными внутренней мембранной организации, либо имеющими признаки резко измененных мембран, лишившихся специфических белков, участвующих в энергообеспечении кардиомиоцитов. Выявлены критические нарушения белково-липидных взаимоотношений, таких как внутри крист с тотальным слиянием их стенок, подобных традиционным физиологически значимым мембранным контактам (см. рис. 3) и даже изменение формы митохондрий на шаровидную. В основе описанных процессов, видимо, лежит выраженный протеолиз миофибрилл с накоплением свободной воды и значительной депротеинизацией мембран МТХ — органелл энергообеспечения кардиомиоцитов. Это фактически переходящее к собственной патологии состояние кардиомиоцитов (парабиоз, паранекроз). Оно не требует срочного и полного прекращения физической активности, но нуждается, по Н.Е. Введенскому [26], в обеспечении некоторой восстановительной двигательной активности и последующем пополнении запасов энергии.
Заключение
Результаты экспериментов демонстрируют, что диапазон морфологических изменений при мышечном отказе у собак, видимо, заключается в зависимом от протеолиза обводнении кардиомиоцитов, нарушении белково-липидного взаимоотношения в кристах с их отделением от периферической мембраны и плотными контактами депротеинизированных липидных мембран кристы митохондрии.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.